链脲佐菌素诱导的1型糖尿病雄性NOD小鼠肠道菌群谱特征研究

Characteristics of gut microbiota profile in male NOD mice induced by streptozotocin in type 1 diabetes mellitus

摘要

背景 雌性非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠常用于自发性1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)动物模型的构建，使用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导雄性NOD小鼠1型糖尿病的研究较少，STZ对雄性NOD小鼠肠道菌群谱的影响尚不清楚。 目的 分析STZ诱导雄性NOD小鼠1型糖尿病肠道菌群谱的变化。 方法 14只雄性NOD小鼠随机分为模型组(T1DM组，n=8)和对照组(CON组，n=6)。T1DM组小鼠每天注射50 mg/kg的STZ，连续5 d；CON组小鼠每天腹腔注射同等剂量的0.9% 氯化钠注射液​，连续5 d。在造模0 d、7 d、35 d时记录小鼠体质量和空腹血糖。35 d时收集新鲜粪便进行16S rRNA基因V3-V4区测序，分析雄性NOD小鼠在1型糖尿病（T1DM）状态下肠道菌群的多样性、组成特征、差异菌群以及功能预测。 结果 与CON组相比，T1DM组小鼠在35 d时体质量降低，血糖升高(P均＜0.05)。T1DM组小鼠肠道菌群的Observed OTUs指数、Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数都高于CON组(P均＜0.05)。T1DM组和CON组小鼠肠道菌群的NMDS分析(P=0.006，Stress=0.09)、PCoA分析(P=0.003)和PCA分析(P=0.002)有显著的离散距离。与CON组相比，T1DM组小鼠肠道的拟杆菌门、髌骨细菌门、脱硫杆菌门和蓝菌门上调，而厚壁菌门下调(P均＜0.05)；在属水平上，T1DM组的未分类鼠杆菌科、鼠杆菌属、候选糖单胞菌属、脱硫弧菌属和另枝菌属上调，而联合乳杆菌属下调(P均＜0.05)；T1DM组小鼠肠道菌群的厚壁菌门/拟杆菌门和厚壁菌门/变形菌门的比值降低(P均＜0.05)。主要差异菌联合乳杆菌和单球菌属与空腹血糖呈负相关，鼠杆菌属、另枝菌属、候选糖单胞菌属和惰性真杆菌组与空腹血糖呈正相关(P均＜0.05)。T1DM小鼠肠道菌群在核苷酸代谢、糖酵解代谢、氨基酸代谢、脂代谢途径中发生显著改变(P均＜0.05)。 结论 链脲佐菌素诱导使雄性NOD小鼠T1DM模型的肠道菌群多样性增加，菌群构成发生改变，雄性NOD小鼠T1DM的进展可能与链脲佐菌素诱导的肠道菌群结构和功能紊乱相关。

Abstract

Background Female non-obese diabetic (NOD) mice are commonly used for constructing animal models of spontaneous type 1 diabetes mellitus (T1DM), while research on using streptozotocin (STZ) to induce T1DM in male NOD mice is limited, and the impact of STZ on the gut microbiota profile of male NOD mice remains unclear. Objective To analyze the changes in gut microbiota profiles in STZ-induced T1DM in male NOD mice. Methods Fourteen male NOD mice were randomly divided into model group (T1DM group, n=8) and control group (CON group, n=6). The mice in the T1DM group were injected with 50 mg/kg of STZ every day for 5 consecutive days. The mice in the CON group were injected with the same dose of normal saline intraperitoneally every day for 5 consecutive days. The weights and fasting blood glucose of mice were recorded at 0 day, 7 days, and 35 days of modeling. At 35 days, fresh feces were collected for 16S rRNA gene V3-V4 region sequencing to analyze the diversity, composition, differential bacterial screening, and functional prediction of the gut microbiota in male NOD mice with T1DM. Results Compared with the CON group, the body weight of mice in the T1DM group was significantly reduced at 35 day, and the blood glucose was significantly increased (all P＜0.05). The Observed OTUs index, Chao1 index, Simpson index and Shannon index of the gut microbiota of the T1DM group were all higher than those of the CON group (all P＜0.05). The NMDS analysis (P=0.006, Stress =0.09), PCoA analysis (P=0.003) and PCA analysis (P=0.002) of the gut microbiota in mice of the T1DM group and the CON group showed obvious discrete distances. Compared with the CON group, the Bacteroidota, Patescibacteria, Desulfobacterota, and Cyanobacteria in the gut microbiota of mice in the T1DM group were significantly up-regulated, while the Firmicutes was significantly down-regulated (all P＜0.05). At the genus level, the Muribaculaceae_unclassified, Muribaculum, Candidatus_Saccharimonas, Desulfovibrio and Alistipes in the T1DM group were significantly up-regulated, while the Ligilactobacillus was significantly down-regulated (all P＜0.05). The ratios of Firmicutes/Bacteroidota and Firmicutes/Proteobacteria in the gut microbiota of mice in the T1DM group were significantly decreased (all P＜0.05). The main differential bacteria Ligilactobacillus and Monoglobus were negatively correlated with fasting blood glucose, while Muribaculum, Alistipes, Candidatus_Saccharimonas, and Eubacterium_siraeum_group were positively correlated with fasting blood glucose (all P＜0.05). Significant changes were observed in the gut microbiota of T1DM mice in pathways related to nucleotide metabolism, glycolysis, amino acid metabolism, and lipid metabolism (all P＜0.05). Conclusion Streptozotocin induction increases the diversity of gut microbiota and alters its composition in male NOD mice with T1DM. The progression of T1DM in male NOD mice may be associated with streptozotocin-induced structural and functional disturbances in the gut microbiota.

