基于11.7 T磁共振探索超短波对轻度创伤性脑损伤大鼠脑灰质体积的影响

Effects of ultra short wave therapy on gray matter volume in rat models of mild traumatic brain injury using 11.7 T MRI

摘要

背景 轻度创伤性脑损伤(mild traumatic brain injury，mTBI)每年影响约4 200万人，已成为重大公共卫生负担。11.7 T超高场强磁共振技术为mTBI微结构动态追踪及修复机制解析提供了新策略。 目的 基于11.7 T超高场强磁共振成像技术，探究超短波(ultrashort wave，USW)干预对mTBI大鼠脑灰质体积(gray matter volume，GMV)动态变化及神经行为功能的影响。 方法 将45只雄性SD大鼠随机分为单纯损伤组(mTBI组)、超短波干预组(USW组)和对照组，每组各15只。通过单次冲击波建立mTBI模型，USW组接受超短波干预，对照组不进行损伤和干预。分别于造模后3 ~ 5 d (急性期)、2周(亚急性期)及1个月(慢性期)时行11.7 T磁共振T2加权像扫描，运用基于体素形态学测量(voxel-based morphometry，VBM)分析全脑GMV差异，同步进行旷场实验(open field test，OFT)和高架十字迷宫实验(elevated plus maze，EPM)评估大鼠的运动能力和焦虑样行为。 结果 mTBI组在伤后3 ~ 5 d、2周和1个月时，GMV降低的差异团块数量分别为11、5和4个(P＜0.05)，均低于对照组，主要涉及前边缘系统、纹状体及顶叶联络皮质等脑区；USW干预可改善GMV萎缩，干预后各时间点mTBI组/USW组差异脑区中分别有4/6、3/4、2/3个团块GMV恢复(P＜0.05)；组内分析显示，mTBI组GMV在1个月内随时间逐渐恢复，而USW组GMV在2周时即达相对稳定水平。mTBI组3 ~ 5 d时运动能力下降(较对照组慢速运动时间比例增加，P＜0.01)，伴随持续性焦虑样行为(较对照组开放臂区域活动降低，P＜0.05)；USW组在2周时运动功能及焦虑样反应均增强(总路程及开放臂区域活动增加，P＜0.05)，且1个月时焦虑指标与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)，但mTBI组仍可见持续焦虑样行为(开放臂次数比例下降，P＜0.05)。相关性分析发现，右侧前边缘系统(r=-0.631)及纹状体(r=-0.645) GMV减少与mTBI组慢速运动时间比例增加相关，左顶叶联络皮质GMV下降(r=0.727)与开放臂时间比例减少相关(P＜0.05)。 结论 基于11.7 T磁共振数据进行VBM分析可敏感捕捉mTBI后灰质体积的动态演变。超短波可促进GMV恢复，并改善mTBI急性期运动障碍及慢性焦虑样行为，为临床mTBI精准康复提供了影像学与行为学双重证据。

Abstract

Background Mild traumatic brain injury (mTBI) affects approximately 42 million individuals annually, constituting a major global public health challenge. The 11.7T ultrahigh-field magnetic resonance imaging (MRI) offers novel strategies for tracking microstructural dynamics and elucidating repair mechanisms in mTBI. Objective To investigate the effects of ultrashort wave (USW) intervention on dynamic gray matter volume (GMV) changes and neurobehavioral functions in mTBI rats using 11.7T MRI. Methods Forty-five male Sprague-Dawley rats were randomly divided into mTBI group (single blast wave-induced mTBI model), USW group (mTBI with USW intervention), and control (Ctrl) group (no injury or intervention), with 15 rats in each group. Longitudinal 11.7T MRI T2-weighted imaging was performed during acute (3-5 days), subacute (2 weeks), and chronic (1 month) phases. Voxel-based morphometry (VBM) was applied to analyze whole-brain GMV alterations, while open field test (OFT) and elevated plus maze (EPM) were synchronously conducted to quantify locomotor activity and anxiety-like behaviors. Results Compared to the Ctrl group, the mTBI group exhibited significantly reduced GMV in 11, 5, and 4 clusters at 3-5 days, 2 weeks, and 1 month, respectively (P＜0.05), predominantly involving the prelimbic system, striatum, and parietal associative cortex. USW intervention markedly attenuated GMV atrophy, with 4/6, 3/4, and 2/3 clusters showing GMV recovery at the corresponding time points (P＜0.05). Longitudinal analysis revealed gradual GMV recovery in the mTBI group over 1 month, whereas the USW group achieved stable GMV levels by 2 weeks. The mTBI group displayed acute locomotor deficits (increased % slow movement time vs Ctrl, P＜0.01) and persistent anxiety-like behaviors (reduced open-arm activity vs Ctrl, P＜0.05). In contrast, the USW group showed significant improvements in locomotor function and anxiety-like responses by 2 weeks (increased total distance and open-arm activity, P＜0.05), with anxiety indices normalizing to Ctrl levels at 1 month (P＞0.05), while the mTBI group retained chronic anxiety (reduced open-arm entries, P＜0.05). Correlation analysis identified significant associations between GMV reductions in the right prelimbic system (r=-0.631) and striatum (r=-0.645) with increased % slow-motion time, and between left parietal associative cortex GMV loss (r=0.727) and reduced open-arm time (P＜0.05). Conclusion VBM analysis based on 11.7T MRI sensitively captures dynamic GMV evolution post-mTBI. USW intervention promotes GMV restoration, mitigates acute motor deficits, and alleviates chronic anxiety-like behaviors, thus providing dual imaging and behavioral evidence to support precision rehabilitation strategies for mTBI.

