萝卜硫素通过增强抗氧化能力抑制髓核细胞铁死亡

Sulforaphane inhibits ferroptosis in nucleus pulposus cells by enhancing antioxidant capacity

摘要

背景 椎间盘退变过程中，髓核细胞铁死亡的发生与氧化应激失衡密切相关。萝卜硫素作为天然抗氧化剂，其对髓核细胞铁死亡的调控作用及分子机制尚不明确。 目的 分析萝卜硫素对Erastin诱导的髓核细胞铁死亡的影响，并评估萝卜硫素对细胞活力及抗氧化能力的调节作用。 方法 以人髓核细胞为研究对象，分为对照组、Erastin处理组以及不同浓度的萝卜硫素干预组(2.5 ~ 40 μmol/L)。通过光学显微镜、流式细胞术、CCK-8试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、Western blot等方法，检测细胞形态、病死率(PI⁺率)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平、细胞活力和抗氧化能力以及细胞内Collagen Ⅱ、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白的表达情况。 结果 Erastin处理组中，髓核细胞体积增大、形态改变，并伴随细胞死亡和细胞内ROS水平升高，提示Erastin成功诱导了髓核细胞的铁死亡(P＜0.001)。流式细胞术分析结果显示，与对照组比较，Erastin处理可以使PI⁺细胞比例增加，从对照组的5.11% ± 0.04%升至10.11% ± 0.58%。而萝卜硫素5 μmol/L和10 μmol/L处理组可以降低PI⁺细胞比例，分别为5.08% ± 0.44%和3.38% ± 0.32%，10 μmol/L萝卜硫素组的PI⁺细胞比例低于5 μmol/L萝卜硫素组(P＜0.001)。以上结果表明，萝卜硫素在一定浓度下能够显著抑制Erastin诱导的髓核细胞铁死亡，10 μmol/L萝卜硫素对PI ⁺ 细胞比例的抑制作用更强。Western blot结果进一步证实，10 μmol/L萝卜硫素处理能够有效增强Nrf2的表达，并恢复Collagen Ⅱ、GPX4、SLC7A11蛋白的表达，逆转Erastin处理引起的蛋白表达下降。 结论 萝卜硫素能够通过增强髓核细胞的抗氧化能力，抑制Erastin诱导的铁死亡，进而维持细胞活力。

Abstract

Background Ferroptosis in nucleus pulposus cells plays a crucial role in intervertebral disc degeneration, and sulforaphane (SFN), a natural compound, is known for its antioxidant properties. Objective To analyze the effects of SFN on Erastin-induced ferroptosis in nucleus pulposus cells and evaluate its regulation of cell viability and antioxidant capacity. Methods Human nucleus pulposus cells were used as the study subjects and treated with different groups, including control group, Erastin-treated group, and SFN intervention groups (2.5 μmol/L to 40 μmol/L). Cell morphology, death rate, ROS levels, cell viability, and antioxidant capacity were assessed using optical microscopy, flow cytometry, CCK-8 assay, and Western blotting. Results In the Erastin-treated group, cells exhibited increased volume, morphological changes, and significant cell death with elevated ROS levels, indicating successful induction of ferroptosis in nucleus pulposus cells. Flow cytometry analysis showed a significant increase in PI⁺ cell proportion after Erastin treatment, rising from (5.11 ± 0.04)% in the control group to (10.11 ± 0.58)%. However, the PI⁺ cell proportion in the SFN 5 μmol/L and 10 μmol/L groups significantly decreased to (5.08 ± 0.44)% and (3.38 ± 0.32)%, respectively, with the 10 μmol/L SFN group showing a significantly lower proportion compared to the 5 μmol/L SFN group (P < 0.001). These results indicated that SFN at certain concentrations could significantly inhibit Erastin-induced ferroptosis, with 10 μmol/L SFN showing the most significant effect in reducing PI⁺ cells. Western blot analysis further confirmed that 10 μmol/L SFN treatment effectively enhanced the expression of Nrf2 and restored the expression of Collagen Ⅱ, GPX4, and SLC7A11 proteins, reversing the protein expression decline caused by Erastin treatment. Conclusion Sulforaphane can enhance the antioxidant capacity of nucleus pulposus cells and inhibit Erastin-induced ferroptosis, thereby maintaining cell viability, which provides experimental evidence for sulforaphane as a potential therapeutic strategy for intervertebral disc degeneration.

