PM2.5对小鼠变应性鼻结膜炎的影响

Effect of PM2.5 on allergic rhinoconjunctivitis in mice

摘要

背景 变应性鼻结膜炎是常见的IgE介导性疾病，环境污染在其发病过程中起重要作用。PM2.5因其粒径小、吸附性强等特点，可通过直接刺激黏膜或携带致敏原加重免疫失衡，但其对鼻-眼联合过敏的作用机制尚未明确。 目的 建立变应性鼻结膜炎小鼠模型，研究PM2.5对变应性鼻结膜炎的影响。 方法 36只雌性C57小鼠(SPF级)随机分为对照组、模型组和PM2.5暴露组。模型组和PM2.5暴露组分别于0 d、4 d、7 d、14 d、21 d时行腹腔注射含卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 100 μg与佐剂氢氧化铝[Al(OH)₃] 4 mg药物(0.2 mL/只)；间隔3 d后，每周连续5 d用5% OVA分别点每眼每鼻各10 μL诱发过敏症状；PM2.5暴露组使用0.05% PM2.5点每眼每鼻各10 μL，10 ~ 20 min后点5% OVA。在致敏和激发阶段，对照组均用等量PBS替代。观察小鼠眼部、鼻部症状并进行评分。应用ELISA方法检测血清OVA特异性IgE(OVA specific IgE，OVA-sIgE)、IL-4、IL-17和IL-18表达；Western blot检测睑结膜、鼻黏膜NLRP3、TNF-α表达；免疫组化检测小鼠睑结膜及鼻黏膜组织NLRP3表达。 结果 模型组和PM2.5暴露组均诱发出鼻部、眼部过敏症状，PM2.5暴露组鼻部及眼部过敏出现时间均显著早于模型组(P＜0.05)。模型组和PM2.5暴露组OVA-sIgE、IL-4、IL-17和IL-18表达均显著高于对照组(P＜0.05)，其中PM2.5暴露组OVA-sIgE表达显著高于模型组(P＜0.05)。Western blot检测模型组及PM2.5暴露组睑结膜及鼻黏膜组织NLRP3和TNF-α表达较对照组显著增加(P＜0.05)；其中PM2.5暴露组睑结膜及鼻黏膜NLRP3和TNF-α表达较模型组显著增加(P＜0.05)。免疫组化检测模型组及PM2.5暴露组睑结膜、鼻黏膜组织NLRP3表达均显著增加。 结论 PM2.5显著加快变应性鼻结膜炎发生并加重其病情，其可能通过NLRP3信号通路在变应性鼻结膜炎发病中起着一定的促进作用。

Abstract

Background Allergic rhinoconjunctivitis is a common IgE-mediated disorder, and environmental pollution plays a significant role in its pathogenesis. PM2.5, characterized by its small particle size and strong adsorptive capacity, may exacerbate immune dysregulation by directly irritating mucous membranes or carrying allergens. However, the mechanisms underlying its impact on nasal-ocular co-allergy remain unclear. Objective To establish a murine model of allergic rhinoconjunctivitis and investigate the effects of PM2.5 on the disease. Methods Thirty-six female C57 mice (SPF grade) were randomly divided into control group, model group, and PM2.5 exposure group. On day 0, 4, 7, 14 and 21, the model group and the PM2.5 exposure group received 0.2 mL/piece intraperitoneal injection medicine containing OVA 100ug and adjuvant Al(OH)₃ 4 mg respectively. After an interval of 3 days, each eye and nose was dosed with 10 μL of 5% OVA for 5 consecutive days a week to induce allergic symptoms. The PM2.5 intervention group was performed with 10 μL of 0.05% PM2.5 for each eye and nose, 10 - 20 minutes later, 10 μL of 5% OVA was used for each eye and nose. In the sensitization and stimulation stage, the control group was replaced with equal amount of PBS. Ocular and nasal symptoms were observed and scored. The contents of OVA specific IgE(OVA-sIgE), IL-4, IL-17 and IL-18 in serum were detected by ELISA. The expressions of NLRP3 and TNF-α in eyelid conjunctiva and nasal mucosa were detected by Western blot. The expression of NLRP3 in eyelid conjunctiva and nasal mucosa of mice was detected by immunohistochemistry. Results The nasal and ocular allergic symptoms were induced in both the model group and the PM2.5 exposure group, and the onset time of nasal and eye allergy in the PM2.5 exposure group was significantly earlier than that in the model group (P0.05). The expression levels of OVA-sIgE, IL-4, IL-17 and IL-18 in the model group and the PM2.5 exposure group were significantly higher than those in the control group (P0.05), and the expression of OVA-sIgE in the PM2.5 exposure group was significantly higher than that in the model group (P0.05). Compared with the control group, the expression levels of NLRP3 and TNFa in the eyelid conjunctiva and nasal mucosa of the model group and the PM2.5 exposure group were significantly increased (P0.05). The expression levels of NLRP3 and TNFa in eyelid conjunctiva and nasal mucosa of the PM2.5 exposure group were significantly increased compared with the model group (P0.05). The expression of NLRP3 in the eyelid conjunctiva and nasal mucosa of the model group and the PM2.5 exposure group were significantly increased by immunohistochemistry. Conclusion PM2.5 obviously accelerates the occurrence and aggravation of allergic rhinoconjunctivitis, and it may play a certain role in promoting the onset of allergic rhinoconjunctivitis through the NLRP3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

