基于基因突变的分子风险分层对甲状腺乳头状癌淋巴结转移的预测价值研究

Predictive value of gene mutations for lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma by using molecular risk group method

摘要

背景 甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)患者总体预后良好，但部分患者会发生淋巴结转移，如何预测PTC淋巴结转移仍缺乏有效手段。 目的 采用分子风险分层(molecular risk group，MRG)方法，探索PTC高危分子分型与淋巴结转移的相关性。 方法 采用二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)对2021年11月 — 2024年3月于解放军总医院第一医学中心甲状腺(疝)外科进行手术的PTC患者术后标本进行基因检测，对39种基因变异进行分子风险分层，同时收集患者的临床病理学资料，进行淋巴结转移关联因素的Logistic回归，并对MRG评估效能进行分析。 结果 共纳入74例PTC例患者，男性23例(31.1%)，女性51例(68.9%)；年龄17 ~ 69岁，发病年龄(40.16±12.59)岁。74例PTC患者完成177 panel基因联合检测，共检查出39种基因变异，其中SNV/Indel 37种，基因融合2种，基因变异率为100%，MRG高危分型38例(51.35%)，低危分型36例(48.65%)。MRG分型与甲状腺乳头状癌临床病理学特征的关系分析显示有被膜侵犯与MRG高危分型显著相关(P=0.035)。多因素Logistic回归结果显示，MRG高危分型是PTC患者淋巴结转移、中央区淋巴结转移、侧颈区淋巴结转移的独立危险因素(OR=3.080、2.545、1.443，P＜0.05)。配对四格表分析显示，患者MRG高危分型对淋巴结转移、中央区淋巴结转移、侧颈区淋巴结转移均有一定的评估效能(AUC=0.729、0.671、0.601)。统计推断显示，MRG高危分型与淋巴结转移/中央区淋巴结转移的关联性显著(P＜0.05)，但优势性亦全部显著(P＜0.05)，提示与金标准结果有一定差异。 结论 本研究利用分子风险分层方法揭示了MRG高危分型与PTC中央区淋巴结转移相关，MRG高危分型可能是预测PTC中央区淋巴结转移的潜在指标，可以为术前评估PTC患者是否存在中央区淋巴结转移提供新的方法。

Abstract

Background Patients with papillary thyroid carcinoma (PTC) generally have a favorable prognosis, but some may develop lymph node metastasis. However, effective methods for predicting lymph node metastasis in PTC are still lacking. Objective To explore the correlation between high-risk molecular subtypes of PTC and lymph node metastasis (LNM) by molecular risk group (MRG). Methods Genetic testing was performed using next-generation sequencing technology (NGS) on postoperative specimens of PTC patients who underwent surgery in the Department of Thyroid (Hernia) Surgery, the First Medical Center of PLA General Hospital from November 2021 to March 2024. Molecular risk stratification was performed for 39 genetic variants, while clinicopathological data of the patients were collected. Logistic regression analysis was conducted to identify factors associated with lymph node metastasis, and the predictive performance of the molecular risk gene (MRG) was evaluated. Results A total of 74 PTC patients were enrolled, including 23 males (31.1%) and 51 females (68.9%). The age ranged from 17 to 69 years, with a median age of (40.16±12.59) years. A total of 39 gene mutations were detected in 74 PTC patients, including 37 SNV/Indel and 2 fusion genes, with a mutation rate of 100%. MRG high-risk classification was found in 38 cases (51.35%) and low-risk classification in 36 cases (48.65%). The relationship between MRG classification and clinicopathological features of papillary thyroid carcinoma showed that the presence of capsular invasion was significantly related to MRG high-risk classification (P=0.035). Multivariate Logistic regression analysis showed that MRG high-risk classification was an independent risk factor for LNM/CLNM/LLNM in PTC patients (OR=3.080/2.545/1.443, P<0.05). Paired four-grid table analysis showed that MRG high-risk classification had a certain evaluation efficacy for lymph node metastasis, central lymph node metastasis and lateral cervical lymph node metastasis, and the AUC was 0.729, 0.671 and 0.601, respectively. Statistical inference showed that MRG high-risk classification was significantly associated with lymph node metastasis/central lymph node metastasis (P<0.05), but the dominance (difference test) was also significant (P<0.05), suggesting that it was different from the gold standard. Conclusion MRG high-risk classification is associated with central lymph node metastasis in PTC by molecular risk stratification method. MRG high-risk classification may be a potential indicator for predicting central lymph node metastasis in PTC, which is a new method for preoperative evaluation of central lymph node metastasis in PTC patients.

