度洛西汀通过诱导G0/G1期细胞周期阻滞抑制神经胶质瘤生长的机制研究

Mechanism of duloxetine inhibiting glioma growth by inducing G0/G1 phase cell cycle arrest

摘要

背景 已有研究发现度洛西汀(duloxetine，DUL)对肺癌及胰腺癌细胞具有细胞毒性作用，但其对胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)的作用及潜在机制尚不明确。 目的 研究度洛西汀对GBM的抗肿瘤作用及潜在机制。 方法 采用不同浓度度洛西汀(10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L)分别处理人胶质母细胞瘤细胞系U87和U251，设置空白对照组和300 μmol/L替莫唑胺(temozolomide，TMZ)处理组作为对照。通过CCK-8和Transwell实验评估度洛西汀对GBM细胞增殖、迁移和侵袭的影响；流式细胞术检测细胞周期分布；结合转录组测序分析潜在机制；通过qPCR和Western blot实验检测S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)、p21和p27的mRNA和蛋白表达水平；使用Autodock Vina分子对接软件模拟度洛西汀与Skp2蛋白的结合能力。 结果 度洛西汀抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05)。在U87细胞中，10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L度洛西汀处理组的活性抑制率分别18.06%±3.91%、47.37%±1.42%和64.85%±0.90%(均P＜0.001)，相比对照组提高了G0/G1期细胞比例(64.76%±1.2%、72.18%±1.22%、79.03%±2.25% vs 55.72%±0.91%，均P＜0.001)。转录组测序及验证实验表明，度洛西汀可下调Skp2的mRNA和蛋白表达，同时上调p21和p27的mRNA和蛋白表达(P＜0.05)。分子对接结果显示度洛西汀与Skp2有较高的结合亲和力(-30.96 kJ/mol)。 结论 度洛西汀能够抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过调控Skp2-p21/p27信号通路诱导G0/G1期阻滞，为GBM的治疗提供了新的研究思路。

Abstract

Background Previous studies have shown that duloxetine (DUL) exhibits cytotoxicity in lung and pancreatic cancer cells, but its effects and mechanisms in glioblastoma (GBM) remain unclear. Objective To investigate the anti-tumor effects of duloxetine on GBM and its potential mechanisms. Methods Human glioblastoma cell lines U87 and U251 were treated with duloxetine at different concentrations (10 μmol/L, 20 μmol/L, 30 μmol/L), with a blank control group and a 300 μmol/L temozolomide (TMZ) treatment group established as controls. CCK-8 and Transwell assays were used to evaluate the effects of duloxetine on cell proliferation, migration, and invasion. Flow cytometry was used to analyze changes in the cell cycle. Potential mechanisms were explored by transcriptome sequencing. The expression of S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2), p21, and p27 at both mRNA and protein levels was measured using qPCR and Western blotting. Molecular docking was performed using Autodock Vina to simulate the binding affinity between duloxetine and the Skp2 protein. Results Duloxetine significantly inhibited GBM cell proliferation, migration, and invasion (P < 0.05). In U87 cells, the inhibition rates at 10, 20, and 30 μmol/L of duloxetine were 18.06%±3.91%, 47.37%±1.42%, and 64.85%±0.90%, respectively (P < 0.001). Compared with the control group, duloxetine treatment markedly increased the proportion of U87 cells in the G0/G1 phase (64.76%±1.2%, 72.18%±1.22%, and 79.03%±2.25% vs 55.72% ± 0.91%, P < 0.001). RNA-seq and validation experiments demonstrated that duloxetine downregulated Skp2 mRNA and protein expression while upregulating p21 and p27 mRNA and protein levels (P < 0.05). Molecular docking revealed that duloxetine exhibited high binding affinity with Skp2 (-30.96 kJ/mol). Conclusion Duloxetine inhibits GBM cell proliferation, migration, and invasion, and induces G0/G1 cell cycle arrest by regulating the Skp2-p21/p27 signaling pathway, providing a new perspective for GBM treatment.