PM2.5 / 变应性鼻结膜炎 / IgE / NLRP3

Key words

PM2.5 / allergic rhinoconjunctivitis / IgE / NLRP3

变应性鼻结膜炎(allergic rhinoconjunctivitis，ARC)是一种临床上常见的免疫性疾病，其特征为变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)与变应性结膜炎(allergic conjunctivitis，AC)的症状合并出现，属于由IgE介导的典型过敏反应。空气污染被视为引发ARC的一项重要风险因素。大气中的污染物主要包括气体与颗粒物(particulate matter，PM)两大类，其中颗粒物又可依据其粒径大小划分为粗颗粒物、细颗粒物和超细颗粒物，通常以气溶胶形态广泛悬浮于空气中。在这些污染物中，大气细颗粒物尤其受到关注。大气细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)是指环境空气中的空气动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物，也称可入肺颗粒物，是成分复杂的多相混合物，PM2.5暴露会加剧AR症状^[1]。前期研究表明NLRP3信号通路在ARC发病过程中的促进作用^[2]，本研究通过构建ARC小鼠模型，研究PM2.5对ARC的影响及其是否通过NLRP3信号通路影响ARC发病过程。与既往单独研究AC或AR不同，本研究在ARC整体模型中探讨PM2.5的作用及NLRP3信号通路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究所用动物为SPF级雌性C57小鼠，体重约30 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2019-0010]。所有动物实验操作均遵循国家科学技术部《实验动物管理条例》的相关要求，并经原战略支援部队特色医学中心动物实验伦理委员会审批通过[批号：伦审第(K202012)号]。

1.2 主要药品、试剂

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氢氧化铝[Al(OH)₃](Sigma)；磷酸盐缓冲液(PBS，1×，pH 7.2 ~ 7.4)(Biosharp)；小鼠OVA特异性IgE(OVA specific IgE，OVA-sIgE)、IL-4、IL-17及IL-18 ELISA检测试剂盒(BIOFINE)。PM2.5(Sigma-Aldrich。Western blot试剂：兔单抗NLRP3(Affinity)，兔多抗肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)(Affinity)，小鼠单抗β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)，HRP标记羊抗小鼠二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。免疫组织化学试剂为兔单抗NLRP3(Affinity)；兔二步法检测试剂盒(中杉金桥)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

选取健康C57小鼠36只，按随机数字表法分为3组，A组为对照组(PBS)，B组为模型组[OVA+Al(OH)₃]，C组为PM2.5暴露组[OVA+Al(OH)₃+PM2.5]。其中，PM2.5暴露组局部点眼时，先用0.05% PM2.5^[3]点每眼每鼻各10 μL，10 ~ 20 min后用OVA溶液点每眼每鼻各10 μL。3组腹腔注射及点眼点鼻均等量。

