磷酸丙糖异构酶1对不同类型肺癌细胞生物学功能的影响

Effects of Triosephosphate isomerase 1 on biological functions of different types of lung cancer cells

摘要

背景 磷酸丙糖异构酶1(triosephosphate isomerase 1，TPI1)与多种肿瘤的发生发展密切相关，但其在肺癌中作用的研究尚不充分。 目的 探讨TPI1在不同类型肺癌细胞系中的表达水平及生物学功能。 方法 应用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库，通过生物信息学分析TPI1在肺腺癌和鳞癌组织中的表达；采用qPCR和Western blot检测TPI1在不同肺癌细胞系中的表达。采用慢病毒稳定感染技术分别建立肺腺癌细胞A549、肺鳞癌细胞Calu1和肺大细胞癌细胞95D的TPI1敲低细胞株，通过mRNA水平验证敲低效率。分别采用CCK-8法、黏附实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭能力和细胞周期。应用普通转录组测序技术和KEGG通路富集分析初步探索可能的机制。 结果 生物信息学分析显示，与正常肺组织相比，TPI1在肺腺癌和肺鳞癌组织中表达上调(P＜0.05)；与肺泡上皮细胞系HPAEpic相比，肺腺癌细胞系A549、肺鳞癌细胞系Calu1和肺大细胞癌细胞系95D中TPI1在mRNA水平和蛋白水平均呈高表达(均P＜0.05)，肺小细胞癌细胞系H446中TPI1在mRNA水平呈低表达(P＜0.05)、在蛋白水平的表达无统计学差异(P＞0.05)。在A549、Calu1和95D细胞中敲低TPI1后，细胞增殖、黏附、迁移和侵袭能力均下降，细胞周期发生G0/G1期阻滞(均P＜0.05)。KEGG通路富集分析结果显示，差异基因显著富集在PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路。 结论 TPI1在肺腺癌A549、肺鳞癌Calu1和肺大细胞癌95D细胞系中高表达，可能通过PI3K/AKT和MAPK信号通路调控细胞增殖、黏附、迁移、侵袭及周期，推动肺癌的发展。

Abstract

Background Triosephosphate isomerase 1 (TPI1) is closely associated with the development of various tumors, but its role in lung cancer has not been fully investigated. Objective To explore the expression levels and biological functions of TPI1 in different types of lung cancer cell lines. Methods The expression of TPI1 in lung adenocarcinoma and squamous carcinoma tissues was analyzed using bioinformatics from the TCGA database. Quantitative PCR and Western blotting were employed to detect TPI1 expression in various lung cancer cell lines. Lentivirus-mediated stable infection technology was used to establish TPI1 knockdown cell lines in lung adenocarcinoma A549 cells, squamous carcinoma Calu1 cells, and large cell lung cancer 95D cells. The knockdown efficiency was verified at the mRNA level. Cell proliferation, adhesion, migration, invasion, and cell cycle were assessed by CCK-8 assay, adhesion assay, scratch assay, Transwell assay, and flow cytometry, respectively. RNA sequencing and KEGG pathway enrichment analysis were applied to explore potential mechanisms. Results Bioinformatics analysis showed that, compared to normal lung tissues, TPI1 expression was upregulated in lung adenocarcinoma and squamous carcinoma tissues (P<0.05). Compared to the alveolar epithelial cell line HPAEpic, TPI1 was highly expressed at both the mRNA and protein levels in lung adenocarcinoma A549, squamous carcinoma Calu1, and large cell lung cancer 95D cell lines (all P<0.05), while TPI1 expression was low at the mRNA level in the small cell lung cancer H446 cell line (P<0.05), with no significant difference at the protein level (P>0.05). After TPI1 knockdown in A549, Calu1, and 95D cells, cell proliferation, adhesion, migration, and invasion abilities were significantly decreased, and cell cycle arrest occurred in the G0/G1 phase (all P<0.05). KEGG pathway enrichment analysis revealed that differentially expressed genes were significantly enriched in the PI3K/AKT and MAPK signaling pathways. Conclusion TPI1 is highly expressed in lung adenocarcinoma A549, squamous carcinoma Calu1, and large cell lung cancer 95D cell lines, and may regulate cell proliferation, adhesion, migration, invasion, and cell cycle through the PI3K/AKT and MAPK signaling pathways, promoting lung cancer development.