Graphical abstract

关键词

萝卜硫素 / 铁死亡 / 髓核细胞 / 活性氧 / 抗氧化能力

Key words

sulforaphane / ferroptosis / nucleus pulposus cells / reactive oxygen species / antioxidant capacity

髓核细胞是椎间盘的重要组成部分，其功能与健康状态直接影响着脊柱的生物力学性能^[1-2]。随着年龄的增长和各种外部因素的影响，髓核细胞逐渐受到损伤，导致椎间盘退变。近年来，铁死亡作为一种新型的细胞死亡方式，已被发现与多种疾病的进展密切相关，在椎间盘退变中同样起着关键作用^[3-4]。铁死亡的特点是铁离子积累和活性氧(reative oxygen species，ROS)生成，并在细胞内引发氧化应激，导致细胞死亡。现有研究表明，髓核细胞在退变过程中，铁死亡可能是其中重要的致病机制^[5]。萝卜硫素作为一种天然植物化合物，已被证实有抗氧化和抗炎作用^[6]。萝卜硫素能通过调节体内的抗氧化酶系统，减少氧化应激和自由基损伤，从而对细胞起到保护作用^[7]。但萝卜硫素抑制髓核细胞铁死亡的效果和机制尚不明确。本研究旨在通过体外实验探讨萝卜硫素在抑制Erastin诱导的髓核细胞铁死亡中的作用。通过深入理解萝卜硫素的作用机制，有望为椎间盘退变的临床治疗提供有益参考，并推动相关生物治疗方法的应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究使用的人髓核组织标本来源于2024年8月5日石河子大学第一附属医院脊柱外科椎间孔镜手术取得的5例患者髓核组织。本研究经石河子大学第一附属医院伦理委员会审查批准(伦理批件号：KJ2023-177-01)。术前患者已签署知情同意书。

1.2 实验试剂

DMEM/F12完全培养基(含10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素)、酶试剂：胰蛋白酶(Gibco，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)。流式试剂：PI染料、DCFH-DA探针(碧云天，中国)。化学试剂：Erastin (MCE，中国)、萝卜硫素(MCE，中国)。细胞增殖检测：CCK-8 溶液(兰博利德生物，中国)。RIPA(强)组织细胞快速裂解液(索莱宝，中国)、Loading buffer (4×)(BIO-RAD，美国)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、彩色预染蛋白质分子量标准(10 ~ 180 kU)、ECL化学发光试剂(碧云天，中国)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)转移膜(Cytiva，美国)。

(1)一抗：Collagen Type Ⅱ Polyclonal antibody (28459-1-AP)、NRF2，NFE2L2 Polyclonal antibody (16396-1-AP)、SLC7A11/xCT Polyclonal antibody (26864-1-AP)、GPX4 Monoclonal antibody (67763-1-Ig)、β actin Monoclonal antibody (66009-1-Ig)(Proteintech，中国)。(2)二抗：HRP-conjugate Goat Anti-Rabbit (SA00001-2)、HRP-conjugate Goat Anti-Mouse (SA00001-1)(Proteintech，中国)。

1.3 仪器设备

倒置荧光显微镜购自Leica公司，酶标仪购自杭州奥盛公司，流式细胞仪购自Beckman公司，电泳仪购自BIO-RAD公司，全自动化学发光分析仪购自上海天能公司。

1.4 <bold>Erastin</bold>及萝卜硫素溶液配制

取1 mg的萝卜硫素粉末，溶解于0.182 8 mL DMSO中，得到10 mmol/L储备液，过滤分装于200 μL EP管中，-80°C避光保存，根据所需浓度梯度用完全培养基稀释为0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L细胞培养液备用。

取1 mg的萝卜硫素粉末，溶解于0.564 0 mL DMSO中，得到10 mmol/L储备液，过滤分装于200 μL EP管中，-20°C避光保存，根据所需浓度梯度用完全培养基稀释为2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L细胞培养液备用。

1.5 原代髓核细胞提取与培养

于石河子大学第一附属医院脊柱外科手术室取得新鲜人髓核组织，使用0.9%氯化钠注射液冲洗后，放入装有少量DMEM/F12培养液的无菌培养瓶，置入冰盒内迅速带回实验室。在超净台内，将髓核组织用无菌PBS冲洗3次去除血污，弃去纤维环。将胶冻样或软骨样髓核组织在EP管内剪成尽可能小的碎块。37℃下用0.2%(m/v)的Ⅱ型胶原酶消化4 h，期间不间断振荡，至组织块基本消失。1 000 r/min离心5 min，去除上清液，用DMEM/F12培养液重悬细胞。用计数板进行细胞计数，以1×10⁶/mL的细胞密度接种于直径T25培养瓶中，加入6 mL含10%胎牛血清、1%青霉素及链霉素的DMEM/F12完全培养基。于37℃、5% CO₂培养箱中培养。每2 ~ 3 d换液1次，未较好贴壁时可采用半换液，每2 d用倒置相差显微镜进行观察、拍照。90%融合后用胰酶消化后1∶2传代。取第3 ~ 5代细胞进行实验。

