咖伦宾通过激活Wnt信号通路促进人颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

Columbin promotes osteogenic differentiation of human jaw bone marrow mesenchymal stem cells by activating Wnt signaling pathway

摘要

背景 咖伦宾是从中药青牛胆中提取的一类二萜呋喃内酯型化合物，具有多种生物学活性；其对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响尚不清楚。 目的 研究咖伦宾对人颌骨骨髓间充质干细胞(human jaw bone marrow mesenchymal stem cells，h-JBMMSCs)成骨分化的影响并初步探索其分子机制。 方法 对提取的h-JBMMSCs进行流式细胞术及成骨、成脂向分化鉴定；将h-JBMMSCs在不同浓度(0 µmol/L、5 µmol/L、10 µmol/L、20 µmol/L、40 µmol/L、80 µmol/L)咖伦宾条件下进行成骨诱导。CCK-8实验检测咖伦宾对细胞增殖的影响；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测、茜素红染色和钙离子半定量检测评估咖伦宾对h-JBMMSCs成骨分化的影响；Western blot和qPCR检测Runx2、Col1a1的mRNA及蛋白表达情况；基于转录组数据的生物信息学分析和体外实验初步分析咖伦宾促进h-JBMMSCs成骨分化的分子机制。 结果 咖伦宾浓度≤20 µmol/L时，对h-JBMMSCs的增殖能力无抑制作用(P＜0.05)。与0 µmol/L组比较，5 µmol/L组成骨诱导后ALP活性升高(P＜0.01)；20 µmol/L组成骨诱导后茜素红红染面积和钙结节密度升高(P＜0.001)。咖伦宾成骨诱导后，成骨相关基因与蛋白Runx2、Col1a1表达量增加(P＜0.05)。富集分析结果显示，差异表达基因在细胞外基质受体相互作用和P53信号通路等方面显著富集，进一步分析箱线图及体外实验发现咖伦宾诱导成骨后Wnt信号通路主要下游效应体β-catenin的mRNA和蛋白表达量增加。 结论 咖伦宾浓度≤20 µmol/L时，对h-JBMMSCs的成骨向分化具有一定的促进作用，可能是通过激活Wnt信号通路得以实现的。

Abstract

Background Columbin, a diterpenoid furanolactone-type compound isolated from the traditional Chinese herb Tinospora sagittate, exhibits diverse biological activities, and the effects of columbin on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells remain elusive. Objective To study the effect of columbin on osteogenic differentiation of human jaw bone marrow mesenchymal stem cells and explore its molecular mechanism. Methods The extracted h-JBMMSCs were identified by flow cytometry and osteogenic and lipogenic differentiation; h-JBMMSCs were subjected to osteogenic induction in the presence of columbin at concentrations of 0, 5, 10, 20, 40, and 80 μmol/L. The effect of columbin on cell proliferation was detected by CCK-8 assay; ALP activity assay, alizarin red staining and calcium ion semi-quantitative assay were used to evaluate the effect of columbin on osteogenic differentiation of h-JBMMSCs; The expression of Runx2, Col1a1 proteins and mRNA were detected by Western blotting and q-PCR; Bioinformatic analysis of transcriptome data and in vitro experiments were conducted to investigate the molecular mechanism of columbin in promoting osteogenic differentiation of h-JBMMSCs. Results Columbin exhibited no inhibitory effect on the proliferation capacity of h-JBMMSCs with concentration less or equal to 20 µmol/L (P<0.05). Compared with the 0 µmol/L group, the ALP activity was increased in the 5 µmol/L group (P<0.01). The alizarin red staining area and the density of calcium nodules increased in 20 µmol/L columbin group (P＜0.001).The expressions of osteogenesis-related genes and proteins Runx2 and Col1a1 were increased after the osteogenic induction of columbin (P＜0.05).The results of enrichment analysis showed that differentially expressed genes were significantly enriched in ECM receptor interaction and P53 signaling pathway, further analysis of box plots and in vitro experiments showed that the mRNA and protein expression of β-catenin, the main downstream effector of Wnt signaling pathway, significantly increased after columbin-induced osteogenesis. Conclusion Columbin with concentration less or equal to 20 µmol/L exerts a promotive effect on the osteogenic differentiation of h-JBMMSCs, and this process may involve the activation of the Wnt signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

