氨基酸代谢抑制剂V9302对胃癌恶性进展及糖酵解效应的影响与机制研究

Effect of amino acid metabolism inhibitor V9302 on malignant progression and glycolytic reprogramming of gastric cancer and its mechanisms

摘要

背景 胃癌是全球范围内致死率较高的恶性肿瘤之一，治疗面临诸多挑战。V9302是一种靶向氨基酸转运蛋白ASCT2的抑制剂，能够有效抑制多种肿瘤细胞的生长和代谢，但尚不明确其在胃癌中的具体功能及潜在机制。 目的 研究氨基酸代谢抑制剂V9302对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及对胃癌细胞糖酵解的调控。 方法 Western blot筛选ASCT2表达较高的胃癌细胞系，检测胃癌细胞糖酵解关键酶表达。体外细胞实验检测胃癌细胞增殖和迁移能力。蛋白组学分析检测V9302处理下胃癌细胞差异表达蛋白，酶标比色法检测胃癌细胞糖酵解效应。构建裸鼠皮下荷瘤模型研究V9302对胃癌裸鼠体内瘤体的作用。 结果 AGS、MGC-803细胞系中的ASCT2表达程度较高。V9302能够抑制胃癌细胞的增殖能力(P＜0.01)和迁移能力(P＜0.01)。V9302干预胃癌AGS细胞糖酵解进程的调控。V9302增强胃癌细胞的糖酵解效应(ATP相对产生量：P＜0.05；丙酮酸相对产生量：P＜0.01；葡萄糖相对摄取率：P＜0.05；乳酸相对产生量：P＜0.01)，并且未改变糖酵解关键酶活性。V9302在裸鼠体内抑制胃癌瘤体生长(P＜0.05)，抑制裸鼠体内胃癌细胞Ki-67抗原、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达(PCNA：P＜0.001；Ki-67：P＜0.01)，促进胃癌细胞末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记表达(P＜0.001)。 结论 V9302在体内外条件下抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力，促进胃癌细胞凋亡。V9302通过干预胃癌AGS细胞糖酵解进程，增强胃癌细胞的糖酵解效应。

Abstract

Background Gastric cancer (GC) is one of the most lethal malignancies worldwide, with significant therapeutic challenges. V9302, an inhibitor targeting the alanine-serine-cysteine transporter 2 (ASCT2), has been shown to suppress tumor growth and metabolism in various cancers; however, its functional roles and mechanisms in GC remain poorly understood. Objective To investigate the effects of V9302 on malignant behaviors and glycolytic regulation in GC cells. Methods ASCT2-high-expressing GC cell lines (AGS and MGC-803) were screened by Western blot (WB). The expression of key glycolytic enzymes, including hexokinase 2 (HK2), phosphoglycerate mutase 1 (PGAM1), and enolase 1 (ENO1), was analyzed. Cell proliferation and migration were evaluated using CCK-8, colony formation, scratch wound healing, and Transwell assays. Proteomic profiling and bioinformatic analysis were performed to identify differentially expressed proteins in V9302-treated cells. Glycolytic activity was assessed by measuring glucose uptake, ATP production, pyruvate levels, and lactate secretion. A subcutaneous xenograft model in nude mice was established to evaluate the antitumor effects of V9302 in vivo. Results AGS and MGC-803 cells exhibited high ASCT2 expression. V9302 significantly inhibited GC cell proliferation (P < 0.01) and migration (P < 0.01). Proteomic analysis revealed that V9302 modulated glycolytic regulatory pathways in AGS cells. V9302 enhanced glycolytic flux, as evidenced by increased ATP production (P < 0.05), pyruvate accumulation (P < 0.01), glucose uptake (P < 0.05), and lactate secretion (P < 0.01), without altering the activity of key glycolytic enzymes. In vivo, V9302 suppressed tumor growth (P < 0.05), reduced Ki-67 (P < 0.01) and PCNA (P < 0.001) expression, and promoted apoptosis (TUNEL, P < 0.001). Conclusion V9302 inhibits proliferation, migration, and induces apoptosis in GC cells both in vitro and in vivo. Mechanistically, V9302 enhances glycolytic activity by targeting metabolic regulatory networks, independent of canonical enzyme-driven pathways. These findings provide a theoretical basis for combining V9302 with glycolysis inhibitors to overcome metabolic adaptation in GC therapy.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / 肿瘤代谢 / V9302 / 糖酵解 / 谷氨酰胺