Graphical abstract

关键词

度洛西汀 / 胶质母细胞瘤 / 细胞增殖 / 细胞周期 / S期蛋白激酶相关蛋白

Key words

duloxetine / glioblastoma / cell proliferation / cell cycle / S-phase kinase-associated protein

脑胶质瘤是起源于神经胶质细胞的中枢神经系统肿瘤，是最常见的原发恶性脑肿瘤之一，在WHO分级中，胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)为最高级别(Ⅳ级)肿瘤，也是最常见和最具侵袭性的胶质瘤类型，占所有原发性恶性脑肿瘤的49%^[1]。GBM病程进展迅速，预后差，尽管采用手术、放疗、化疗、靶向治疗等综合治疗措施，患者的生存期仍低于2年^[2]。因此，迫切需要开发针对GBM的新治疗策略，以改善患者的预后。

抑郁症是胶质瘤常见并发症之一^[3]。研究表明，胶质瘤患者的抑郁症发病率是无肿瘤患者的5倍^[4]。抑郁症通过影响免疫反应、慢性应激和内分泌系统等多种生物学途径，显著影响肿瘤的发生和发展^[5]。一项回顾性研究显示，三环类抗抑郁药的使用与胶质瘤风险呈负相关^[6]，氟西汀、舍曲林和艾司西酞普兰等抗抑郁药也已被发现具有抗肿瘤作用^[7-9]。度洛西汀作为选择性5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂，临床上广泛用于治疗抑郁症及慢性疼痛相关疾病^[10]。已有研究表明，度洛西汀对肺癌和胰腺癌具有抗肿瘤作用^[11-12]，但其对GBM的抗肿瘤作用及其潜在机制尚未得到研究。本研究通过对人GBM细胞系U87和U251的体外实验，探讨度洛西汀的抗肿瘤效果及其分子机制，为度洛西汀在GBM治疗中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Multiskan型全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；Attune Nxt型流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；CFX96型实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；Mini-PROTEAN型垂直电泳设备电泳仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 主要药品与试剂

盐酸度洛西汀(批号HY-B0161A，纯度99.91%)购自美国MedChemExpress公司；替莫唑胺(temozolomide，TMZ；货号HY-17364，纯度99.96%)购自美国MedChemExpress公司；DMEM培养基(货号C11995500BT)购自美国Gibco公司；胎牛血清(货号164210-50)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；CCK-8试剂盒(货号C0038)购自上海碧云天生物科技有限公司；细胞周期检测试剂盒(货号CCS012)购自杭州联科生物技术股份有限公司；Skp2、p21、p27和β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(货号分别为2652T、2947T、3686T和7074S)购自美国CST公司；逆转录试剂盒和定量PCR检测试剂盒(货号分别为R423和Q711)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 细胞系与细胞培养

人GBM细胞系U87和U251由中国医学科学院协和药物研究赠予。将U87和U251细胞分别接种于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基(以下称“完全培养基”)，在37℃、5% CO₂的湿润恒温培养箱中培养。实验使用对数生长期的细胞。

1.4 <bold>CCK-8</bold>实验检测细胞活力

将U87与U251细胞(3×10³/孔)接种于96孔板，每孔加入200 μL不同浓度的度洛西汀(0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μmol/L)或TMZ(10、50、100、200、300、400、500、600、800、1 000 μmol/L)，对照组加入完全培养基，每组设3个复孔。孵育24 h、48 h、72 h后，弃去培养基，每孔加入100 μL 10% CCK-8溶液，避光孵育40 min后于酶标仪450 nm处测定吸光度(OD值)。细胞增殖抑制率计算公式：抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。根据实验结果计算IC₅₀值，并确定后续实验中度洛西汀的低、中、高浓度组(分别为10、20、30 μmol/L)，TMZ干预浓度为300 μmol/L，对照组仅加入完全培养基。

1.5 <bold>Transwell</bold>实验检测细胞迁移和侵袭水平

按上文1.4节所述给药浓度，使用度洛西汀或TMZ干预U87和U251细胞24 h后，进行迁移实验。将细胞(4×10⁴/孔)接种于Transwell小室，上室加入200 μL无血清培养基，下室加入600 μL完全培养基，孵育19 h(侵袭实验孵育24 h)。在侵袭实验中，先将基质胶(1∶7比例混合，总量32 μL)铺于Transwell小室上方，孵育30 min使其凝固后，放置于培养箱中过夜，其他步骤与迁移实验一致。孵育结束后，使用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤，结晶紫染色后晾干。显微镜下拍照并使用Image J软件计数细胞数量。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

取U87和U251细胞进行铺板，按上文1.4节所述给药浓度，使用度洛西汀或TMZ干预细胞24 h，收集PBS洗涤后的细胞，加入1 mL DNA Staining solution和10 μL Permeabilization solution，混匀。室温避光孵育30 min后，使用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布情况。