1.6 实验分组及干预

将生长良好的髓核细胞随机分为对照组(NC组)、Erastin刺激组(0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)、萝卜硫素干预组(2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)、Erastin (1 μmol/L)+萝卜硫素(5 μmol/L、10 μmol/L)共刺激组。NC组不做任何处理，其他组依次给予不同浓度Erastin、萝卜硫素，继续培养12 h。

1.7 细胞活力检测

CCK-8法取生长良好的髓核细胞，以1×10⁴/孔的细胞密度接种于96孔板，每组3个复孔，培育24 h至全部贴壁。根据分组进行不同处理，处理结束后，按CCK-8试剂盒说明书，每孔加入100 μL CCK-8溶液，37℃孵育1 h后，使用酶标仪检测各组髓核细胞吸光度值，采用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度值。细胞活力=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%，空白组只加培养液、不加细胞。

1.8 <bold>Collagen Ⅱ</bold>、<bold>Nrf2</bold>、<bold>GPX4</bold>、<bold>SLC7A11</bold>蛋白表达检测

Western blot法检测Collagen Ⅱ、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达情况。细胞取出后使用提前预冷的无菌PBS清洗3次，加入Ripa裂解液于冰上充分裂解30 min，使用超声波破碎仪于冰上破碎细胞30 s×15次，12 000 r/min离心后取上清，加入Loading buffer (4×)，100℃孵育10 min。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶分离蛋白，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(稀释比均为1∶1 000)与膜4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(稀释比为1∶10 000)与膜室温孵育1 h，洗膜3次后加入化学发光试剂，置于全自动化学发光分析仪中检测。通过TANON GIS软件读取相关条带，Image J分析灰度值，每组实验重复3次。

1.9 细胞死亡率及活性氧水平检测

采用流式细胞术进行检测。在处理结束后，使用无菌PBS清洗12孔板中的细胞3次，使用无EDTA 0.25%胰酶将髓核细胞消化后收集于流式管中，4℃下离心5 min；弃上清后加入3 mL PBS重悬细胞，4℃下离心5 min；弃上清后加入500 μL的结合缓冲液重悬；加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混匀；室温下避光反应10 min。于1 h内上机检测PI荧光强度(每组20 000个细胞)。用FlowJo软件分析细胞，根据对照组(不加入任何染料)区分不同状态比例和数目，获得各组细胞死亡率，每组实验重复3次。或加入0.5 μL DCFH-DA(1∶1 000)溶液，室温下避光反应10 min。于1 h内上机检测细胞活性氧水平(每组20 000个细胞)。用FlowJo (v10.8.1)软件分析细胞平均荧光强度，每组实验重复3次。

1.10 统计学方法

实验数据均以x̅±s表示，采用单因素方差分析进行多组间差异分析，为减少统计误差，单因素方差分析后进一步进行Tukey's HSD检验。数据的统计分析均采用GraphPad Prism 9.5.1软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人原代髓核细胞的培养与鉴定

2.1.1 细胞形态观察

将消化完全的人原代髓核细胞接种于T25培养瓶中，37℃、5% CO₂条件下培养，于第1天(D1)、第3天(D3)、第5天(D5)和第7天(D7)在倒置光学显微镜下观察。结果显示，D1仅见少量细胞贴壁，细胞形态较圆；D3细胞数量增多并逐渐呈梭形或多边形；D5融合度进一步提高；D7融合度可达80% ~ 90%，此时可进行传代或后续实验。见图1。

2.1.2 Collagen Ⅱ免疫荧光鉴定

采用免疫荧光检测Collagen Ⅱ表达情况，结果显示，细胞胞浆中Collagen Ⅱ呈红色荧光，与DAPI(蓝色)染色的细胞核相对应，对照组(无一抗)未见明显荧光信号，提示所培养细胞为人原代髓核细胞。见图2。

2.2 <bold>Erastin</bold>刺激导致铁死亡

2.2.1 光学显微镜观察

将人原代髓核细胞分别以0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L的Erastin处理12 h后，与对照组相比，Erastin处理组细胞体积增大，出现空泡样变性，细胞边缘不规则，且有少量细胞脱落，细胞损伤程度随Erastin浓度升高而加重。见图3。