Graphical abstract

关键词

甲状腺乳头状癌 / 淋巴结转移 / 分子风险分层 / 中央区转移 / 二代测序

Key words

papillary thyroid carcinoma / lymph node metastasis / molecular risk group / central compartment metastasis / next-generation sequencing

甲状腺癌(thyroid carcinoma，TC)中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最为常见的类型，约占全部TC的90%^[1]。一般来说，PTC通过手术切除、内分泌综合治疗、放射性核素I¹³¹治疗等，预后总体良好。然而有一部分甲状腺癌仍表现出较强的侵袭性，包括甲状腺外侵犯、血管侵犯、淋巴结转移和远处转移等，其中最为常见的是淋巴结转移(lymph node metastasis，LNM)，约80%的乳头状癌患者可能出现颈部淋巴结转移，其中Ⅵ区淋巴结转移最为常见。发生淋巴结转移的患者复发率高达30%，严重影响患者的生存时间和生活质量^[2]。目前术前超声是检测甲状腺癌淋巴结转移的主要手段，但准确率有限。随着分子生物学技术的广泛应用，二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)已经成为肿瘤研究的重要手段，而基因突变作为甲状腺癌的重要驱动力，其与患者淋巴结转移之间的复杂关系也逐渐浮出水面。已有研究表明，BRAF V600E突变的PTC患者淋巴结转移的概率显著提高，可以作为PTC的潜力标记物。但也有研究表明BRAF V600E与淋巴结转移关联性不显著^[3-4]。由此可见，在一定程度上，分子水平检测能够预测淋巴结转移的发生，但仍具有一定的局限性和不确定性。近年来，分子风险分层(molecular risk group，MRG)已纳入第3版甲状腺细胞病理Bethesda报告系统(TBSRTC 2023)^[5-6]，但其在中国人群中的验证仍为空白。本研究运用NGS技术，对PTC患者进行基因检测，探讨MRG分型与我国PTC患者淋巴结转移之间的关系，为术前评估甲状腺乳头状癌是否存在淋巴结转移提供新的方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年11月 — 2024年3月在解放军总医院第一医学中心甲状腺(疝)外科进行手术的PTC患者。纳入标准：(1)接受外科手术治疗；(2)术前未针对肿瘤采取放疗、化疗的辅助治疗；(3)术后经病理或免疫组化检查证实为甲状腺乳头状癌；(4)结节≥1 cm，无远端器官转移，无其他部位肿瘤。排除标准：(1)合并其他甲状腺疾病；(2)合并其他原发恶性肿瘤；(3)临床资料不完整。本研究获解放军总医院医学伦理委员会批准(伦审第S2022-587-01号)，患者及家属均知情同意。

1.2 基因组DNA提取、文库构建和测序

文库构建：收集患者对应的癌组织，置入液氮中冷冻储存。对肿瘤样本核酸提取后进行文库构建，使用甲状腺癌NGS panel(上海睿璟生物科技有限公司)人甲状腺癌基因检测试剂盒(扩增测序法)进行测序文库的制备。文库经过纯化后，使用Qubit荧光定量仪(Thermo Fisher)测定浓度，在NovaSeq6000平台(Illumina)进行150 bp双端测序。试剂盒检测流程见图1。

1.3 生物信息学分析

生物信息学分析：使用Cutadapt(v1.18)去除原始测序reads两端的接头序列和低质量碱基。然后使用BWA(v0.7.17)将处理后的reads与人参考基因组(hg19)进行比对。通过VarScan2(v2.4.4)进行SNV/InDel分析，并用VEP对基因变异进行注释。基因融合采用自定义脚本基于融合转录本序列进行分析。

基因检测结果分子分层：参考Bethesda指南中的分组，将多基因分子检测结果分为MRG高危组和MRG低危组。MRG高危组包括驱动基因(BRAF V600E突变或RET融合)合并其他恶性突变类型(RAS、TERT、NTRK、TP53等突变)，其余归为MRG低危组。

1.4 统计学方法

统计分析均使用R (v 4.3.2)软件。对连续变量进行正态性检验(Shapiro-Wilk检验)，数据呈正态分布以x±s表示，组间比较采用t检验；数据呈非正态分布以M(IQR)表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；分类变量以例数(百分比)表示，组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验(当样本量较小或预期频数＜5时)。采用多因素Logistic回归分析评估MRG高危对甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的独立影响，并使用逐步回归法(向后选择法)进行变量筛选。采用配对四格表评估价值分析方法，ROC曲线分析MRG对各类淋巴结转移情况的评估/预测效能。本研究所有统计分析均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的临床信息及病理特征