1.7 转录组测序

将U87细胞铺板，根据上文1.4节所述给药浓度，使用度洛西汀干预细胞24 h，随后用PBS洗涤并收集细胞。使用TRIzol法提取总RNA，并将提取后的RNA样本经液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存。文库构建和测序由北京易科拜德科技有限公司完成，使用Illumina Novaseq 6000平台进行测序，生成150 bp双端读长的测序数据。差异表达基因分析及火山图绘制使用DESeq (2010) R包完成，筛选标准为校正后的P(Q)＜0.005且|log₂(fold change)|≥1。基因本体(GO)富集分析和KEGG通路分析使用由clusterProfiler软件(V 4.0.1)完成，通路显著性筛选标准为Q＜0.05。

1.8 实时定量<bold>PCR</bold>实验检测<bold>Skp2</bold>、<bold>p21</bold>和<bold>p27</bold>的<bold>mRNA</bold>表达

按上文1.4节所述给药浓度，使用度洛西汀干预细胞24 h，收集PBS洗涤后的细胞，用TRIzol法提取总RNA并反转录为cDNA。PCR反应体系为正、反向引物各0.4 μL，cDNA模板5 μL，mix 10 μL，ddH₂O 4.2 μL；反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，循环40次，72℃终延伸10 min。以GAPDH为内参，通过2^-ΔΔCt法分析Skp2、p27与p21的mRNA表达水平，并归一化至对照组。PCR引物序列及产物长度见表1。

1.9 <bold>Western blot</bold>实验检测<bold>Skp2</bold>、<bold>p21</bold>和<bold>p27</bold>的蛋白表达

Western blot实验检测GBM细胞中相关蛋白表达水平。取U87和U251细胞进行铺板，按上文1.4节所述给药浓度，使用度洛西汀和(或) TMZ干预细胞24 h，收集PBS洗涤后的细胞，加入蛋白裂解液裂解，提取总蛋白经定量后进行变性处理。取变性蛋白样品适量，进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转膜，加入含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液于室温下封闭2 h，洗膜后加入Skp2、p21、p27和β-actin一抗(稀释比例为1∶1 000)，4℃下孵育过夜。洗膜，加入相应二抗(稀释比例为1∶8 000)，室温下孵育1.5 h。ECL化学发光显影后成像。分析各个条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白(β-actin)条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.10 分子对接模拟

使用AutoDock Vina软件模拟度洛西汀与Skp2蛋白结合情况。于PubChem数据库获取度洛西汀的化学结构，使用ChemBio 3D软件生成度洛西汀的三维结构并进行构象优化。在蛋白质数据库(PDB，http://www.rcsb.org)中获取Skp2蛋白的晶体结构，去除水分子并添加氢原子和电荷。利用AutoDock Vina软件模拟度洛西汀与Skp2蛋白的分子对接，选择结合能最低的结合模式进行分析。使用PyMol软件将度洛西汀与Skp2蛋白的相互作用可视化为3D图。

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。每个实验至少重复3次，数据以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 度洛西汀对<bold>GBM</bold>细胞活性的影响

与对照组比较，度洛西汀处理24 h后GBM细胞活性降低，10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L度洛西汀对U87的抑制率分别为18.06%±3.91%、47.37%±1.42%和64.85%±0.90%(均P＜0.001)；对U251细胞的抑制率分别为0.59%±0.12%、2.98%± 1.55%和35.25%±1.72。度洛西汀对GBM细胞的抑制效果呈浓度依赖性(P＜0.001)，且U87细胞相较于U251细胞对度洛西汀处理表现出更高的敏感性。在处理U87细胞24 h后，度洛西汀和TMZ的IC₅₀值分别为20.64 μmol/L和330.10 μmol/L，在处理U251细胞24 h后，度洛西汀和TMZ的IC₅₀值为34.20 μmol/L和457.90 μmol/L。见图1。

2.2 度洛西汀对<bold>GBM</bold>细胞迁移和侵袭能力的影响

与对照组比较，经度洛西汀和TMZ处理后GBM迁移和侵袭细胞数量减少(P＜0.001)，且高浓度度洛西汀组对GBM细胞迁移和侵袭的抑制效果优于TMZ组(P＜0.01)。见图2。