Key words

gastric cancer / tumor metabolism / V9302 / glycolysis / glutamine

胃癌是当今全球常见恶性肿瘤之一，发病率和病死率均居于恶性肿瘤前列^[1]。我国胃癌发病率和病死率均高于世界平均水平，治疗和预防都面临巨大挑战^[2-3]。由于胃癌肿瘤异质性强、易发生耐药及免疫逃逸，现有针对进展期胃癌的治疗手段获益有限^[4-6]。积极寻找新的胃癌治疗策略和潜在治疗靶点具有重要意义。

随着对肿瘤细胞特有代谢模式的深入认识，开发针对肿瘤代谢的治疗手段成为现代医学的探索方向之一^[7-8]。肿瘤细胞对于谷氨酰胺的高度依赖，使靶向谷氨酰胺代谢成为一种潜在的癌症治疗方向^[9-11]。ASCT2是谷氨酰胺摄取的主要转运蛋白，ASCT2药理学抑制剂或短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)介导的ASCT2敲低抑制谷氨酰胺摄取被证明可以成功抑制多种肿瘤类型的癌细胞生长和增殖，包括胃癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等^[12-14]。然而，肿瘤微环境中错综复杂的代谢交互网络和代谢适应机制为这一治疗策略带来了困难，单一的靶向代谢疗法对肿瘤的杀伤和抑制效果往往有限，这也是靶向代谢药物未能在临床广泛应用的主要原因^[15-16]。有氧糖酵解为肿瘤细胞提供快速能量、生物合成原料等，在肿瘤细胞的生存进展中至关重要；有研究表明，限制肿瘤细胞的谷氨酰胺摄取会引发肿瘤细胞的代谢重编程，通过增强有氧糖酵解，以适应谷氨酰胺匮乏的环境，可降低靶向谷氨酰胺的抗癌效果^[17]。V9302是一种高效型谷氨酰胺摄取抑制剂，通过竞争性结合ASCT2抑制肿瘤细胞的代谢和生长。对比其他靶向谷氨酰胺代谢药物，V9302显示出更好的抑癌效果^[18]。研究表明，V9302在乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表现出良好的抑癌效果，而其在胃癌中作用的研究较为匮乏，尚不明确其在胃癌治疗中的潜在能力^[19-21]。本研究旨在利用体内外实验，系统评估V9302对胃癌的恶性生物学行为的影响，并研究V9302对肿瘤细胞糖酵解效应的影响，探究胃癌细胞是否通过增强有氧糖酵解适应谷氨酰胺匮乏环境，为V9302作为胃癌治疗药物的进一步研究和临床转化提供新思路和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物来源及培育

人胃癌细胞系(AGS、MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-7)购自中国科学研究院上海细胞库；使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco，美国)和1%青霉素/链霉素(塞维尔，中国)的Dulbecco改良培养基(DMEM)、PPMI-1640培养基、Hams F12K培养基，在37℃、5% CO₂下孵箱中培养。

实验动物来源及培养：4周龄雄性裸鼠无胸腺免疫缺陷BALB/c Nude鼠购自江苏集萃药康生物技术公司。裸鼠饲养在无特定病原体的条件下。向裸鼠提供充足无菌水和饲料。所有动物实验均经解放军总医院动物伦理委员会批准(2021-X17-88)，实验操作遵循动物伦理操作规范。

1.2 主要实验试剂

V9302试剂购自上海奥默生物科技公司；Cell Counting Kit-8试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；组织细胞固定液(4%)购自北京阳光英锐生物公司；Transwell小室购自美国康宁公司；结晶紫溶液购自上海碧云天生物技术公司；放射免疫沉淀分析缓冲液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；蛋白胶和预染蛋白Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司；HK2、ENO1、PGAM1、β-肌动蛋白(β-actin)一抗和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司；苏木素染色液、伊红染色液购自北京阳光英锐生物公司；Ki-67一抗购自美国Abcam公司；PCNA一抗购自美国CST公司；TUNEL试剂盒购自上海Yeasen公司；免疫组化二抗试剂盒购自丹麦Dako公司；增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；葡萄糖检测试剂盒、乳酸测定试剂盒、ATP比色/荧光分析试剂盒和丙酮酸比色/荧光分析试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 Western blot检测6种胃癌细胞ASCT2、糖酵解关键酶蛋白表达量

RIPA细胞裂解液从AGS、MGC-803、SGC-7901、BGC-823、MKN-45、MKN-7这6种胃癌细胞系中提取蛋白，BCA蛋白检测试剂盒对提取的蛋白进行定量并计算上样量。通过10% ~ 12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后在4℃下与一抗孵育过夜。将膜在室温下暴露于二抗下孵育2 h。用ECL发光溶液对印迹进行成像。