Graphical abstract

关键词

肺癌 / 磷酸丙糖异构酶1 / 细胞增殖 / 细胞迁移 / 细胞周期

Key words

lung cancer / triosephosphate isomerase 1 / cell proliferation / cell migration / cell cycle

肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，全球每年约有220万肺癌新发病例和179万肺癌死亡病例^[1]。肺癌早期缺乏明显的临床症状，且具有易转移、耐药性强的特点，大大增加了诊疗的难度，肺癌患者的整体预后较差^[2]。目前，肺癌发生和发展的机制不完全明确，探索相关分子的作用和机制，可为肺癌的诊疗提供助力。

磷酸丙糖异构酶1(triosephosphate isomerase 1，TPI1)是由两个相同亚基构成的同型二聚体蛋白质，在糖酵解过程中促进磷酸二羟丙酮与3-磷酸甘油醛的相互转化，参与肿瘤细胞的增殖、迁移扩散等生物学过程^[3-4]。TPI1的表达异常与多种恶性肿瘤的发生和发展相关^[5-6]，但其在肺癌中作用的研究较少。本研究通过生物信息学分析和细胞实验，对TPI1在肺癌组织和不同类型肺癌细胞系中的表达和生物学功能及潜在的分子机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、试剂与仪器

肺泡上皮细胞系HPAEpic、肺腺癌细胞系A549、肺鳞癌细胞系Calu1和肺小细胞癌细胞系H446均购自中国医学科学院细胞中心，肺大细胞癌细胞系95D取自解放军总医院第一医学中心病理科。1640培养基(HY1640，TBD)，F12-K培养基(C11330500BT，Gibco)，DMEM培养基(11965092，Gibco)，胰蛋白酶(T1300，索莱宝)，胎牛血清(10099141，Gibco)，RIPA裂解液(C1053，普利莱)，BCA蛋白定量试剂盒(P1511，普利莱)，CCK-8(C0038，碧云天)、细胞黏附试剂盒(BB-48120，贝博)，细胞周期检测试剂盒(KGA9101-20，江苏凯基)，TPI1抗体(A303-755A-T，Invitrogen)，GAPDH抗体(PA1-987，Invitrogen)，山羊抗兔IgG(ZB-2301，中杉金桥)，山羊抗小鼠IgG(ZB-2305，中山金桥)，倒置荧光显微镜(Olympus)，37℃恒温培养箱(Thermo)，Illumina HiSeq测序仪(Novogene)。

1.2 生物信息学分析

从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库下载1 043例肺腺癌和鳞癌组织样本以及110例正常肺组织样本的RNA测序数据。通过R软件(v 3.6.3)处理所得数据，使用Limma包分析TPI1在肺癌中的差异表达。

1.3 细胞培养与传代

HPAEpic、95D和H446细胞使用1640培养基，A549细胞使用F12-K培养基，Calu1细胞使用DMEM培养基，均添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，于5% CO₂、37℃孵箱中培养。待细胞达到80%融合度时进行传代等操作。

1.4 短发夹<bold>RNA(shRNA)</bold>慢病毒感染肺癌细胞及分组

慢病毒分为TPI1敲低慢病毒Lenti-GFP-Puro shRNA TPI1和对照慢病毒Lenti-GFP-Puro shRNA.ctl，根据干扰靶点的不同，TPI1敲低慢病毒分为a、b、c、d、e五株。分别检测其敲低效率后选择敲低效率最高，同时细胞状态最好的1株进行后续实验。胰酶消化对数生长期、状态良好的肺癌细胞，400 g离心5 min后弃上清，用1 mL完全培养基重悬细胞，调整密度为2 × 10⁶/mL。用慢病毒分别感染A549、Calu1和95D细胞(感染复数MOI=20)。分别提取被感染细胞的总RNA，通过qPCR验证TPI1敲低效率。将所得细胞分为A549-NC和A549-shTPI1组、Calu1-NC和Calu1-shTPI1组、95D-NC和95D-shTPI1组(其中NC表示对照组，shTPI1表示TPI1敲低组)。