2.2.2 PI染色检测细胞死亡

采用流式细胞术结合PI染色检测Erastin处理后的人原代髓核细胞死亡情况。结果显示，与对照组比较，Erastin组PI阳性率升高(P＜0.01)，且随Erastin浓度升高(0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)而进一步上升，提示Erastin可有效诱导细胞死亡并呈一定剂量依赖性。见图4。

2.2.3 ROS水平检测

采用流式细胞术结合 DCFH-DA探针检测细胞内活性氧水平。结果显示，对照组细胞ROS阳性信号较弱；Erastin组随着浓度增加，ROS峰值逐渐右移(P＜0.05)，其中2 μmol/L组ROS强度约为对照组的2倍(P＜0.001)。提示Erastin刺激可提高细胞内氧化应激水平并促使铁死亡发生。见图5。

2.3 不同浓度萝卜硫素干预对细胞活力和抗氧化的影响

2.3.1 细胞活力

根据CCK-8检测结果，萝卜硫素2.5 μmol/L和5 μmol/L组的细胞相对吸光度值分别为1.00±0.03和1.00±0.04，与对照组(1.00±0.03)比较，差异无统计学意义(P=0.999，P=0.998)。萝卜硫素10 μmol/L组的相对吸光度值为1.02±0.04，与对照组差异无统计学意义(P=0.815)。萝卜硫素20 μmol/L和40 μmol/L组的相对吸光度值分别为0.83±0.05和0.69±0.06，低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.001，P＜0.001)。见图6A。

2.3.2 总抗氧化能力

根据T-AOC检测结果，萝卜硫素2.5 μmol/L组与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.9130)。萝卜硫素5 μmol/L组和10 μmol/L组的T-AOC值分别为1.08±0.03和1.12±0.04，均高于对照组(P=0.003，P＜0.001)。萝卜硫素20 μmol/L组和40 μmol/L组的相对T-AOC值分别为0.83±0.04和0.69±0.05，均低于对照组(P=0.002，P＜0.001)。见图6B。

2.4 <bold>Erastin</bold>与萝卜硫素联合处理对细胞死亡和活力的影响

2.4.1 PI⁺细胞比例分析

流式细胞术结果显示，Erastin处理组PI⁺细胞比例增加，表明Erastin诱导了较高的铁死亡水平。对照组(无Erastin和单独萝卜硫素处理) PI⁺细胞比例较低，为5.11%±0.04%。加入Erastin后，PI⁺细胞比例升高，为10.11%± 0.58%。加入萝卜硫素后，5 μmol/L组和10 μmol/L组的PI⁺细胞比例降低，分别为5.08%±0.44%和3.38%±0.32%，且10 μmol/L组的比例低于5 μmol/L组(P＜0.001)。这些结果表明，萝卜硫素能够抑制Erastin诱导的铁死亡，且10 μmol/L萝卜硫素对PI⁺细胞比例的抑制作用更强。见图7A、图7B。

2.4.2 Western blot检测Collagen Ⅱ、SLC7A11、GPX4蛋白表达

Western blot检测结果显示，对照组细胞中Collagen Ⅱ表达水平较高，GPX4、SLC7A11亦维持在较高水平；经Erastin(+)刺激后，Collagen Ⅱ表达有所下降，GPX4、SLC7A11表达下调，提示铁死亡发生并伴随细胞活力降低；加入萝卜硫素后(Erastin+萝卜硫素组)，上述蛋白表达均较Erastin组回升(P＜0.05)，提示萝卜硫素可逆转Erastin诱导的铁死亡并维持细胞活力；β-actin作为内参蛋白，在各组中表达稳定。见图8。

3 讨论

本研究的目的是分析萝卜硫素通过抗氧化机制对细胞活力的保护效果，并探讨其抑制Erastin诱导的髓核细胞铁死亡的作用。铁死亡作为一种铁依赖性程序性细胞死亡方式，被广泛认为与椎间盘退变密切相关，前期研究结果显示，Erastin处理能够增加髓核细胞内ROS水平，引发细胞死亡^[8-10]。本研究选择了常用的12 h刺激时间，并在刺激后观察到明显的细胞形态变化。Erastin诱导的髓核细胞损伤表现为细胞体积增大、形态改变、细胞死亡和ROS水平升高，表明Erastin通过诱导氧化应激促使髓核细胞发生铁死亡，与既往研究结果一致。最终我们选取了1 μmol/L Erastin作为本实验刺激浓度。