咖伦宾 / 骨质疏松症 / 间充质干细胞 / 细胞分化 / Wnt信号通路

Key words

columbin / osteoporosis / mesenchymal stem cells / cell differentiation / Wnt signaling pathway

骨质疏松症是一种以低骨量和骨结构破坏为特征的全身代谢性骨病，易导致骨脆性增加、病理性骨折增多^[1-2]。间充质干细胞来源的成骨细胞与破骨细胞之间的功能失衡是骨质疏松症形成的主要原因^[3]。人颌骨骨髓间充质干细胞(human jaw bone marrow mesenchymal stem cells，h-JBMMSCs)是源于人颌骨骨髓的一类具有高增殖、高迁移活性和多向分化潜力的成体干细胞^[4]。h-JBMMSCs增殖率高，成骨潜力强，是治疗骨质疏松症的理想种子细胞。促进h-JBMMSCs成骨向分化以增加骨形成可能是治疗骨质疏松症的一种有效方法^[5]。

青牛胆作为一种传统中药，有治疗骨质疏松症的功效^[6]。咖伦宾是一种二萜呋喃内酯型化合物，为青牛胆中的一种主要活性成分。既往研究表明，咖伦宾有抗炎、镇痛、降血脂及抗肿瘤等作用^[7]。咖伦宾对h-JBMMSCs成骨分化的影响尚不清楚。本研究验证咖伦宾对h-JBMMSCs增殖及成骨分化的影响，并进一步探讨相关信号通路等分子机制，以期为咖伦宾应用于治疗骨质疏松症提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

h-JBMMSCs完全培养基[L-DMEM(Gibco)+10%胎牛血清(Gibco)+1%青链霉素(Gibco)]；成骨诱导培养基[L-DMEM(Gibco)+10%胎牛血清(Gibco)+1%青链霉素(Gibco)+10 mmol/L β-甘油磷酸钠(MCE)+50 µmol/L抗坏血酸(MCE)+10 nmol/L地塞米松(Sigma)]；成脂诱导分化培养基、油红O染色液(武汉普诺赛)；茜素红染色液(广州赛业)；CCK-8试剂盒(同仁化学)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒(碧云天)；氯化十六烷基吡啶(阿拉丁)；咖伦宾(阿拉丁，货号：C414348，规格：5 mg，纯度：≥98%)；抗OPN抗体、抗Runx2抗体、抗Col1a1抗体(AB clonal)、抗β-catenin抗体(武汉三鹰)；细胞裂解液相关试剂PMSF、RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂A、蛋白磷酸酶抑制剂B、50 × Cocktail(北京索莱宝)；逆转录试剂盒、SYBR qPCR Master Mix试剂盒(诺唯赞)；NanoDrop One核酸定量检测仪、CO₂恒温孵箱(Thermo)；实时定量PCR仪(Bio-Rad)。

1.2 <bold>h-JBMMSCs</bold>的分离、培养和鉴定

因正颌手术需要而切除的下颌松质骨碎片标本取自解放军总医院第一医学中心口腔科，标本来源于无系统性疾病的青年女性且已取得患者知情同意，标本大小约4 mm × 4 mm × 4 mm。采用全骨髓贴壁法提取h-JBMMSCs，用完全培养基反复冲洗骨碎片，将骨髓冲洗液及骨碎片全部接种于10 cm培养皿中，将培养皿放置于37℃、5% CO₂细胞培养箱中进行培养。之后每3 d更换1次完全培养基，光学显微镜下观察细胞形态，待细胞融合度达到80% ~ 90%时按1∶3比例传代，取P3 ~ P4代细胞用于后续实验。取P3代细胞进行流式细胞表面标志物鉴定以及成骨、成脂多向分化诱导鉴定。

1.3 <bold>CCK-8</bold>检测细胞增殖能力

取P4代细胞以3 × 10³/孔的密度接种于96孔板，每组设置6个复孔，在培养箱中培养24 h使其贴壁。咖伦宾溶解于DMSO中，配制成浓度为10 mmol/L的母液，在成骨诱导培养基中加入咖伦宾母液以配制成终浓度为0 µmol/L、5 µmol/L、10 µmol/L、20 µmol/L、40 µmol/L、80 µmol/L的工作液。将工作液加入培养的细胞中，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 µL的CCK-8试剂，于培养箱中继续培养2 h，使用酶标仪检测450 nm波长处各孔的OD值。