1.5 <bold>qPCR</bold>检测<bold>TPI1 mRNA</bold>水平的表达

Trizol法提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，上机扩增检测TPI1基因的表达，β-actin作内参。引物由北京泉熙特生物科技有限公司合成，序列如下。β-actin引物序列：正向5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；反向5’-CTCCTTAATGTCTATCCAGGC-3’；TPI1引物序列：正向5’-CTCATCGGCACTCTGAACG-3’；反向5’-GCGAAGTCGATATAGGCAGTAGG-3’。扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性3 s、60℃退火1 min，循环40次。使用2^-ΔΔCt法对所得数据进行分析。

1.6 <bold>Western blot</bold>检测<bold>TPI1</bold>蛋白水平的表达

使用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。按30 μg/孔的蛋白量进行SDS-PAGE凝胶电泳以分离蛋白，随后将蛋白湿转至PVDF膜。PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的封闭液中室温封闭1 h后，分别加入TPI1(1∶1 000)、GAPDH(1∶6 000)抗体，4℃孵育过夜。第2天1 × TBST洗膜10 min × 3次后，加入相应二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。再次洗膜10 min × 3次后滴加发光液进行避光显影，曝光拍照。使用Image J处理分析蛋白条带灰度值，并以GAPDH条带灰度值为对照计算TPI1的相对蛋白表达量。

1.7 <bold>CCK-8</bold>法检测细胞增殖能力

胰酶消化处在对数生长期的A549-shTPI1、Calu1-shTPI1、95D-shTPI1及各自对照组细胞，制成细胞悬液，并调整浓度为5 × 10⁴/mL，接种于96孔板。设置24 h、48 h、72 h、96 h、120 h共5个检测点，每组细胞做5个复孔。检测时弃去对应分组的旧培养基，加入配好的CCK-8试剂(完全培养基∶CCK-8溶液=10∶1)，1 h后测量450 nm波长处吸光度。

1.8 黏附实验检测细胞黏附能力

提前12 h用纤连蛋白包被96孔板；胰酶消化处在对数生长期的A549-shTPI1、Calu1-shTPI1、95D-shTPI1及各自的对照组细胞，按1 × 10⁵/孔接种于96孔板，每组设5个复孔。5% CO₂、37℃条件下孵育2 h后洗涤并加入新鲜的基础培养基，再次孵育4 h后加入CCK-8溶液，检测细胞在450 nm波长处吸光度。

1.9 划痕实验检测细胞迁移能力

将处在对数生长期的A549-shTPI1、Calu1-shTPI1、95D-shTPI1及各自的对照组细胞用胰酶消化，均匀铺到6孔板中，置于5% CO₂、37℃孵箱中培养。待细胞融合度达到80% ~ 90%时，使用200 μL移液器枪头在孔内过孔心画一条直线。用1 × PBS洗掉脱落细胞，加入基础培养基后分别于0 h、6 h、12 h、18 h和24 h在倒置显微镜下拍照。

1.10 <bold>Transwell</bold>实验检测细胞侵袭能力

将基础培养基和Matrigel胶按1∶4比例稀释，在Transwell小室的每个上室中铺入20 μL Matrigel胶。将胰酶消化后的A549-shTPI1、Calu1-shTPI1、95D-shTPI1及各自的对照组细胞用基础培养基重悬，按5 × 10⁴/孔接种于上室，下室每孔加入600 μL完全培养基。将上室重新放回24孔板中继续培养24 h后用0.5%结晶紫染液固定染色30 min，清水洗去结晶紫染液，晾干后在倒置显微镜下拍照，使用Image J软件计算穿过小室小孔的细胞数目。

1.11 流式细胞术检测细胞周期

胰酶消化处在对数生长期的A549-shTPI1、Calu1-shTPI1、95D-shTPI1及各自的对照组细胞，以1 × 10⁵/孔接种于6孔板。观察到细胞再次生长至对数期时，将其消化后置于1.5 mL离心管中并加入75%乙醇固定，置于4℃冰箱过夜。第2天400 g离心5 min弃上清，经1 × PBS洗涤后每管加入500 μL PI/RNase反应液，常温避光孵育30 min，随后上机检测细胞周期。使用Flowjo10.8.1软件对所得数据进行分析。