1.3.2 变应性鼻结膜炎小鼠模型建立

本研究用C57小鼠建立ARC，具体实验方案同参考文献[4]。(1)致敏阶段：B、C组药物配制——将5 mg OVA溶于1 mL PBS制成混悬液；将200 mg Al(OH)₃溶于9 mL PBS制成混悬液；将前述混悬液缓慢加入后者，轻轻搅拌均匀，制成10 mL混悬液。A组药物配制——PBS。各组分别于实验0 d、4 d、7 d、14 d、21 d时行腹腔注射相应药物，0.2 mL/只。(2)局部加强致敏，药物点眼点鼻激发：基础致敏间隔3 d后，每周连续5 d点眼点鼻诱发过敏症状；B、C组每只小鼠每天用5% OVA分别点每眼每鼻各10 μL；直至出现眼、鼻过敏症状。A组等量PBS点眼、点鼻方法同上。C组：0.05% PM2.5点每眼每鼻各10 μL，10 ~ 20 min后5% OVA点每眼每鼻各10 μL。

1.4 记录鼻部与眼部过敏症状的出现时间

鼻部及眼部过敏症状的具体观察指标参照文献[4]执行。在滴眼和滴鼻操作后的10 ~ 15min，对小鼠的鼻部和眼部过敏反应进行持续10 min的观察。若鼻部和眼部的过敏症状评分均较基线显著升高，则表明变应性鼻结膜炎小鼠模型诱导成功，同时记录相应症状出现的时间。

1.5 血清OVA-sIgE、IL-4、IL-17及IL-18表达

当C57小鼠表现出鼻部和眼部的过敏症状后，进行样本采集。通过摘除小鼠右眼球采集血液，收集于离心管内。采集样本在4℃条件下以3 000 r/min离心15 min，分离得到血清，分装后保存于-80℃超低温冰箱。在检测前，将血清样本置于冰水混合物中缓慢复融。采用ELISA方法测定血清中OVA-sIgE、IL-4、IL-17及IL-18的表达水平，所有操作均严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.6 睑结膜及鼻黏膜组织NLRP3和TNF-α蛋白水平

于C57小鼠出现鼻部及眼部过敏反应后，进行组织样本采集。睑结膜取材方法：剪取上下眼睑组织，于显微镜下精细分离出睑结膜，迅速保存于-80℃超低温环境。鼻黏膜取材方法：剥离鼻部表面皮肤，去除鼻骨，取出双侧鼻黏膜组织，同样置于-80℃冷冻保存。采用RIPA裂解液提取总蛋白并进行定量，取各组等量总蛋白(40 μg)通过SDS-PAGE进行电泳分离，之后转印至PVDF膜。使用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液在室温摇床封闭2 h。随后加入一抗NLRP3(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000)，4℃条件下孵育过夜。再用TBST配制相应的HRP标记二抗(1∶10 000)，将膜浸入二抗液中，室温摇床孵育2 h。显色曝光胶片，利用IPP软件分析胶片灰度值，以测定目标蛋白的相对表达水平。

1.7 睑结膜及鼻黏膜组织NLRP3表达

于C57小鼠出现鼻部及眼部过敏反应后，进行组织样本采集。睑结膜与鼻黏膜的获取方法同前，所取组织分别放置于4%多聚甲醛溶液中予以固定。之后按常规方法进行石蜡包埋并制备切片，用于组织病理学观察。同时开展免疫组织化学实验，以检测组织中NLRP3蛋白的表达情况。实验操作严格依照试剂盒说明书执行，完成抗体标记及DAB显色步骤，最后使用苏木素进行复染。

1.8 统计学分析

所有统计数据均使用SPSS 17.0软件进行处理。计量资料以\overline{x}±s表示；两组间比较采用独立样本t检验；多组均数比较则使用重复测量方差分析，若存在显著性差异，进一步采用LSD法或Dunnett’s法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻部过敏出现时间及眼部过敏出现时间