将AGS、MGC-803细胞系培育至对数生长期，按照实验方案，V9302组加入含V9302(AGS 35 μmol/L；MGC-803 50 μmol/L)培养基，NC组加入不含药物的培养基培育24 h。通过上述Western blot实验流程，使用对应一抗、二抗检测V9302对糖酵解关键酶表达的影响。

1.4 CCK-8实验检测胃癌细胞增殖能力

收集对数生长期的胃癌细胞接种在96孔板中，调整浓度为5×10⁴/mL并培养24 h，V9302组加入含V9302(AGS：35 μmol/L；MGC-803：50 μmol/L)的培养基，NC组加入不含药物的培养基，培养至48 h、72 h后，分别加入10 μL CCK-8溶液，并使用酶标仪(Biotek，美国)孵育1 h后测量450 nm处吸光度，根据吸光度数值计算出相对细胞活力。

1.5 划痕试验检测胃癌细胞迁移能力

将胃癌细胞培养达到90% ~ 100%的汇合，使用200 μL无菌移液枪头在细胞单层上划一条直线。V9302组加入含V9302(AGS：35 μmol/L；MGC-803：50 μmol/L)的培养基，NC组加入等量的不含药物的培养基。划痕制造后0 h、24 h显微镜拍照记录划痕愈合情况，计算24 h细胞迁移率。细胞迁移率计算公式：细胞迁移率=(初始细胞间距离均值-24 h细胞间距离均值)/初始细胞间距离均值。

1.6 Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力

将预先饥饿处理的胃癌细胞制备成单细胞悬液，V9302组用加入V9302(AGS：35 μmol/L；MGC-803：50 μmol/L)的无FBS培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×10⁵/mL。将100 μL细胞悬液加入Transwell小室的上室。下室加入600 μL含10% FBS的培养基作为趋化因子，NC组使用未加入V9302的培养基培养。孵育48 h，4%多聚甲醛固定肿瘤细胞15 min后，使用0.1%结晶紫染液染色15 min。晾干后显微镜观察并拍摄图像，选择随机区域计数侵袭到膜底部的细胞。

1.7 克隆形成实验检测胃癌细胞集落形成能力

调整胃癌细胞悬液密度至1 000/mL，每孔1 000

个细胞加入预先涂覆有培养基的6孔培养皿中培养12 h。V9302组每孔加入3 mL含有V9302(AGS：

7 μmol/L；MGC-803：10 μmol/L)的培养基，NC组加入不含V9302培养基，持续培养14 d。4%多聚甲醛固定肿瘤细胞15 min后，结晶紫染色15 min，烘干后使用显微镜拍照并计算集落形成数目。

1.8 裸鼠皮下成瘤实验检测胃癌皮下瘤体生长、增殖能力

收集胃癌细胞，调整细胞浓度至1×10⁷/mL。选择4周龄雄性裸鼠BALB/c小鼠，在小鼠下背部皮下注射200 μL细胞悬液(约含2×10⁶个细胞)。成瘤裸鼠饲养7 d后，V9302组以45 mg/(kg·d)的剂量腹腔注射V9302溶剂，NC组裸鼠注射相同体积的0.9%氯化钠注射液，每3 d测量1次肿瘤体积：游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，计算体积：V=1/2ab²。3周后，杀死裸鼠，剖出瘤体称重。

1.9 生物信息学分析检测胃癌细胞蛋白表达差异

V9302组在胃癌AGS细胞中加入含V9302(35 μmol/L)的培养基培育24 h，NC组使用不加入药物的培养基培养24 h。借助蛋白质组学技术分析V9302处理下胃癌AGS细胞的差异表达蛋白，通过GO分析和KEGG分析对差异表达蛋白的生物过程、分子功能和细胞组分进行富集分析。比较各个GO条目和KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况。

1.10 糖酵解效应相关实验检测胃癌细胞糖酵解强度

V9302组在胃癌细胞中加入含V9302(AGS：35 μmol/L；MGC-803：50 μmol/L)的培养基培育24 h，NC组使用不加入药物的培养基培养，根据试剂盒制造商提供的方案，使用葡萄糖摄取测定试剂盒、ATP比色测定试剂盒、乳酸测定试剂盒和丙酮酸比色测定试剂盒分别测定反映乳酸生成量、ATP和丙酮酸产生量及葡萄糖摄取量的相关产物对应的特定波长的吸光度，根据吸光度对相关指标进行定量。