2.3 度洛西汀对<bold>GBM</bold>细胞周期的影响

与对照组比较，度洛西汀显著改变了GBM细胞周期分布。流式细胞术结果显示，在10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L度洛西汀处理后，U87细胞G0/G1期的比例分别为64.76%±1.2%、72.18%± 1.22%和79.03%±2.25%，显著高于对照组的55.72%±0.91%(P均＜0.001)；同时，S期细胞的比例下降，对照组为35.7%±2.42%，而10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L处理组分别降至23.51%± 1.98%、15.1%±1.22%和14.11%±1.63% (均P＜0.001)。在U251细胞中，仅30 μmol/L度洛西汀处理增加了G0/G1期细胞比例，从对照组的48.3%± 1.33%升至69.81%±1.18%(P＜0.001)。此外，TMZ处理使GBM细胞G2/M期的比例增加(P＜0.001)。这些结果表明，度洛西汀通过诱导G0/G1期阻滞发挥作用，而TMZ则主要通过增加G2/M期比例调控GBM细胞周期。见图3。

2.4 转录组学测序分析

转录组分析结果显示，U87细胞经30 μmol/L度洛西汀处理24 h后，与对照组比较，共检测到3 745个差异基因表达(筛选标准：Q＜0.005且|log₂[fold change]|≥1)，其中2 069个基因显著上调，1 676个基因显著下调。KEGG通路富集分析显示，细胞自噬(P＝5.37e-05)、蛋白质在内质网中的加工(P＝0.000 2)以及细胞周期(P＝0.009)等通路显著富集，特别是细胞周期通路中的关键调控因子p21(上调2.76倍)和p27(上调1.54倍)的显著上调，以及Skp2(下调1.63倍)的显著下调，进一步支持了度洛西汀可能通过诱导细胞周期阻滞发挥抗GBM作用。图4为差异表达基因的分布及显著通路的基因富集结果，提示这些通路可能在度洛西汀的抗肿瘤作用机制中发挥重要作用。

2.5 <bold>RT-qPCR</bold>验证转录组测序结果

Skp2的过度表达已在多种癌症类型中广泛报道，且与不受控的细胞增殖密切相关^[13]。在转录组测序结果中发现p21和p27基因表达显著上调，Skp2基因表达显著下调。为了进一步验证和探究度洛西汀对上述基因表达的影响，采用qPCR技术对Skp2、p21和p27的mRNA表达水平进行检测。结果显示，与对照组比较，度洛西汀处理后U87细胞中Skp2的mRNA表达降低(P＜0.001)，而p21和p27的mRNA表达升高(P＜0.001)。见图5。

2.6 度洛西汀对<bold>Skp2</bold>、<bold>p21</bold>和<bold>p27</bold>的蛋白表达影响

Western blot结果显示，与对照组比较，随度洛西汀浓度的增加，U87细胞内Skp2蛋白表达逐渐下降(P＜0.05)。同时，p21和p27蛋白表达上调(P＜0.05)。相比之下，U251细胞中Skp2、p21和p27蛋白表达水平仅在30 μmol/L度洛西汀处理下出现变化(P＜0.001)。见图6。

2.7 度洛西汀和<bold>TMZ</bold>的联合治疗抑制<bold>U87</bold>细胞增殖

已有研究表明，抑制Skp2能够增强肿瘤细胞对TMZ的敏感性^[14]。基于此，为初步探究了度洛西汀与TMZ联合治疗的作用效果。实验选择低于所得IC₅₀值的浓度(TMZ为300 μmol/L，度洛西汀为20 μmol/L)对U87细胞进行联合处理。CCK-8实验结果显示，联合治疗组的细胞抑制率优于任一单药治疗组(P＜0.001)。此外，采用Western blot检测度洛西汀与TMZ处理后的U87细胞内Skp2、p27和p21蛋白表达水平。结果表明，与对照组比较，单独使用TMZ处理时，U87细胞Skp2蛋白的表达未发生变化(P＞0.05)，而联合治疗降低了U87细胞中Skp2的蛋白表达，并进一步上调p21和p27的蛋白表达(P＜0.001)。这些结果提示，度洛西汀可能通过调控Skp2-p21/p27信号通路，增强TMZ对U87细胞的抑制作用。见图7。

2.8 度洛西汀与<bold>Skp2</bold>蛋白分子对接结果

度洛西汀与Skp2结合亲和力为-30.96 kJ/mol，表明二者存在较为稳定的相互作用^[15]。见图8。

3 讨论

度洛西汀常用于治疗中重度抑郁症、骨关节炎、神经病理性疼痛以及成年肿瘤患者因化疗引起的周围神经病变性疼痛^[10]。近期研究显示，度洛西汀通过调节免疫和炎症状态在胰腺腺癌细胞中表现出抗增殖作用，同时它还能诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，增强肺癌细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的敏感性^[11-12]。由于度洛西汀具有良好的脂溶性，能够透过血脑屏障并在大脑皮质中富集，本研究初步探讨其抗GBM的潜在作用。结果表明，度洛西汀可以显著抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时诱导GBM细胞周期阻滞。