Graphical abstract

关键词

1型糖尿病 / 肠道菌群 / NOD小鼠 / 链脲佐菌素 / 雄性

Key words

type 1 diabetes mellitus / gut microbiota / NOD mice / streptozotocin / male

糖尿病是一组以血糖水平增高为特征的常见慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起。2021年全球有5.37亿糖尿病患者，预计到2050年全球的糖尿病患者将增加到13.1亿人，极大增加了全球公共卫生负担^[1-2]。2022年全球1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)患者有875万人，其中20岁以下的T1DM患者由2021年的120万人增加到152万，严重影响儿童和青少年的身体健康^[1]。T1DM是一种复杂的自身免疫性内分泌疾病，其主要特点是自身的免疫细胞异常浸润胰岛并破坏胰腺β细胞，导致胰岛素分泌障碍，引起体内胰岛素绝对缺乏从而导致血糖持续升高，出现糖尿病^[3]。尽管研究人员对T1DM进行了广泛的研究，但其确切发病机制仍不清楚，其病因主要与自身免疫反应、遗传易感性、表观遗传、内源性逆转录病毒激活、外源性病毒感染和肠道菌群等因素的复杂相互作用有关^[4]。

肠道菌群可通过多种复杂的因素影响T1DM的发病机制，如调节对饮食抗原的耐受性、调节肠道炎症、改变肠道通透性和肠道生态失调等。观察性研究表明，在婴儿出生后的一个月内口服乳酸杆菌可以降低T1DM的发病风险，而口服拟杆菌则增加患T1DM的易感性，通过使用不同的肠道细菌对宿主进行干预，发现其对T1DM的进展截然不同^[5]。单次大剂量或多次小剂量STZ诱导雄性C57BL/6J小鼠T1DM是常用的动物模型^[6]；而NOD小鼠是自发性T1DM动物模型，在12 ~ 15周龄时90%的胰岛β细胞已经破坏并出现糖尿病症状，30周龄时的雌性小鼠累积发病率达到60% ~ 80%，而雄性小鼠发病率不到20% ~ 30%^[7]。研究发现，口服双酚A加速了雌性NOD小鼠T1DM的发生，但延缓了雄性小鼠T1DM的发病进程，且治疗组的雄性NOD小鼠的拟杆菌门与厚壁菌门的比值显著升高^[8]。STZ联合雄性NOD小鼠的复合模型，可同时触发化学性β细胞损伤与自身免疫攻击，弥补单一模型的不足并可缩短雄性NOD小鼠的发病周期，提高雄性小鼠T1DM的发病率，但其对雄性NOD小鼠肠道菌群谱的影响尚不清楚。本实验使用低剂量STZ加速诱导雄性NOD小鼠T1DM，采集其新鲜洁净的粪便进行16S rRNA扩增子测序，初步分析STZ诱导雄性NOD小鼠T1DM模型肠道菌群的特征，为研究T1DM肠道菌群谱的改变对病程进展的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品、主要仪器与设备