1.12 普通转录组测序及数据分析

分别提取95D-NC细胞和95D-shTPI1细胞的总RNA，对RNA样品的纯度、浓度和完整性进行严格质控后，使用Illumina HiSeq测序仪(Novogene)进行测序。使用HISAT2 (v2.0.5)、featureCounts (v1.5.0-p3)和DESeq2 (v1.20.0)等软件将高质量读段与参考基因组比对，计算每百万映射读段转录物的每千碱基片段数值，并对两组之间的差异基因表达水平进行分析。使用clusterProfiler (v3.8.1)软件进行差异表达基因的KEGG通路富集分析。

1.13 统计学分析

采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 9等软件对实验结果进行统计分析及可视化。符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较使用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析<bold>TPI1</bold>在肺腺癌和鳞癌组织中的表达

通过TCGA数据库分析TPI1在肺腺癌和鳞癌配对组织及非配对组织中的表达。结果表明，与正常肺组织相比，TPI1在肺腺癌和肺鳞癌组织中表达上调，差异有统计学意义(均P＜0.05)。见图1。

2.2 <bold>TPI1</bold>在肺癌细胞系中的表达

与肺泡上皮细胞系HPAEpic比较，肺腺癌细胞系A549、肺鳞癌细胞系Calu1和肺大细胞癌细胞系95D中TPI1在mRNA和蛋白水平均呈高表达，差异有统计学意义(均P＜0.05)；肺小细胞癌细胞系H446中TPI1在mRNA水平呈低表达(P＜0.05)，在蛋白水平表达无统计学差异(P＞0.05)。见图2。

2.3 慢病毒感染肺癌细胞效果验证

qPCR结果显示，A549、Calu1和95D细胞感染TPI1敲低慢病毒后，TPI1的mRNA表达水平降低。根据敲低效率和细胞状态，选择A549-shTPI1-b、Calu1-shTPI1-b和95D-shTPI1-e用于后续实验。见图3。

2.4 <bold>TPI1</bold>对肺癌细胞生物学功能的影响

2.4.1 TPI1对肺癌细胞增殖能力的影响

CCK-8实验显示，与对照组比较，A549、Calu1和95D TPI1敲低组细胞在450 nm处的吸光度值下降，差异有统计学意义(均P＜0.05)；提示敲低TPI1后，肺癌细胞的增殖能力减弱。见图4。

2.4.2 TPI1对肺癌细胞黏附能力的影响

黏附实验结果显示，与对照组比较，A549、Calu1和95D TPI1敲低组的细胞黏附率降低，差异有统计学意义(均P＜0.05)。提示敲低TPI1后肺癌细胞的黏附能力减弱。见图4。

2.4.3 TPI1对肺癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与对照组比较，A549、Calu1和95D TPI1敲低组的细胞划痕愈合速度降低，差异有统计学意义(均P＜0.05)。表明敲低TPI1后肺癌细胞的迁移能力下降。见图5。

2.4.4 TPI1对肺癌细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，A549、Calu1和95D TPI1敲低组细胞穿过基质胶和小室小孔的数量低于对照组，差异有统计学意义(均P＜0.05)；提示敲低TPI1后肺癌细胞的侵袭能力下降。见图5。

2.4.5 TPI1对肺癌细胞细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，与对照组比较，敲低TPI1后A549、Calu1和95D细胞的G0/G1期占比均升高，差异有统计学意义(均P＜0.05)；提示敲低TPI1后，肺癌细胞被阻滞在G0/G1期。见图6。

2.4.6 TPI1通过PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路调控肺癌细胞的生物学功能

普通转录组测序结果显示，95D-shTPI1细胞与95D-NC细胞相比，共鉴定出7 775个差异基因，其中上调基因4 325个，下调基因3 450个(|log2FoldChange|≥2.0，P_adj＜0.05)(图7A)。KEGG通路富集分析结果显示，差异基因显著富集在PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路(图7B)。

3 讨论

肺癌是全球范围内发病率逐年上升的恶性肿瘤之一^[7]。肺癌相关分子及靶向研究有助于提高肺癌诊断和治疗的准确性、及时性、有效性。由于肿瘤细胞的生长生存高度依赖糖酵解，TPI1作为糖酵解中的关键分子，与肿瘤的发生发展密切相关，已成为目前的研究热点^[8]。多项研究表明，TPI1作为一种促癌基因，在胃癌、结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达异常，且与肿瘤分期和临床预后等相关^[9-11]。