1.4 <bold>ALP</bold>检测试剂盒检测细胞成骨能力

采用ALP检测试剂盒检测h-JBMMSCs成骨诱导7 d后ALP的活性。取P4代细胞以1×10⁴/孔的密度接种于12孔板，细胞融合度达到80%时更换为不同浓度咖伦宾的工作液，每3 d换液1次。培养7 d后PBS清洗3次，使用Western blot及IP细胞裂解液裂解细胞，4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清于405 nm波长处检测各组的OD值。

1.5 茜素红染色检测细胞成骨能力

采用茜素红染色评估成骨诱导14 d后的钙沉积情况。P4代细胞以1×10⁴/孔的密度接种于12孔板，细胞融合度达80%时更换为不同浓度咖伦宾的工作液，每3 d换液1次。连续培养14 d，去上清，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min后，使用茜素红染液进行染色，室温下孵育30 min。PBS轻柔清洗3次后拍照观察，并加入10%氯化十六烷基吡啶，室温下孵育1 h。使用酶标仪在562 nm波长处检测各组的OD值。

1.6 油红<bold>O</bold>染色检测细胞成脂能力

采用油红O染色评估成脂诱导21 d后的成脂分化情况。P4代细胞以1×10⁴/孔的密度接种于6孔板，细胞融合度达到100%时更换为成脂诱导培养基，每3 d换液1次。成脂诱导21 d后，按照油红O试剂盒说明书的步骤进行油红O染色，并在光学显微镜下观察脂滴形成情况。

1.7 <bold>qPCR</bold>检测成骨相关基因表达情况

P4代细胞以2×10⁵/孔的密度接种于10 cm培养皿，细胞融合度达80%时更换为不同浓度咖伦宾的工作液，每3 d换液1次。分别培养7 d和14 d后，使用Trizol法提取各组细胞总RNA，并测定浓度与纯度。按照说明书的步骤，使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。采用SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行定量检测成骨相关基因的表达情况。GAPDH作管家基因，使用2^-△△CT方法计算结果。反应体系为20 μL，扩增程序：95℃预变性10 s；95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共40个循环。相关引物由博迈德公司合成，引物序列见表1。

1.8 <bold>Western blot</bold>检测成骨相关蛋白表达

P4代细胞以2×10⁵/孔的密度接种于10 cm培养皿，细胞融合度达80%时更换为不同浓度咖伦宾的工作液，每3 d换液1次。分别培养7 d和14 d后，收集细胞沉淀，加入细胞裂解液4℃摇床裂解15 min后，4℃下12 000 r/min离心30 min，收集上清即为总蛋白。向蛋白中加入5 ×上样缓冲液后煮沸8 min，使蛋白质变性。10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜、封闭，4℃下与一抗Runx2、Col1a1、β-catenin和β-actin孵育过夜，次日洗膜后室温二抗孵育2 h。通过ECL显色试剂盒显色，Image J软件对条带进行灰度值分析。

1.9 成骨诱导后的转录组测序与通路富集分析

P4代细胞以2×10⁵/孔的密度接种于10 cm培养皿，对照组使用完全培养基进行培养，实验组使用含有咖伦宾的工作液进行培养。相同条件下培养14 d后提取各组RNA，每组设置3个生物学重复。由擎科生物Illumina平台对样本进行转录组测序。以P_adj＜0.05、|logFC|＞1为阈值，使用R语言DESeq2包筛选两组间差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)^[8]。采用clusterProfiler包进行基因本体论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，并将结果可视化。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.4.0进行统计学分析，计量数据以x±s表示，各组采用正态性检验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 <bold>h-JBMMSCs</bold>的细胞形态、表面标志物及多向分化能力鉴定

原代细胞在完全培养基中培养，光镜下观察P3代h-JBMMSCs呈旋涡状、聚集样贴壁生长。流式细胞术结果显示细胞表面标志物CD90(92.9%)、CD105(90.2%)表达呈阳性，CD19(0.41%)和CD45(0.82%)表达呈阴性。成骨诱导14 d茜素红染色，光镜下可见大量红色矿化结节。成脂诱导21 d油红O染色，光镜下可见脂滴形成。表明分离的细胞符合间充质干细胞的特性(图1)。