鼻部、眼部过敏出现时间对比结果显示，与模型组比较，PM2.5暴露组鼻部和眼部过敏出现时间均显著提前，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.2 血清OVA-sIgE、IL-4、IL-17和IL-18表达

与对照组比较，模型组及PM2.5暴露组小鼠血清OVA-sIgE、IL-4、IL-17及IL-18表达均显著升高，差异均有统计学意义(P均＜0.05)；与模型组比较，PM2.5暴露组小鼠血清OVA-sIgE表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3 Western blot检测睑结膜及鼻黏膜组织NLRP3和TNF-α蛋白表达

与对照组比较，模型组及PM2.5暴露组小鼠睑结膜NLRP3、TNF-α表达及鼻黏膜NLRP3、TNF-α表达均显著增加，差异均有统计学意义(P均＜0.05)；与模型组比较，PM2.5暴露组小鼠睑结膜NLRP3、TNF-α表达及鼻黏膜NLRP3、TNF-α表达显著增加，差异有统计学意义(P均＜0.05)。见图1，表3。

2.4 免疫组化检测睑结膜及鼻黏膜组织NLRP3表达

(1)鼻黏膜NLRP3表达：对照组鼻黏膜结构完整，上皮细胞可见少量NLRP3表达；模型组上皮细胞增生肥厚，上皮细胞、固有层大量NLRP3表达；PM2.5暴露组上皮细胞增生肥厚，上皮细胞、固有层大量NLRP3表达。

(2)睑结膜NLRP3表达：对照组睑结膜结构完整，上皮细胞可见少量NLRP3表达；模型组上皮细胞增生肥厚，上皮细胞、固有层大量NLRP3表达；PM2.5暴露组：上皮层变薄，上皮细胞、固有层大量NLRP3表达。见图2。

3 讨论

空气污染是ARC的主要危险因素，接触空气污染物者发生AR的概率相比未接触污染物者高43%^[5]。但PM2.5致ARC发病的机制尚不明确。

本研究中，我们通过OVA成功建立了ARC小鼠模型，模型组小鼠血清中OVA特异性IgE及IL-4表达显著增加；其中PM2.5暴露组小鼠鼻部及眼部过敏症状出现显著早于模型组；实验结果表明PM2.5促进了小鼠ARC发生。有研究表明，PM2.5可通过Gadd45b/MEKK4/JNK信号通路介导，调节活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，进而增强IgE所介导的肥大细胞活化^[6]。此外，PM2.5的浓度水平与AR患者的生活质量呈负相关，浓度升高可导致患者生活质量下降^[7]。AR和AC发病率与空气中PM2.5浓度呈正相关；改善空气质量，降低空气中PM2.5的浓度，能够有效降低AR和AC发病率^[8-11]。也有研究表明，PM2.5可以诱发与临床AC相似的症状，并且直接暴露于PM2.5可以诱发小鼠急性AC^[12]。PM2.5暴露诱导小鼠AC致敏与激发阶段中，能够促使Th2型免疫反应发生并促进血清IgE生成。该过程通过激活巨噬细胞，使其分泌胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)，进一步经由体内TSLP-TSLPR及TSLP-OX40L信号通路介导，从而加剧过敏性炎症反应^[13]。

本研究发现，ARC小鼠血清中IL-17、IL-18含量显著增加，睑结膜及鼻黏膜组织中NLRP3、TNF-α表达增加，其中PM2.5暴露组鼻黏膜及睑结膜组织中NLRP3、TNF-α表达较模型组显著增加。PM2.5促进了NLRP3及IL-18表达，提示其可能通过NLRP3信号通路促进并加重了ARC发生发展。近年来的研究显示，NLRP3-Caspase-1-IL-1β/IL-18信号通路在多种炎症性疾病的发生与发展中扮演关键角色。该通路的激活起始于NLRP3炎症小体的活化，进而促使IL-1β和IL-18等炎症因子释放，最终诱发机体的炎症反应。研究表明，NLRP3炎症小体及其下游效应因子IL-1β和IL-18参与AR的发病过程，并可能与炎症的严重程

基金资助

国家环境保护环境感官应激与健康重点实验室开放基金(19ZX84)