基于Sequenom MassARRAY SNP技术的乙型肝炎病毒耐药突变质谱检测平台的建立与评价

Development and evaluation of a sequenom MassARRAY SNP-based drug-resistance detection platform for hepatitis B virus

摘要

背景 HBV耐药突变检测是临床精准治疗的关键环节，虽然目前检测方法较多，但均不适于临床大规模应用。 目的 基于Sequenom MassARRAY SNP技术，建立检测HBV聚合酶基因型耐药突变的质谱检测平台。 方法 随机选取解放军总医院第五医学中心2014年3月 — 2018年6月100例HBV核酸阳性患者进行聚合酶基因的全长序列测定，其中男51例，女49例，中位年龄51岁。采用MEGA11.0进行序列比对及聚类分析，分析测序成功的62例HBV聚合酶基因的序列特征和基因型，并人工合成野生型和突变型聚合酶基因序列，设计针对HBV主要耐药相关SNP位点(19个)的延伸扩增引物及单碱基延伸引物，建立相应的耐药突变质谱数据库，评估各耐药突变的检出限。从聚合酶区测序成功的62例临床血清样本中随机选取18例，利用sanger测序法和Sequenom MassARRAY SNP法对聚合酶区的耐药突变进行检测。 结果 基于聚合酶基因的进化树显示，在62例临床HBV核酸阳性标本中，基因B型和基因C型分别占25.8%和74.2%。设计并合成1条野生型聚合酶基因序列和5条突变型序列，共覆盖基因B型和基因C型的15个耐药突变(包含19个SNP位点)。所建立的质谱检测平台经优化后，对19个SNP位点的检出限均在1% ~ 5%。在18例临床样本中，Sanger测序法均未检出HBV耐药SNP位点，但Sequenom MassARRAY SNP检出5例样本含HBV耐药SNP位点，其中4例基因B型，1例基因C型。 结论 本研究建立了基于Sequenom MassARRAY SNP技术的HBV耐药突变的质谱检测平台，初步应用显示了该平台具有快速精准、高通量、高灵敏等特点，一次实验可确定HBV的耐药特征，具有良好的临床应用前景。

Abstract

Background Precision treatments are crucial for HBV infections and detection of HBV drug-resistant sites is a prerequisite. However, none of the available kits for detection of HBV drug-resistant sites are suitable for large-scale clinical application. Objective To establish and evaluate the platform for detection of drug-resistant sites of hepatitis B virus (HBV) based on Sequenom MassARRAY SNP that combined single-base extension PCR, multiplex PCR, and matrix-assisted laser desorption /ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Methods A total of 100 HBV-positive patients who were admitted to the Fifth Medical Center of PLA General Hospital from 2014 to 2018 were randomly selected. The cohort included 51 males and 49 females, with a median age of 51 years. Sequencing was successfully completed in 62 cases. Sequence comparison and cluster analysis were performed using MEGA11.0. The polymerase gene sequences of wild-type and mutant-type of HBV were synthesized. Amplification primers and single base extension primers for 19 SNP sites of HBV were designed and synthesized. The corresponding Sequenom MassARRAY SNP platform was established to evaluate the detection limit of each resistance SNP. Eighteen clinical serum samples were randomly selected from 62 samples with confirmed full-length polymerase sequences, and then detected by sanger sequencing and Sequenom MassARRAY SNP. Results Among the 62 HBV clinical samples, the genotype B and C accounted for 25.8% and 74.2%, respectively. The synthesized wild-type and mutant-type polymerase gene sequences covered a total of 15 drug-resistant sites (including 19 SNPs). The established Sequenom MassARRAY SNP detection platform showed that the detection limits of 19 SNPs were 1%-5%. No SNPs of HBV resistance were detected by Sanger sequencing among the 18 clinical serum samples, while 5 samples were detected to contain SNPs of HBV resistance by Sequenom MassARRAY SNP, including 4 genotype B and 1 genotype C. Conclusion The Sequenom MassARRAY SNP-based drug-resistance detection platform for hepatitis B virus is established. The preliminary evaluation demonstrates that this platform has the characteristics of rapid accuracy, high throughput, and high sensitivity, which can determine the drug-resistant profiling of HBV in one experiment.