Graphical abstract

关键词

创伤性脑损伤 / 超高场强磁共振 / 基于体素的形态学测量 / 超短波 / 行为学评估 / 大鼠

Key words

mild traumatic brain injury / ultra-high field magnetic resonance imaging / voxel-based morphometry / ultrashort wave / behavioral assessment / rat

轻度创伤性脑损伤(mild traumatic brain injury，mTBI)每年影响约4 200万人，占所有脑损伤的80% ~ 90%，已成为一个严重的公共卫生问题^[1]。尽管被归类为“轻度”，但20% ~ 30%的mTBI患者在伤后6个月仍存在头痛、认知障碍等症状，且与痴呆、帕金森病等神经精神疾病风险显著相关^[2]。mTBI的病理机制复杂，早期因机械外力导致轴突损伤和代谢紊乱，随后引发神经炎症、氧化应激等次生损伤，远期可能导致脑白质微结构异常及神经退行性变^[3]。目前mTBI的临床诊断依赖格拉斯哥昏迷评分(13 ~ 15分)、短暂意识丧失等主观指标，常规CT/MRI难以检测细微损伤，且症状(如头晕、记忆减退)缺乏特异性，易受患者心理状态等因素干扰^[4]，有待探索更敏感的诊断方式。超高场强(≥7 T)磁共振技术凭借其显著提高的空间分辨率和信噪比，已被广泛应用于神经影像学研究。11.7 T超高场磁共振成像技术更可精确地解析脑微结构病变，是目前可及的较为先进的实验技术。基于体素的形态学测量(voxel-based morphometry，VBM)是一种基于高分辨率三维结构像来计算灰质体积(gray matter volume，GMV)的分析方法，可精准量化大脑形态学改变^[5]。目前mTBI的治疗手段存在显著局限——药物因血脑屏障穿透率低、靶点单一而疗效不足^[6]；物理疗法(如高压氧)虽能改善脑血流，但缺乏促进神经修复的分子证据^[7]。超短波(ultrashort wave，USW)疗法在中枢神经系统损伤中可调控神经炎症、促进损伤修复^[8]。但其在mTBI中的作用尚不明确。本研究建立mTBI大鼠模型，将超短波干预与11.7 T超高场强磁共振技术结合，分析3 ~ 5 d (急性期)、2周(亚急性期)及1个月(慢性期)时的GMV动态变化及行为学损害情况，并探索超短波干预对GMV的调控作用及行为学改善情况。通过关联分析寻找其促进神经功能康复的潜在靶点，为开发基于影像标志物的精准康复策略提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组与数据采集设计

本研究所有动物实验均经中国人民解放军军事医学研究院实验动物管理与使用委员会批准(批准号：IACUC-DWZX-2021-759)。实验选用45只2 ~ 3月龄(体质量250 ~ 350 g) SPF级健康雄性SD大鼠，均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。所有大鼠于军事医学研究院SPF级屏障环境中分笼饲养，环境温度20 ~ 25℃，相对湿度50% ~ 60%，光照周期为12 h光照/12 h黑暗，自由摄食饮水，每周更换垫料2次。采用完全随机分组设计，通过随机数字表法将大鼠分为以下3组(每组15只)：mTBI组，仅建立mTBI模型，不接受其他干预；USW组，仿mTBI组建模，改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score，mNSS)评估后接受超短波干预；对照组，仅接受相同的麻醉与固定操作，不进行损伤(建模)和干预。以成功建模后为实验起点，分别在实验的3 ~ 5 d、2周和1个月时进行11.7 T磁共振数据采集及行为学评估。