被纳入的74例PTC患者，男性23例(31.1%)，女性51例(68.9%)；年龄17 ~ 69岁，发病年龄(40.16±12.59)岁。56例(75.68%)发生淋巴结转移，其中26例发生中央区合并侧颈区淋巴结转移，26例仅发生中央区淋巴结转移，4例仅发生侧颈区淋巴结转移。见表1。

2.2 基因变异检测结果及MRG分层

74例甲状腺乳头状癌患者完成177 panel基因联合检测，共检查出39种基因变异，其中SNV/Indel 37种，基因融合2种，基因变异率为100%。发生基因变异的病例中，66例发生BRAF V600E基因变异，变异率为89.2%，其中BRAF V600E单独突变20例(27.0%)，联合其他基因突变46例(62.1%)。KMT2C基因突变占比仅次于BRAF V600E，为14例(19.0%)。另外，检出5例融合变异(3例CCDC6-RET，1例NCOA4-RET，1例ETV6-NTRK)，且均不与BRAF V600E共同出现。基因变异检出、年龄、性别、淋巴结转移的瀑布图见图2。根据基因变异检出结果，74例样本按照MRG分型原则分组，有38例(51.35%)检测结果被归类为MRG高危组，36例(48.65%)检测结果被归为MRG低危组。

2.3 MRG分型与甲状腺乳头状癌临床病理学特征的关系

比较MRG高危与低危组的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤灶数、被膜侵犯情况、体质量指数(body mass index，BMI)、T分期情况，发现MRG高危组患者发生被膜侵犯概率更高(P=0.035)，提示MRG高危分型更可能导致被膜侵犯，其他因素均无统计学差异。见表2。

2.4 患者淋巴结转移与高危基因分型的关系——单因素分析

(1)按是否存在淋巴结转移分组比较：以是否存在淋巴结转移，将74例甲状腺乳头状癌患者分为无淋巴结转移组(n=18)和有淋巴结转移组(n=56)。比较发现，MRG高危组患者淋巴结转移比例更高，差异有统计学意义(P＜0.05)，但不同水平的BRAF V600E突变和联合突变组发生淋巴结转移的比例差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

(2)按是否存在中央区淋巴结转移分组比较：将74例甲状腺乳头状癌患者分为无中央区淋巴结转移组(n=22)和有中央区淋巴结转移组(n=52)。比较发现，MRG高危组患者中央区淋巴结转移比例更高，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示MRG高危分型患者更容易发生中央区淋巴结转移，但不同水平的BRAF V600E突变和联合突变组发生中央区淋巴结转移的比例差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

(3)按是否存在侧颈区淋巴结转移分组比较：将74例甲状腺乳头状癌患者分为无侧颈区淋巴结转移组(n=44)和有侧颈区淋巴结转移组(n=30)。比较发现，MRG高危组、BRAF V600E突变和联合突变组发生侧颈区淋巴结转移的比例差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表5。

2.5 患者淋巴结转移与高危基因分型的关系——多因素Logistic回归

由表3 ~ 表5知，MRG高危分型均与淋巴结转移关联(P＜0.05或P＜0.1)，故再进行多因素Logistic回归确认。因变量分别为淋巴结转移、中央区淋巴结转移、侧颈区淋巴结转移。自变量即MRG分型，并结合临床专家意见及表2，将有无被膜侵犯、超声发现异常淋巴结也作为自变量。回归采用逐步后退法(α_进=0.05，α_出=0.10)，结果显示MRG高危分型均是PTC患者淋巴结转移、中央区淋巴结转移、侧颈区淋巴结转移的独立关联因素(P＜0.05)。见表6、图3。

2.6 患者MRG高危分型对淋巴结转移的评估/预测效能

以病理结果为金标准(74例样本中，淋巴结转移56例，中央淋巴结转移52例，侧颈区淋巴结转移30例)，分别对MRG分型判断的结果(高危分型为阳性样本+，低危分型为阴性样本-)，进行配对四格表评估价值分析，结果见表7。对应的AUC图(单折点ROC曲线)见图4。由其知：MRG高危分型对淋巴结转移、中央区淋巴结转移、侧颈区淋巴结转移均有一定的评估效能(AUC=0.729、0.671、0.601)。MRG高危分型对淋巴结转移/中央区淋巴结转移的关联性显著(P＜0.05)，提示MRG高危确实能一定程度上反映/评估淋巴结转移/中央区淋巴结转移状况。但优势性(差异性检验)亦全部显著(P＜0.05)，提示与金标准结果有一定差异。