2-16NL高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；血糖仪及血糖检测试纸(E1909004E，4876706，强生中国医疗器械有限公司)；链脲佐菌素(1018B022，美国Sigma公司)；0.1M柠檬酸钠缓冲液(20231227，北京索莱宝科技有限公司)；粪便微生物DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；NanoDrop2000分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；T100 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；电子天平(中国上海花潮实业有限公司)；静脉可视小鼠尾注固定器(中国济南益延科技发展有限公司)；戊二醛癸甲溴铵溶液(山东琳可生物科技有限公司)；小鼠代谢笼(山东新华医疗器械有限公司)。

1.2 实验动物

14只6 ~ 8周龄初始体质量为22 ~ 24 g左右的雄性SPF级NOD小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010]。NOD小鼠饲养于解放军总医院医学创新研究部的实验动物屏障设施内。本实验在解放军总医院实验动物福利伦理委员会的监督下(伦理审批号：2022-x18-130)进行模型建立。

1.3 实验动物分组和处理

14只雄性NOD小鼠适应性喂养1周，按照随机数字表法分为2组：CON组6只，T1DM组8只。T1DM组小鼠每天腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg，连续注射5 d。CON组小鼠以相同方式注射同等剂量生理盐水，连续5 d。造模过程中观察两组小鼠饮水进食情况，使用静脉可视小鼠尾注固定器固定小鼠尾部，使用血糖仪检测两组小鼠在造模0 d、7 d、8 d、35 d的空腹血糖，使用电子天平称量两组小鼠在造模0 d、7 d、35 d的体质量。造模第7 d和第8 d的两次空腹血糖都大于16.7 mmol/L，提示NOD小鼠1型糖尿病模型造模成功^[9]。

1.4 粪便样本收集和处理

建模5周后，使用1∶2 000的戊二醛癸甲溴铵溶液浸泡代谢笼30 min，使用清水冲洗干净并晾干后经紫外线消毒1 h待用，将每只小鼠单独放入消毒的代谢笼内，让其自由活动1 h，收集代谢笼粪便管中的新鲜粪便并置于无菌离心管中，将装有粪便的无菌管放入液氮中暂存，所有粪便样品收集完后集中存放于-80℃冰箱待用。

1.5 粪便样品细菌DNA提取和16S rRNA扩增子建库测序

使用凯杰粪便细菌DNA提取试剂盒提取小鼠粪便细菌总DNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测提取的粪便DNA的浓度和纯度，使用移液器吸取适量DNA于1.5 mL离心管中并稀释定量到1 ng/µL。使用稀释后的DNA为模版，使用带有barcode标记的上下游特异引物(341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC)、Pusion热启动灵活型2×浓缩预混液和高保真酶等扩增粪便细菌的16S rRNA基因的V3-V4区。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用安普瑞XT磁珠核酸纯化试剂盒回收纯化目的条带。将合格的纯化目的DNA产物进行建库，文库合格后，采用NovaSeq 6000测序仪进行2×250 bp的双端测序。

1.6 生物信息学分析

使用QIIME2软件对ASVs特征序列和丰度表进行多样性分析、物种注释和高级分析。其中Alpha多样性主要通过Observed OTUs、Shannon、Simpson、Chao1等指数对两组小鼠肠道菌群的组内多样性进行评估；Beta多样主要通过计算加权的 unifrac距离的主成分分析(Principal component analysis，PCA)、主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)和非度量多维尺度分析(Multidimensional scaling，NMDS)分析对两组小鼠肠道菌群的组间多样性进行评估。物种注释是根据ASV序列文件采用SILVA和NT-16S数据库进行肠道菌群的物种注释，并根据ASVs丰度表对各物种在两组中的丰度进行统计，注释置信度阈值为0.7。高级分析是基于得到的物种丰度信息，使用microeco分析包进行LEfSe分析，本研究将LDA值≥3.8进行两组比较，筛选两组间的差异性生物标志物(Biomarker)；基于测序数据，使用Picrust2软件对两组小鼠肠道菌群进行功能通路的预测分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 9.5.1软件做图。计量资料使用均数±标准差(\overline{x}±s)表示，对两组数据进行Shapiro-Wilk检验，对正态数据两组比较采用独立样本t检验，筛选阈值以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量和血糖的变化