1.2 mTBI大鼠模型建立与评估

采用陆军特色医学中心野战外科研究所的BST-I型生物激波管装置，根据既往研究及既往mTBI模型建立经验设置驱动压力5.0 MPa (超压峰值为328.04 kPa)，夹膜厚度4.0 mm + 4.0 mm，单次冲击波建模^[9]。实验动物使用2.5%三溴乙醇，按照1.2 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉后俯卧位水平放置于激波管内，左侧面对入射波。冲击波建模后采用mNSS评估大鼠的脑损伤程度。mNSS包括运动、感觉、平衡和反射4个方面，总分0 ~ 18分，1 ~ 6分定性为轻度损伤^[10]。该方法建立的mTBI大鼠模型mNSS通常稳定在1 ~ 6分，损伤程度判定为轻度^[9]。

1.3 超短波干预

在既往相关研究中，超短波干预疗法通常采用频率27.12 MHz、无热量档、1次/d、每次7 ~ 10 min、连续治疗1周的干预策略，并显示出良好的安全性和有效性^[8,11]。为了在致伤后尽早捕捉mTBI大鼠急性期的影像学表现，同时兼顾超短波干预的早期有效性，本研究结合先前预实验情况，设计超短波干预方案如下：将清醒状态大鼠固定于大鼠固定器(深圳华阳，型号：18-7214)中，限制其头部活动，对USW组大鼠采用超短波治疗仪(汕头达佳，DL-CII)进行干预。使用前开机预热10 min。将两电极平行对置于大鼠头部两侧，距头皮约2 cm，选择无热量1档，频率为27.12 MHz。USW组大鼠于建模后开始治疗，1次/d，每次10 min，第1次数据采集前连续干预3次，第2次和第3次数据采集前均连续干预7次。对照组及mTBI组大鼠以同样的条件置于超短波治疗仪两电极间，但不开机。

1.4 11.7 T磁共振数据采集与数据预处理

所有扫描均在中国科学院生物物理研究所11.7 T动物临床前磁共振成像仪(Bruker 11.7 T BioSpec，德国，配备四通道容积发射线圈和2 × 2表面阵列接收线圈)进行。将大鼠放入5%异氟烷氧气麻醉诱导盒中进行麻醉诱导，诱导成功后将大鼠从诱导盒取出，快速将大鼠头部放置于麻醉面罩里固定。在磁共振扫描期间通过2%异氟烷氧气维持麻醉。扫描过程中持续监测呼吸和心率。T2加权成像采用快速自旋回波序列，参数：TR/TE=3 500/30 ms，回波链长度=8，视野35 mm × 35 mm，矩阵256×256，体素分辨率0.137 mm × 0.137 mm × 0.8 mm，层厚0.8 mm，非连续切片(间隙0.3 mm)。排除有图像伪影的大鼠数据，最终纳入的VBM分析的数量为对照组7例，mTBI组11例，USW组11例。用医学图像转换工具dcm2niix将原始DICOM格式的结构像数据转化成NIFTI格式的文件。将所有图像进行体素10倍放大。在MATLAB平台通过SPM12 + CAT12工具箱对T2结构像进行空间分割和空间标准化，获取灰质体积图。采用半高全宽(FWHM)为8 mm的各向同性高斯核对灰质体积图进行图像平滑。

1.5 行为学评估

旷场实验(open field test，OFT)：用于评估大鼠活动能力和焦虑样行为^[12]。将100 cm × 100 cm × 40 cm的黑色敞箱按4 × 4平均划分成16宫格，中心4块区域设置为“中心区域”，其余为“外周区域”。将大鼠由中心区域放入5 min，应用VisuTrack软件(上海欣软)记录大鼠活动。评估的指标包括总路程(cm)、不动时间(%)、慢速运动时间(%)、快速运动时间(%)以及在中心区域的区域路程(cm)、区域时间(s)和进入次数。不动时间指活动速度＜0.5 cm/s的时间；慢速运动时间指活动速度为0.5 ~ 5 cm/s的时间；快速运动时间指速度＞15 cm/s的时间。

高架十字迷宫实验(elevated plus maze，EPM)：用于评估大鼠焦虑样行为^[13]。实验装置由4个臂组成，臂长50 cm、宽10 cm，呈十字形交叉，每臂均与中心区域相通。其中两个相对的臂是封闭的，高30 cm，称为“闭合臂”，另两个臂称为“开放臂”。装置离地高度50 cm。将大鼠放置于中心区域，允许其自由探索5 min，并应用VisuTrack软件记录大鼠活动。评估指标包括总路程(cm)、进臂总次数、在开放臂中的区域路程(cm)、区域时间(s)、进入次数、开放臂次数比例(%)和开放臂时间比例(%)。大鼠在开放臂活动减少提示焦虑样行为。