2.2 不同浓度咖伦宾对<bold>h-JBMMSCs</bold>增殖的影响

以0 µmol/L咖伦宾组作为对照组，5 µmol/L、10 µmol/L、20 µmol/L、40 µmol/L、80 µmol/L组作为实验组进行CCK-8实验，结果显示，与对照组比较，在5 µmol/L、10 µmol/L和20 µmol/L组中均未观察到抑制增殖的作用，且20 µmol/L组在作用24 h和48 h时对细胞增殖表现出促进作用(P＜0.05)，但随着时间的延长，72 h时对细胞的增殖不再具有促进作用。在40 µmol/L组中，48 h时可观察到促进增殖的作用，然而在72 h时，对细胞的增殖则表现出一定的抑制作用。80 µmol/L咖伦宾组则始终抑制细胞的增殖(图2)。结果表明，低浓度的咖伦宾对h-JBMMSCs无细胞毒性作用，因此选择5 µmol/L、10 µmol/L和20 µmol/L作为实验组进行后续实验。

2.3 咖伦宾对<bold>h-JBMMSCs</bold>成骨分化的影响

以0 µmol/L咖伦宾组作为对照组，5 µmol/L、10 µmol/L、20 µmol/L组作为实验组对h-JBMMSCs进行成骨诱导7 d和14 d时分别进行ALP活性检测及茜素红染色。ALP检测结果显示，在5 µmol/L时提高了ALP的活性(P＜0.01)，在10 µmol/L和20 µmol/L时未观察到显著的变化(图3B)。茜素红染色结果显示，随着咖伦宾浓度的增加，红染面积和钙离子浓度逐渐增加，其中咖伦宾浓度在20 µmol/L时效果最显著(图3A)。半定量分析结果同样表明，细胞在20 µmol/L咖伦宾条件下孵育时钙离子沉积量高于对照组(P＜0.001)(图3C)。进一步qPCR结果表明，咖伦宾成骨诱导7 d和14 d时h-JBMMSCs中Runx2和Col1a1的表达水平高于对照组(图4)。Western blot结果显示，在诱导培养7 d时，Runx2蛋白表达量随着咖伦宾作用浓度的升高而升高，Col1a1蛋白表达量亦高于对照组。在诱导培养14 d时，Runx2和Col1a1的表达量均升高，并呈浓度依赖性(图5)。

2.4 转录组测序数据结果分析

20 µmol/L咖伦宾组可增强h-JBMMSCs成骨分化晚期阶段的成骨能力，因此实验组选择咖伦宾浓度为20 µmol/L的工作液作为诱导因素来进行转录组分析。共筛选出2 087个DEGs，使用ggplot2软件包作DEGs火山图(图6)，其中上调基因896个，下调基因1 191个。GO富集分析结果显示，生物学进程主要与核分裂、染色体分离等相关；细胞组分主要与细胞外基质胶原蛋白等相关；分子功能主要与细胞外基质和胶原结合等相关(图7A)。KEGG通路富集分析结果显示主要与细胞周期、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)受体相互作用和P53信号通路等相关(图7B)。Wnt/β-catenin信号通路在间充质干细胞成骨分化过程中发挥关键作用^[9]。为进一步探索Wnt/β-catenin信号通路在咖伦宾诱导成骨过程中的作用，使用ggplot2软件包对DEGs进行箱线图绘制，发现Wnt/β-catenin通路的关键分子β-catenin基因表达水平高于对照组(图8A)，这也与qPCR和Western blot实验中β-catenin的mRNA和蛋白表达结果一致(图8B ~ 图8D)。进一步从PDB、TCMSP数据库中下载β-catenin和咖伦宾的蛋白质结构，利用AutoDockTools软件进行分子对接并使用Pymol软件进行可视化(图9)，咖伦宾与β-catenin通过2个氢键相结合，结合能为-7.3 kJ/mol，提示两者之间具有较强的结合能力。