实验过程中，CON组小鼠的一般状态良好，TIDM组小鼠造模后精神萎靡、出现耸毛、活动减少，在造模一周后TIDM组8只小鼠死亡2只(死亡率为25%)。与CON组相比，T1DM组在造模开始后的第7 d和8 d的血糖都大于16.7 mmol/L，说明NOD小鼠的T1DM模型构建成功(表1)，成模率为100%。在造模成功后，T1DM组小鼠开始出现多饮、多食、多尿的糖尿病症状；与CON组相比，T1DM组小鼠体质量在35 d时降低(P＜0.05，图1A)；该组小鼠血糖持续升高，在35 d时血糖最高(P均＜0.05，图1B)。

2.2 16S rRNA基因扩增子测序原始数据分析

CON组和T1DM组共12份小鼠粪便样本，16S rRNA测序共观察到8 007个独特的扩增子序列变异(ASVs)数目，CON组特有1 864个ASVs，T1DM组特有887个ASVs，两组共有698个ASVs(图2A)。平均每个样品测序序列数为76 642条，序列长度在400 ~ 500 bp范围内的数量为919 294条占比99.96%，与16S rRNA V3-V4区域序列长度吻合，符合后续结果分析(图2B)。CON组平均每个样品获得537个ASVs，T1DM组平均每个样品获得798个ASVs；与CON组相比，T1DM组的ASVs数显著增加(P=0.012，图2C)。Goods coverage是指微生物覆盖率，数值越高表明样本中新物种没有被测出的概率越低，该指数实际反映测序结果代表样本的真实情况，两组小鼠的该指数均值都为1，说明本次测序结果可靠(图2D)。

2.3 肠道菌群α-多样性分析

本研究中的α-多样性是指CON组和T1DM组小鼠肠道菌群在两组内的多样性。Observed OTUs和Chao1指数主要用来评估两组所包含的物种数目即菌群的丰富度；Simpson和Shannon指数主要用来评估两组内物种的多样性，其值越大多样性越高。与CON组相比，T1DM组小鼠肠菌群的Observed OTUs指数(P=0.012)、Chao1指数(P=0.012)、Simpson指数((P=0.011)和Shannon指数(P＜0.001)都升高。T1DM组和CON组小鼠肠道菌群的丰富度和多样性有差异，STZ诱导NOD小鼠T1DM对小鼠肠道菌群的丰富度和多样性有影响。见图3。

2.4 肠道菌群β-多样性分析

β-多样性分析通常由计算两组间的距离矩阵开始，本研究主要通过NMDS分析、PCoA分析和PCA分析评估T1DM组与CON组小鼠的肠道菌群的构成差异。NMDS分析(P=0.006，Stress=0.09)、PCoA分析(P=0.003)和PCA分析(P=0.002)结果都显示两组间的聚类距离较远且无重叠，说明两组小鼠的肠道菌群构成上不同。结果表明，STZ诱导NOD小鼠T1DM使其肠道菌群构成发生改变。见图4。

2.5 两组小鼠肠道菌群物种组成和变化

在门水平上，CON组小鼠前5位的菌门组成，包括厚壁菌门(Firmicutes，62.44%)、拟杆菌门(Bacteroidota，28.39%)、疣微菌门(Verrucomicrobiota，6.63%)、变形菌门(Proteobacteria，1.45%)和放线菌门(Actinobacteriota，0.90%)，这5个菌门的占比为99.81%；T1DM组小鼠前5位的菌门组成，包括拟杆菌门(Bacteroidota，48.24%)、厚壁菌门(Firmicutes，44.05%)、变形菌门(Proteobacteria，2.21%)、髌骨细菌门(Patescibacteria，1.91%)和疣微菌门(Verrucomicrobiota，1.11%)，这5个菌门的占比为97.53%。与CON组相比，T1DM组的拟杆菌门(Bacteroidota)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)和蓝菌门(Cyanobacteria)的相对丰度增加，而厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度减少(P均＜0.05，图5A)。

厚壁菌门所属细菌具有合成短链脂肪酸来稳定肠道屏障的作用，研究发现，厚壁菌门/拟杆菌门(Firmicutes/Bacteroidota)和厚壁菌门/变形菌门(Firmicutes/Proteobacteria)比率的逐渐降低与肝硬化的进展显著相关^[10]。在本研究中，与CON组相比，T1DM组F/B的比值降低(P=0.008，图5A)。厚壁菌门与变形菌门比率(Firmicutes/Proteobacteria)的改变与宿主肠道微生态相关；嗜酸乳杆菌EG004喂食8周对小鼠的认知能力有积极的影响，其F/P的比值也显著提高^[11]；与CON组相比，T1DM组F/P的比值降低(P=0.013，图5A)。