1.6 统计学分析

采用MATLAB + SPM12软件对预处理后的数据进行全脑VBM分析，基于SIGMA图谱进行差异脑区汇报^[14]，并用MRIcrooGL软件进行结果可视化。参考Ashburner和Friston^[15]提出的VBM分析指南，对3组分别在3个时间点的数据进行单因素方差分析，阈值设置为voxel P＜0.01，cluster size＞100，采用FWE方法进行多重比较校正。在voxel P＜0.001、cluster P＜0.05、FWE校正的情况下分别对3组进行3个时间点的单因素方差分析。将差异脑区的值提取出来，组间采用独立样本t检验、组内采用配对样本t检验进行两两比较明确变化方向。行为学数据采用SPSS 26.0软件进行统计分析。数据服从正态分布时，采用单因素方差分析比较3组之间的均值差异，数据以x±s表示。若方差齐，使用Bonferroni检验进行事后比较；若方差不齐，采用Welch检验比较组间的均值差异，并使用Games-Howell检验进行事后比较。若数据不服从正态分布，采用Kruskal-Wallis H检验比较3组间的中位数差异，数据以M(IQR)表示，并进行Dunn事后比较。另将VBM分析中提取出的差异团块GMV值与行为学指标进行关联分析。数据服从正态分布时采用Pearson相关，否则采用Spearman相关。统计绘图在GraphPad Prism 9.5中完成。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VBM组间分析

(1) 3～5 d时。整体分析：发现14个差异团块，峰值点脑区分别位于左侧基底前脑区、右侧中脑导水管周围灰质、左侧内嗅皮质、右侧前边缘系统、右侧纹状体、左侧胼胝体和相关皮质下白质、右外侧次级视觉皮质、左侧海马CA3区、右侧嗅球小球层、左侧初级躯体感觉皮质异颗粒区、左外侧顶叶联络皮质、右侧次级运动皮质、左侧初级运动皮质和左侧中外侧次级视觉皮质。事后分析：发现mTBI组与对照组有11个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，其中有10个为mTBI组＜对照组；mTBI组与USW组有6个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，其中有4个为mTBI组＜USW组(表1，图1，图2)。

(2) 2周时。整体分析：发现8个差异团块，峰值点脑区分别位于右侧纹状体、右侧海马CA3区、左侧海马齿状回、右侧无颗粒岛叶皮质、右侧初级躯体感觉桶状皮质、左侧次级听觉皮质背侧部、左侧前边缘系统和右侧初级运动皮质。事后分析：发现mTBI与对照组有5个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，其中有4个为mTBI组＜对照组；mTBI组与USW组有4个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，其中有3个为mTBI组＜USW组(表2，图3，图4)。

(3) 1个月时。整体分析：发现6个差异团块，峰值点脑区分别位于右侧内嗅皮质、左侧纹状体、左外侧内嗅皮质、左侧纹状体、右侧下行离皮质通路与苍白球和右侧无颗粒岛叶皮质。事后分析：发现mTBI组与对照组有4个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，且均为mTBI组＜对照组；mTBI组与USW组有3个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，其中有2个为mTBI组＜USW组(表3，图5，图6)。

2.2 VBM组内分析

(1) 对照组：组内分析发现1个差异团块，峰值点脑区位于左侧纹状体。事后分析发现1个月时GMV高于3 ~ 5 d和2周时(P＜0.05)(表4，图7，图8)。

(2) mTBI组：组内分析发现5个差异团块，峰值点脑区分别为右侧下丘脑、左侧下托、左侧纹状体、左侧前边缘系统和右侧纹状体。事后分析发现2周时与3 ~ 5 d时有4个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，且均为2周时＞3 ~ 5 d时；1个月时与2周时有4个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，且均为1个月时＞2周时(表5，图9，图10)。

(3) USW组：组内分析发现5个差异团块，峰值点脑区分别为左侧内嗅皮质、右侧基底前脑区、右侧纹状体、左侧初级视觉皮质双眼区和左侧海马CA3区。事后分析发现2周时与3 ~ 5 d时有5个差异团块的GMV值存在统计学差异(P＜0.05)，其中有4个为2周时＞3 ~ 5 d时；1个月时与2周时各差异团块的GMV值均无统计学差异(P＞0.05) (表6，图11，图12)。