3 讨论

大多数PTC患者病灶较为局限，通过手术切除、内分泌综合治疗、放射性核素I¹³¹治疗等，预后总体良好，复发率相对较低。但若PTC发生了淋巴结转移，复发率会相对较高，淋巴结转移已被确定为PTC患者手术后出现复发的主要风险因素^[7-8]。目前，甲状腺切除手术和彻底合理的颈部淋巴结清扫是公认的治疗DTC的首选方法^[9]，而术前预测PTC是否存在淋巴结转移还缺少有效的分子分型指标。因此，研究探索PTC淋巴结状态的风险因素，发现更多的潜在预测指标，有助于外科医师评估患者病情进展，制定更加合理的个体化治疗方案，并确定是否需要预防性淋巴结清扫，进而提高患者的生存率和生活质量。本研究运用分子风险分层方法，发现MRG高危分型预测PTC淋巴结转移具有一定的有效性，可能成为术前评估PTC淋巴结转移的预测新指标。

目前，随着在分子水平上对甲状腺癌研究的不断深入，越来越多的基因突变被发现与甲状腺癌的发生、进展和侵袭有关，但单一基因的预测性能均存在争议。RAS基因是人类癌症中最常见的突变癌基因，其介导信号级联反应，可通过RAS-RAF-MEK-ERK通路或与PI3K/AKT通路的相互作用促进甲状腺肿瘤发生^[10]。Kakarmath等^[11]发现，RAS突变的患者发生淋巴结转移较少，认为其更倾向于惰性。而Ma等^[12]研究发现NRAS可能是cN0甲状腺滤泡癌中央区淋巴结转移的独立因素(P＜0.001)。BRAF V600E突变在甲状腺癌中极为常见，约占所有BRAF突变的99%，在我国PTC患者中发生率最高可达90%以上^[13]。Qu等^[14]对413例PTC患者的临床病理信息进行回顾性分析发现，BRAF V600E突变与中央区淋巴结转移有关。Ji和Shi^[15]进行的一项Meta分析认为，BRAF突变是cN0 PTC中CLNM的重要预测因子(OR=2.02，95% CI：1.57 ~ 2.59)，然而BRAF突变在cN0 PTC中预测CLNM的性能并不理想。Chen等^[16]研究发现，TERT突变是PTC患者预后不良的独立预测因素，而BRAF V600E突变的预测价值尚无定论，但TERT启动子突变与BRAF突变同时存在时，与单一突变的患者相比，不良后果的风险明显更高。Li等^[17]研究发现TERT突变与淋巴结转移无显著相关性(P=0.33)，但具有显著的异质性。TP53是一种抑癌基因，有研究表明约26%的甲状腺低分化癌和约80%的甲状腺未分化癌存在TP53基因突变^[18]。TP53基因突变在甲状腺癌进展中的作用更倾向于晚期改变。Novis等^[19]在一项前瞻性研究中发现，TP53缺失是晚期甲状腺癌的特征，与患者总生存期相关。Morita等^[20]研究发现，原发性肿瘤、较大肿瘤中P53基因表达、淋巴结转移的存在与淋巴结转移的平均数量之间存在显著相关性。此外，Abdelhafez等^[21]表明，P53是否突变与肿瘤大小和T分期显著相关。然而，Shin等^[22]研究结果表明，P53蛋白过表达与PTC的临床病理特征(包括年龄、性别、肿瘤大小、多样性、淋巴结转移和甲状腺外侵犯等)之间无显著相关性。NTRK基因融合是肿瘤的致癌驱动因素，但在甲状腺癌患者中检出率较低(2.2% ~ 2.3%)^[23]。Kerr等^[24]在NTRK基因重排甲状腺癌中发现了多态性、远处转移和侵袭性等特征，提示NTRK基因改变可能具有一定的诊断潜力。董文彦等^[25]的研究提示，目前很难确定NTRK融合蛋白在甲状腺癌中的细胞和组织特异性表达模式，可能是因为样本量的限制或NTRK融合蛋白的多样性。