Graphical abstract

关键词

乙型肝炎病毒 / 质谱分析法 / 基因型 / 病毒耐药性 / 聚合酶基因 / 高通量筛选试验 / 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

Key words

Sequenom MassARRAY / HBV / genotype / drug-resistant sites / polymerase gene

2016年5月，世界卫生组织提出2030年消除病毒性肝炎的全球战略目标(将新发感染减少90%，病死率减少65%)，这使得慢性HBV感染的防治显得十分重要^[1]。我国是世界上乙肝防治压力最大的国家，2021年我国一般人群HBsAg流行率为3%，虽然显著低于1973 — 1984年的9.6%，但仍高于发达国家^[2]。目前的抗HBV药物主要为拉米夫定(lamivudine，LAM)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)、恩替卡韦(entecavir，ETV)、富马酸替诺福韦(tenofovir disproxil fumarate，TDF)、替比夫定(telbivudine，LdT)、富马酸丙酚替诺福韦酯(tenofovir alafenamide fumarate，TAF)等，均为靶向病毒的聚合酶。研究发现，病毒耐药与病毒聚合酶内的某些特异突变密切相关。目前HBV耐药突变检测方法较多，但它们均不适于临床的大规模检测，如基于探针的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点实时荧光PCR法不能同时检测多个位点，PCR-反向斑点杂交(PCR-reverse dot blot，PCR-RDB)技术检测成本较高，一代测序法灵敏度低，宏基因组测序法操作复杂等。近年来，质谱技术在核酸检测分析中显现出巨大的潜力，其在预防医学、传染病防控领域的应用飞速发展，在快速鉴定、分型溯源、耐药性等方面进展迅速，尤其是SNP位点分析层面^[3-4]。本研究基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术并结合多重PCR及单碱基延伸PCR方法，建立检测HBV聚合酶基因型耐药突变的Sequenom MassARRAY SNP质谱平台，构建覆盖主要耐药突变的质谱数据库，旨在为HBV耐药突变的检测提供一个灵敏度高、重复性好、准确率高、通量高、快速经济的鉴定平台，同时为Sequenom MassARRAY SNP在其他检测领域的应用提供有益参考。

1 材料和方法

1.1 HBV临床标本来源

从2014年3月— 2018年6月的解放军总医院第五医学中心门诊患者中，采用分层抽样法(按照性别分层)随机选取HBV核酸阳性患者100例(核酸定量均＞1×10³ IU/mL，并剔除重复病例)。

1.2 试剂与仪器

全波长紫外/可见光扫描分光光度计NanoDrop-1000(美国NanoDrop)，电泳仪(北京六一)，凝胶成像仪(北京六一)，Bio-Rad T100 PCR仪(美国伯乐)，ABI9700 PCR仪(美国ABI)，MALDI-TOF MS质谱仪及配套试剂(美国sequenom)，病毒基因组提取试剂盒(德国凯杰)，高保真聚合酶(美国赛默飞)等。

1.3 HBV全长聚合酶基因的sanger测序

采用病毒基因组DNA提取试剂盒，对100例HBV核酸阳性标本提取的DNA，并以提取的DNA为模板，扩增聚合酶基因。聚合酶区扩增引物为HBV-F(5’-GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3’)和HBV-R(5’-CCCACAATTCKTTGACATAC TTTCC-3’)，扩增长度745 bp^[5]。扩增条件：94℃ 5 min；30个循环(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s)；72℃ 10 min；4℃ ∞。剔除PCR扩增失败及条带较暗的标本，选取68例电泳条带特异的扩增产物同时进行正反两个方向的sanger测序。序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。

利用MEGA11.0对测序成功的62个HBV聚合酶全长基因序列(745 bp)进行序列比对和进化树分析，确定其序列特征和基因型。

1.4 HBV耐药突变Sequenom MassARRAY SNP质谱平台的构建

根据成功测序的62个HBV聚合酶基因的序列特征，设计覆盖19个SNP位点的1条野生型序列(长度为754 bp)和5条突变型序列(长度分别为600 bp、554 bp、246 bp、273 bp、282 bp)。以上核酸片段的合成和相应的质粒构建均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

采用Sequenom公司的Genotyping Tools和MassARRAY Assay Design软件，设计针对聚合酶基因中19个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。以合成的野生型和突变型质粒作为模板，评估19个SNP位点质谱峰图情况。如SNP位点质谱图存在非特异性峰图或者假阴性，进行复测或者引物优化，以排除污染及引物的非特异性延伸问题。优化后的引物见表1。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.5 Sequenom MassARRAY^SNP质谱平台的检测流程