本研究聚焦TPI1基因，系统揭示了其在非小细胞肺癌多亚型中的调控作用及分子机制。本文的创新性发现主要有以下几个方面。

(1)在疾病特征层面：本研究通过整合TCGA数据库分析和多细胞系实验验证，证实了TPI1在肺腺癌、鳞癌及大细胞癌中均呈现高表达特征。这一发现突破了既往研究多局限于肺腺癌这一单一亚型的状况，提示TPI1可能作为非小细胞肺癌广谱性分子标志物。TPI1的表达水平与肺癌细胞的恶性表型呈现关联，当通过稳定敲低技术降低肺癌细胞中TPI1的表达后，肺癌细胞不仅增殖能力受限，其黏附、迁移和侵袭等转移相关特性也发生衰减。这种多维度表型的同步抑制现象，提示TPI1可能处于肺癌恶性进展调控网络的核心节点。

(2)在细胞增殖层面：细胞增殖是细胞维持生命活动的关键环节，在肿瘤的发生发展中尤为重要。本研究发现，敲低TPI1抑制了肺癌细胞的增殖能力。TPI1作为糖酵解途径中的重要酶，其功能缺失可能导致能量代谢紊乱，从而限制肿瘤细胞的快速增殖。

细胞黏附是通过表面分子相互作用实现细胞间或与胞外基质连接的过程，在肿瘤的发生发展中扮演关键角色^[12]。研究表明，肿瘤细胞黏附特性的改变赋予了其侵袭性和迁移性表型，涉及肿瘤进展的各个阶段，包括从原发部位脱离、进入血液循环、外渗及在远端器官形成继发性病变等^[13]。因此，细胞黏附被认为是决定肿瘤细胞侵袭性和转移性的关键因素。本研究发现，敲低TPI1后，肺癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力均下降。Liu等^[14]的研究也报道了类似现象，其发现敲除肺腺癌细胞(A549/H1299)的TPI1后，细胞迁移和集落形成能力显著降低。

细胞增殖能力的变化通常伴随细胞周期的改变^[15]。本研究流式结果显示，敲低TPI1后，肺癌细胞被阻滞在G0/G1期。G0/G1期是DNA合成前期^[16]，其阻滞导致S期进行DNA合成和复制的细胞数目减少，从而降低了细胞增殖能力^[17]。

(3)在机制层面，普通转录组测序和KEGG通路分析的结果显示，差异基因显著富集在PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路，提示TPI1可能通过上述信号通路调控肺癌细胞的生物学功能。

PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一，参与细胞的生长、增殖、代谢等多种生物学过程^[18]。PI3K/AKT信号通路与多种疾病的发生发展密切相关，尤其是肿瘤，其异常激活可促进肿瘤细胞的生存、增殖和转移，是癌症治疗的重要靶点^[19]。MAPK信号通路主要由三级激酶级联反应构成，即MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)和MAPK。该通路有多个分支，包括ERK、JNK、p38和ERK5等^[20]。MAPK信号通路的异常激活与多种疾病的发生发展有关，如癌症、炎症性疾病和神经退行性疾病等。

此外，针对临床应用，本研究结果提示，选择性抑制TPI1可能产生双重获益，既可阻断肿瘤细胞的能量供给，又可下调关键促癌信号通路活性。

本研究存在一定的局限性，敲低TPI1后肺癌细胞生物学功能改变的可能机制仍需进一步验证，同时需增加研究维度，模拟更精准、更复杂的肿瘤环境，对TPI1进行更加全面和深入的研究。

综上所述，TPI1在肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌细胞中高表达，敲低TPI1可使肺癌细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力下降，细胞周期发生G0/G1期阻滞。上述生物学功能的改变可能是TPI1通过PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路调控的。TPI1可能是肺癌发生发展过程的关键基因之一，有望成为肺癌的潜在诊断标志物、治疗靶点及预后评估指标，为肺癌的临床诊疗实践提供助力。

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基金资助

首都卫生发展科研专项项目(首发2020-1-5011)