前期研究发现，萝卜硫素具有抗氧化作用，可减轻TNF-α诱导的Caco-2细胞单层透化和炎症^[6]，能够通过激活KEAP1-Nrf2通路增强抗氧化、减少炎症信号以治疗银屑病^[11]，还能够通过激活Nrf2保护肾^[12]。现有研究表明，抗氧化剂可以通过减少氧化应激，减轻细胞损伤和铁死亡。我们发现文献中大多使用10 μmol/L、20 μmol/L等浓度的萝卜硫素干预原代细胞，故在本实验中选取2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的浓度梯度验证髓核细胞的最适刺激浓度。我们发现萝卜硫素浓度达到20 μmol/L、40 μmol/L时，细胞的活力有所下降，推测可能是由于高浓度所产生的细胞毒性，或是由于0.2%、0.4% DMSO所造成的细胞毒性。故我们最终选择萝卜硫素5 μmol/L、10 μmol/L的刺激浓度。本研究中，萝卜硫素的干预(5 μmol/L和 10 μmol/L)有效提高了细胞的总抗氧化能力，减少了Erastin引起的细胞死亡。这验证了萝卜硫素可以增加细胞内抗氧化酶(如GPX4)的活性，减少了自由基的积累，抑制氧化应激。

Western blot实验进一步证实，萝卜硫素可增强Nrf2的表达，萝卜硫素通过降低Nrf2启动子初始15个CpGs的甲基化增强Nrf2的转录，还可以通过化学修饰Kelch样环氧氯丙烷(ECH)相关蛋白-1(Keap1)的半胱氨酸残基(主要是Cys151)，阻止Keap1和Nrf2的结合，进而阻断Nrf2的泛素化和降解，使Nrf2的积累和依赖Nrf2调控的下游基因转录增强^[13-14]。萝卜硫素能够有效逆转Erastin引起的细胞活力下降(Collagen Ⅱ)，并改善Erastin引起的GPX4、SLC7A11等铁死亡相关蛋白的下降，表明萝卜硫素不仅通过增强抗氧化能力保护细胞活力，还可能通过调节铁代谢相关蛋白抑制铁死亡的发生，这与既往研究结果一致^{[11, 15-16]}。这一机制也代表了萝卜硫素抑制椎间盘退变的潜力。

近年来，铁死亡作为一种新型的细胞死亡方式，已被广泛研究并被认为与多种疾病的发生发展密切相关。在椎间盘退变的研究中，铁死亡被认为是重要机制之一^{[5, 8]}，并作为缓解腰椎间盘退变的新型纳米材料的重要靶点^[17]。与其他抗氧化剂(如白藜芦醇、茶多酚等)相比，萝卜硫素以其较低的毒性，成为一种有良好临床应用前景的化合物^[18-19]。本研究中的数据与既往研究结果一致，表明萝卜硫素在抗氧化和抗铁死亡方面具有显著的保护效果^{[12, 14, 20-22]}。

此外，萝卜硫素的作用还可能与其对细胞内多种信号通路的调节有关，研究指出，萝卜硫素能够通过激活Nrf2通路，增强抗氧化酶的表达，从而提高细胞对氧化应激的耐受性^{[11, 16, 23-25]}。本研究的结果进一步验证了这一观点，提示萝卜硫素可能通过Nrf2信号通路调节下游GPX4、SLC7A11等相关抗氧化蛋白的表达，在后续实验中我们将继续明确在髓核细胞中萝卜硫素与Nrf2的关系，进一步阐述萝卜硫素对腰椎间盘髓核的保护作用。

本研究为萝卜硫素抑制髓核细胞铁死亡的作用提供了初步的实验依据，但存在一定局限。本研究主要在体外细胞模型中进行，尽管结果较为一致，但是否能够在体内模型中得到同样的效果仍需进一步验证。未来的研究应在动物模型中进一步验证萝卜硫素的作用，并评估其对椎间盘退变等疾病的潜在疗效。

铁死亡已被证实与多种疾病密切相关，尤其是椎间盘退变和神经退行性疾病。因此，寻找能够有效抑制铁死亡的方法具有重要的临床意义。萝卜硫素作为一种天然植物化合物，具有较低的毒性和较好的生物相容性，为其在临床中的应用提供了理论基础^[26]。未来的临床研究可以将萝卜硫素作为辅助治疗药物，用于铁死亡相关疾病的治疗，如椎间盘退变、阿尔茨海默病等^[27]。

综上所述，本研究揭示了萝卜硫素在椎间盘髓核细胞中的抗氧化能力，其能够抑制Erastin诱导的铁死亡，进而维持细胞活力。萝卜硫素作为一种天然化合物，具有良好的临床应用潜力，未来的研究应进一步探索萝卜硫素在动物模型中的临床效果。

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基金资助

省部级课题