肿瘤细胞的一个显著特征是其无限增殖的能力，而细胞周期调控的失常使这些细胞能够逃避正常的细胞周期检查点，从而持续分裂^[16]。Skp2是一种F-box蛋白，也是SCF(Skp1-Cullin-F-box) E3泛素连接酶复合物的关键组分，通过识别并结合下游蛋白p21和p27，利用泛素-蛋白酶体途径介导它们的降解^[17]。p21与p27是两种重要的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，能够通过抑制Cyclin E/CDK2和Cyclin D/CDK4/6复合物的活性，阻止细胞从G1期进入S期，从而在细胞周期检查点发挥重要的调控作用^[18-19]。Skp2的过度表达可加速p21与p27的降解，使肿瘤细胞不受控制的增殖。研究表明，Skp2在多种类型的肿瘤中过表达，已被视为肿瘤预后不良的重要指标之一^[20-21]。Skp2不仅促进细胞周期进程，还通过调节EMT相关蛋白和细胞骨架重组增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，并能通过激活肿瘤微环境中的信号通路进一步促进侵袭行为，抑制Skp2可降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力^[22-23]。这些结果均提示Skp2是一个重要的肿瘤治疗靶点。

本研究结果表明，度洛西汀通过下调Skp2表达，阻断了其对p21和p27的降解，导致p21和p27的积累，从而诱导G0/G1期阻滞，G0/G1期阻滞可以限制GBM细胞的增殖能力，降低了肿瘤细胞群体扩增的速度。除了直接抑制Skp2表达，干扰Skp2-SCF复合物的结合同样是一种有效的治疗策略^[13]。本研究发现度洛西汀与Skp2具有较好的结合能力，但度洛西汀是否通过与Skp2结合导致SCF-Skp2泛素连接酶失活，从而减少对p21和p27的泛素化降解作用，仍需进一步深入研究。

TMZ作为GBM的一线治疗药物，主要通过诱导DNA损伤引发细胞凋亡，但其疗效受限于耐药性的产生。已有研究表明，Skp2的高表达是TMZ耐药的重要机制之一^[14]。本研究结果显示，度洛西汀与TMZ联合治疗下调了Skp2表达，并且联合治疗的抑制效果优于任一单药治疗组。这表明度洛西汀可能通过下调Skp2表达，增强TMZ对GBM细胞增殖的抑制作用。该结果与已有研究一致，支持Skp2作为调控TMZ敏感性的潜在靶点。

值得注意的是，Skp2不仅在细胞周期调控与蛋白质降解的过程中发挥重要作用，还可能通过某些机制参与慢性应激和抑郁相关的神经生物学过程。研究表明，Skp2抑制剂SMIP004与NSC689857在非应激和慢性应激小鼠中发挥抗抑郁作用，提示Skp2可能是抑郁症治疗的潜在分子靶点^[24-25]。Skp2抑制剂有望直接调控与抑郁症相关的神经生物学机制，这也为进一步探索度洛西汀抗抑郁作用提供了新的研究思路。

本研究存在一定的局限性：(1)虽探讨了度洛西汀对GBM细胞的影响，但未深入研究U87与U251细胞的敏感性差异，未来需在更多GBM细胞系中验证其广泛适用性；(2)未能在体内实验中进一步验证度洛西汀的抗肿瘤效果；(3)未对度洛西汀抑制GBM细胞迁移和侵袭的具体机制展开深入研究。此外，虽然研究显示度洛西汀与TMZ联合治疗对U87细胞具有显著的细胞抑制作用，但其协同效应尚未明确，未来需采用更严谨的Combination Index法及更多浓度组合实验加以验证。Skp2的下游靶点及其在TMZ耐药中的具体调控机制仍需进一步研究，以明确其在耐药性形成中的作用。

综上所述，度洛西汀能够抑制GBM细胞的增殖，降低其迁移和侵袭能力，并诱导G0/G1期细胞周期阻滞。这些作用可能与度洛西汀抑制Skp2表达、上调p21和p27表达相关。此外，本研究提示度洛西汀可能通过调控Skp2-p21/p27信号通路增强TMZ对GBM细胞的抑制效果，并为克服TMZ耐药问题和优化GBM治疗策略提供了潜在的研究方向。

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基金资助

省部级课题