从以上研究结果中可以看出，单基因突变或基因联合变异预测甲状腺乳头状癌淋巴结转移有一定争议。而在本研究入组病例中，未检测出RAS基因突变，TP53、TERT、NTRK基因突变检出率较低但患者均发生淋巴结转移；BRAF V600E基因突变在转移与未转移组中占比相近(87.5% vs 94.4%)，这个结果也可能是因样本中BRAF V600E突变率过高导致统计效能不足。基于本研究入组患者基因突变情况，我们把检测结果分为联合突变组(co-mutation组)和非联合突变组，分析发现其与淋巴结转移、中央区淋巴结转移和侧颈区淋巴结转移均无相关性，因此基于本研究基因检测结果的解读需要采用更为新颖的方法。在美国甲状腺协会指南中，BRAF V600E和TERT是PTC的高危影响因素；在甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南(第2版)中，将多基因检测结果提示病灶携带高危突变组合，如BRAF V600E/RAS变异合并TERT或TP53变异、RAS变异合并EIF1AX变异等，定义为DTC的高危初始复发风险分层^[26]。这提示我们，可以采用分子风险分层方法对多基因检测结果进行更为科学合理的分类和解读。

甲状腺癌风险分层定义由来已久^[27-28]。MRG概念收录于2023年的TBSRTC指南，但并没有基于我国人群的MRG分子分型与淋巴结转移相关性的研究。在TCGA研究中，提出了RAS-like和BRAF-like的分子分型可对PTC的恶性程度做出分类的观点^[29]。此分型观点也被收录于2022年最新版的WHO指南中。Steward等^[30]将检测到的多种基因变异分子事件分为5组分型(高危、BRAF-like、RAS-like、CNAs和基因表达改变)，Yip等^[31]在其基础上，提出低、中、高三分层的MRG，低风险MRG包括作为唯一事件出现的RAS和RAS-like改变，中危MRG包括BRAF V600E、其他BRAF类改变和CNA，高危MRG包括1个早期突变和1个晚期突变(TERT、TP53、AKT1和PIK3CA)。MRG概念提出后，多篇文章基于此做了研究，并于2023年收录于TBSRTC指南中：肿瘤的分子特征与预后之间的关系已被充分描述，因此可将肿瘤分为低、中和高分子风险分层^[6]。通常，低分子风险组以单个RAS突变或RAS-like变异为代表；中分子风险组包括BRAF V600E突变、其他BRAF-like变异或拷贝数改变；高分子风险组的特征是同时出现上述1种驱动基因改变以及TERT、TP53、AKT1和(或) PIK3CA等基因的突变；这一分型有助于鉴别出甲状腺癌不同的预后风险。TCGA提出的BRAF-like分型侧重转录组特征，而MRG高危分型更强调驱动基因的叠加突变，两者在风险分层逻辑上存在差异。基于MRG分子分型规则，本研究对177 panel检出的结果做了风险分层，并初步探索验证了分子风险分层与淋巴结转移的相关性，在多因素Logistic回归分析中发现，MRG高危分型是淋巴结转移、中央区淋巴结转移、侧颈区淋巴结转移的独立关联因素，但MRG高危分型与侧颈区淋巴结转移在预测、评估效能检验中一致性较差，并且单因素分析中MRG高危分型与侧颈区淋巴结转移的相关性无统计学意义，这可能也与分组后样本量降低有关。因此MRG高危分型可能是中央区淋巴结转移的预测指标，尚不能作为侧颈区淋巴结转移的预测指标。本研究结果提示，对确诊甲状腺乳头状癌的患者术前进行NGS检测，如结果为MRG高危分型，可以考虑手术时行预防性中央区淋巴结清扫术。而MRG低危分型患者是否可以考虑不进行预防性清扫，由于本研究样本量、时间跨度、取材选择等限制，尚不明确，我们下一步将开展多中心、大样本分析进一步论证。

本研究基于本中心病例样本验证MRG分型与PTC患者淋巴结转移的相关性，对运用NGS技术检测PTC的基因突变结果分型提出了更科学合理的方案，为我国人群MRG的临床应用提供了数据支持。本研究的局限性：(1)入组患者较少且分组并不均衡，一些因素没有相关性，可能是受样本数量的影响；(2)单中心研究，且样本较少、时间跨度过短，单中心、小样本设计可能导致选择偏倚。下一步需要开展多中心研究，验证MRG分型在更大样本中的普适性，并探索其与RAS、TERT、TP53、NTRK等基因突变的协同效应。

综上所述，本研究发现MRG高危分型可以作为PTC患者中央区淋巴结转移的独立关联因素，在临床诊疗中，有望成为术前评估甲状腺癌患者是否存在淋巴结转移的潜力指标。

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