1.11 免疫组织化学、TUNEL染色和苏木精-伊红染色染色检测胃癌皮下瘤体增殖、凋亡情况

用4%多聚甲醛固定剖出的瘤体包埋在石蜡中并切片。玻片脱蜡并再水化以进行后续处理。

免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)：乙醇浸洗切片后蒸馏水润洗，3%双氧水溶液孵育25 min。在组化圈内滴加3%牛血清白蛋白均匀覆盖组织，室温封闭30 min。加入一抗4℃孵育过夜，切片甩干，在圈内滴加二抗(辣根过氧化物酶标记)覆盖组织，室温孵育50 min。二氨基联苯胺显色液显色，阳性为棕黄色。苏木素复染细胞核。白光显微镜(尼康，日本)下观察并采集图像。随机截取图像，计算阳性细胞单一视野下占比。

苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色：将石蜡组织切片放入二甲苯中彻底脱掉石蜡。室温下用乙醇浸泡切片，蒸馏水润洗。苏木素染色液染色10 min，伊红染色液染色2 min。脱水封片。显微镜(尼康，日本)下观察并采集图像。

TUNEL染色：将切片脱蜡后乙醇浸洗，20 μg/mL的蛋白酶K溶液、1×平衡缓冲液处理切片。取TUNEL试剂盒内适量末端脱氧核苷酸转移酶，dUTP，缓冲液按1∶5∶10比例混合后处理切片，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色后封片。于荧光显微镜(尼康，日本)下观察并采集图像，计算染色阳性细胞平均光密度。

1.12 统计学分析

采用ImageJ软件进行图像处理，GraphPad Prism软件进行统计分析。正态分布数据以x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASCT2在AGS和MGC-803细胞系中表达量较高

Western blot实验检测AGS、MGC-803、SGC-7901、BGC-823、MKN-45、MKN-7胃癌细胞系中ASCT2表达，发现这6种细胞系中均有ASCT2蛋白的表达，AGS、MGC-803两种细胞系表达较高，选择这两种细胞系进行后续实验(图1A)。

2.2 V9302抑制胃癌细胞增殖能力

CCK-8实验发现V9302组(AGS：35 μmol/L；MGC-803：50 μmol/L)胃癌细胞活力低于NC组(AGS 48 h：P=0.005；72 h：P＜0.001；MGC-803 48 h：P＜0.001；72 h：P＜0.001；图1B)。克隆形成实验发现V9302(AGS：7 μmol/L；MGC-803：10 μmol/L)处理的AGS、MGC-803细胞集落形成能力对比NC组下降，集落数减少(AGS：P=0.002；MGC-803：P＜0.001；图1C)。V9302试剂能抑制胃癌细胞增殖能力。

2.3 V9302抑制胃癌细胞迁移能力

Transwell实验发现加入V9302试剂(AGS：35 μmol/L；MGC-803：50 μmol/L)的V9302组对比NC组，迁移到下室的胃癌细胞减少(AGS：P=0.007；MGC-803：P＜0.001)。划痕试验显示V9302组细胞迁移能力低于NC组，划痕愈合能力下降(AGS：P=0.001；MGC-803：P＜0.001)。上述研究表明V9302试剂抑制胃癌细胞的迁移能力。见图2。

2.4 V9302干预胃癌细胞糖酵解的调控

为了进一步研究V9302对胃癌细胞的作用机制，本团队对V9302处理过的胃癌AGS细胞进行了蛋白质组学分析，找到了V9302处理下胃癌细胞AGS的差异表达蛋白(图3A)，对差异表达蛋白进行KEGG分析和GO分析，KEGG分析结果显示，差异表达蛋白在代谢通路中富集的程度最高(图3B)；GO分析提示，差异表达蛋白在生物进程大类中富集到糖酵解调控进程的程度排在生物进程的第4位(图3C)，说明V9302干预了胃癌细胞AGS的糖酵解调控进程。

2.5 V9302增强胃癌细胞的糖酵解效应

为了探究V9302对胃癌细胞糖酵解效应强度的具体影响，通过酶标比色法检测糖酵解相关产物结果发现V9302组细胞ATP产生量(AGS：P=0.026；MGC-803：P=0.003)、丙酮酸含量(AGS：P=0.001；MGC-803：P=0.006)、葡萄糖摄取率(AGS：P=0.010；MGC-803：P=0.002)、乳酸含量(AGS：P=0.001；MGC-803：P＜0.001)均高于NC组。V9302试剂增强胃癌细胞的糖酵解效应。见图4。

2.6 V9302未改变糖酵解关键酶的活性

为探究V9302对胃癌细胞糖酵解关键酶活性的影响，Western blot实验检测胃癌细胞中糖酵解关键酶己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)、磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1，PGAM1)、烯醇化酶1(enolase 1，ENO1))表达。结果提示，与对照组比较，经V9302处理的癌细胞糖酵解关键酶表达无统计学差异，说明V9302不是通过调控糖酵解关键酶活性调控胃癌细胞的糖酵解效应(图4)。

基金资助

国家自然科学基金面上项目(8227111040)