3 讨论

由于人口老龄化的加剧，骨质疏松症日益成为重要的健康问题。在骨质疏松症的发生发展中，成骨细胞介导的骨形成作用弱于破骨细胞介导的骨吸收作用，因此促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化对于恢复骨量、治疗骨质疏松症具有重要意义^[10]。中药青牛胆具有增加骨质疏松大鼠的骨密度、促进成骨细胞生成的作用。咖伦宾作为青牛胆的主要活性成分，已被发现在多个生物学进程中发挥作用，如Libin等^[11]通过分子对接模型及体外实验发现咖伦宾可与H1N1病毒蛋白进行稳固的结合，可作为H1N1流感的潜在抗病毒剂。还有大量文献报道咖伦宾在体内和体外均具有显著的抗炎效果，可作为一种潜在的抗炎药。而炎症可抑制成骨细胞的分化，并引起成骨细胞的功能障碍，从而在骨质疏松症的发展中发挥作用^[12]。咖伦宾可能通过抗炎作用来减轻炎症对成骨细胞分化的抑制作用。但目前无咖伦宾对h-JBMMSCs成骨分化影响的研究报道。本研究中通过体外实验探索咖伦宾对h-JBMMSCs增殖和成骨分化的影响以及可能的调控机制。

通过研究不同浓度咖伦宾对h-JBMMSCs增殖的影响，我们发现咖伦宾浓度≤20 µmol/L时对h-JBMMSCs的增殖无显著抑制作用；而咖伦宾＞20 µmol/L时，随着作用时间的延长而表现出一定的增殖抑制作用。因此选择5 µmol/L、10 µmol/L和20 µmol/L组作为实验组进一步评估ALP活性、钙离子沉积以及成骨相关基因和蛋白质的表达，观察到咖伦宾可以显著促进h-JBMMSCs的成骨分化。然而ALP活性检测和茜素红染色的结果具有一定差异性，这种差异可能是由于不同浓度的咖伦宾作用于不同的信号通路所致，5 µmol/L时对h-JBMMSCs的早期分化通路有更显著的激活作用，而20 µmol/L时则可能在晚期对矿化相关的过程产生更强的影响，更体现出成骨分化相关调控机制的复杂性。Runx2作为成骨早期阶段的核心转录因子，可通过调控多种骨特异性转录因子来诱导成骨分化，而Col1a1在骨组织中含量丰富，被认为是成骨分化晚期的标志之一^[13-14]。在本研究中，咖伦宾作用于h-JBMMSCs 14 d后显著上调了Runx2和Col1a1基因和蛋白质表达水平，表明咖伦宾在成骨分化早期和晚期均发挥着促进作用，显示出其具有治疗骨质疏松症的强大潜力。

由于20 µmol/L咖伦宾在成骨分化晚期阶段发挥着显著促进作用，我们选择20 µmol/L咖伦宾成骨诱导14 d后进行转录组测序分析。通过对转录组数据进行通路富集分析，发现DEGs在ECM受体相互作用和P53信号通路等方面显著富集。ECM作为细胞的物理支持成分，其结构和功能复杂，在促进细胞迁移、细胞周期进程和决定细胞命运方面至关重要，既往研究发现ECM可通过Wnt信号通路促进矿化形成^[15]。P53是细胞分化的重要调节因子，Zhou等^[16]通过β-catenin条件性谱系示踪小鼠发现P53在Wnt通路介导的成骨向分化中起负向调节作用，P53缺陷的骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强。Wnt信号通路作为调控间充质干细胞成骨分化的关键通路之一，包括依赖β-catenin的经典信号通路和不依赖β-catenin的非经典信号通路，经典信号通路对于间充质干细胞成骨分化的调控作用尤为重要，该通路的激活可显著增强间充质干细胞的成骨分化^[17-19]。其中β-catenin作为经典信号通路的主要下游效应体，在本研究中，咖伦宾可通过与β-catenin形成稳定的结合体，在咖伦宾成骨诱导培养14 d后β-catenin的mRNA和蛋白表达水平提高，提示咖伦宾可能是通过Wnt信号通路尤其是其中的经典信号通路促进h-JBMMSCs成骨向分化，这也与通路富集的结果契合。但Wnt信号通路是一个极其复杂的作用网络，其具体调控机制还需进一步研究。

综上所述，本研究发现咖伦宾浓度≤20 µmol/L时可促进h-JBMMSCs成骨向分化，并且这一过程可能是通过激活Wnt信号通路尤其是经典信号通路实现的；提示咖伦宾可能是一种治疗骨质疏松症的潜在药物，未来需进一步研究咖伦宾的详细作用机制以及咖伦宾在体内的作用效果。

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