分别以野生型质粒和突变型质粒为模板，在384孔板中进行多重PCR扩增。19个SNP位点分6个反应管如表1(W1-W6)。扩增条件：95℃ 2 min；45个循环(95℃ 2 min；56℃ 30 s；72℃ 60 s)；72℃ 5 min；4℃ ∞。PCR产物纯化后，用虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)处理，以去除反应体系中游离dNTPs。反应条件：37℃ 40 min；85℃ 5 min；4℃ ∞。在碱性磷酸酶处理后，利用EXTEND Mix反应液进行单碱基延伸反应。反应条件：95℃ 30 s；94℃ 5 s；5个循环(52℃ 5 s，80℃ 5 s)；40个循环(94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s)；72℃ 3 min；4℃ ∞。利用Clean Resin树脂对单碱基延伸产物进行纯化。

1.6 质谱检测

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将经树脂纯化后的延伸产物转移至384孔SpectroCHIP (sequenom)芯片上，利用MALDI-TOF MS对SpectroCHIP芯片进行检测。在相对分子质量5 000 ~ 9 000 Da范围内采集数据，仪器及分析设置相关参数：飞行管长800 mm、加速电压20 kV、激光器波长337 nm、激光束能量150 μJ、采集频率30 Hz等。利用TYPER4.0软件(sequenom)分析质谱峰图。

1.7 Sequenom MassARRAY^SNP质谱平台的检出限

将聚合酶基因突变型质粒分别按50%、20%、15%、10%、5%和1%的比例与野生型质粒进行混合，然后以此为模板对19个SNP位点进行检测，分析Sequenom MassARRAY^{SNP质谱平台检测各SNP位点的检出限。}

1.8 Sequenom MassARRAY SNP质谱平台的初步评价

从测序成功的62个HBV标本中随机选取18例样本，参照1.5的流程进行Sequenom MassARRAY SNP检测，并与sanger测序结果进行比较。

1.9 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据处理和统计分析，计数资料采用绝对频(例)数表示，成组比较采用Fisher’s精确概率检验法，配对比较采用优势性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV临床样本的基因分型

选取的100例临床样本中，男51例，女49例，中位年龄51岁。以HBV全长聚合酶基因为靶标，利用MEGA11.0对测序成功的62个HBV毒株进行序列比对及聚类分析。结果显示，在62个HBV毒株中，基因B型占比25.8%(16/62)，基因C型占比74.2%(46/62)，其中基因B型和基因C型的型间同源性为92.0% ~ 92.4%，基因B型的型内同源性≥96.1%，基因C型的型内同源性≥95.0%。序列差异主要集中在SNP位点分布的区域(聚合酶基因为375 ~ 586 bp)。进化树分析结果见图1。

2.2 Sequenom MassARRAY^SNP质谱平台耐药突变质谱数据库的构建

不同碱基分子量的差异，在MALDI-TOF MS中可呈现出不同质荷比的质谱峰，通过延伸产物质荷比与探针质荷比之间的差值判断延伸碱基的类型。本研究以HBV聚合酶基因为鉴定对象，经多次优化，建立包含15个密码子(19个SNP位点)的36个质谱峰图数据库(含19个野生型峰图与19个突变型峰图)。该质谱数据库中各耐药突变的峰图信噪比值均较高，峰图特征图2为其中4个SNP位点(rtA181V_421、rtM204V_489、rtI233V_576、rtN236T_586)的峰图。

2.3 Sequenom MassARRAY^SNP质谱平台的检出限评价

聚合酶基因突变型质粒和野生型质粒经梯度稀释后，对19个SNP位点进行MassARRAY SNP检测。结果表明(表2)，4个SNP位点(rtL180M_417、rtL80I/V_117、rtL229W_565、rtI169T_385)的检出限为1%，15个SNP点(rtS202I_484、rtT128N_262、rtM250V_627、rtV173L_396、rtA181V_421、rtM204I_491、rtA181T/S_420、rtM204V_489、rtN236T_586、rtA194T_459、rtI233V_576、rtF166L_375、rtL229V/M_564、rtT184S_430、rtL229F_566)的检出限为5%。各SNP位点在稀释梯度为50%时，两峰间峰面积差异均小于1∶2，在检出限处的峰图像信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)均＞3，实验结果可靠。图3是SNP位点rtL229M_564、rtM250V_627、rtL229W_565和rtL80I/V_117的SNP检测峰图。

基金资助

首都临床特色应用研究(Z141107002514027)