在属水平上，与CON组相比，T1DM组的未分类鼠杆菌科(Muribaculaceae_unclassified)、鼠杆菌属(Muribaculum)、候选糖单胞菌属(Candidatus_Saccharimonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和另枝菌属(Alistipes)的相对丰度增加，而联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)的相对丰度减少(P均＜0.05，图5B)。

2.6 肠道菌群差异标志物的筛选分析

进化分枝图结果显示，CON组和T1DM组小鼠的肠道菌群的系统发育明显不同(图6A)。采用线性判别分析效应值≥3.8(LDA effect size, LEfSe)在两组间共鉴定出34个有差异的物种条目(图6B)。T1DM组中增加的差异菌属是鼠杆菌属(Muribaculum)、候选糖单胞菌属(Candidatus_Saccharimonas)、另枝菌属(Alistipes)、嗜果胶拟杆菌群(Bacteroides_pectinophilus_group)和惰性真杆菌群(Eubacterium_siraeum_group)；CON组增加的差异菌属是联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)和单球菌属(Monoglobus)(图6B)。

2.7 主要差异菌与空腹血糖的相关性

有几个菌属被鉴定为主要的功能差异菌，这些主要差异菌，包括联合乳杆菌(Ligilactobacillus)和单球菌属(Monoglobus)与空腹血糖呈负相关，鼠杆菌属(Muribaculum)、另枝菌属(Alistipes)、候选糖单胞菌属(Candidatus_Saccharimonas)和惰性真杆菌组(Eubacterium_siraeum_group)与空腹血糖呈正相关(P均＜0.05，图7)。这些相关性分析表明，T1DM关键的主要功能菌积极参与了小鼠血糖水平的调节。

2.8 两组小鼠肠道菌群功能预测分析

为了进一步评估T1DM组小鼠肠道菌群的功能及作用，通过使用PICRUSt2软件对两组小鼠肠道菌群的16S rRNA基因进行功能通路的预测。肠道菌群功能通路预测的结果显示，CON组和T1DM组小鼠中共有30条代谢通路发生改变。与CON组相比，有17条通路在T1DM组小鼠中表达上调，其余13条通路表达下调(P＜0.05，图8)。这些通路集中在以核苷酸代谢、糖酵解代谢、氨基酸代谢、脂代谢为主的代谢途径中(图8)。T1DM组小鼠肠道菌群涉及多条代谢途径的改变，其中4条糖代谢途径表达上调，包括糖酵解和恩特纳-杜多洛夫的超途径(superpathway of glycolysis and Entner-Doudoroff)、糖酵解代谢和降解的超途径(superpathway of glycol metabolism and degradation)、还原性三羧酸循环Ⅰ(reductive TCA cycle Ⅰ)和D-葡糖醛酸内酯降解Ⅰ(D-glucarate degradation Ⅰ)，提示它们可能在T1DM的发生发展中发挥了关键作用。

3 讨论

人体中存在数万亿微生物组成的各种微生物群落定居在人体的不同部位，这些微生物群落在维持人类健康方面发挥着关键作用，它们通过刺激免疫系统、抵御病原体、也可作为代谢性疾病的触发器和驱动因素对宿主产生深远的影响^[12]。肠道微生物群紊乱与多种疾病相关，如1型和2型糖尿病^[4,13]、心血管疾病^[14]、自身免疫性疾病和胃肠道疾病等^[12]。因此，了解宿主与肠道菌群之间的相互作用对于明确各种疾病的病因和实施针对性的治疗有着至关重要的作用。一项观察性研究表明，在人类出生后的第一个月服用乳酸杆菌可以减轻T1DM的发病风险，而服用拟杆菌则增加了患T1DM的敏感性，乳酸杆菌在T1DM的进展中起到保护作用^[5]；益生菌可以通过提高T淋巴细胞和抗炎细胞因子水平来提高肠粘膜连接蛋白和黏蛋白的水平增强屏障完整性和减少氧化应激^[15]。使用有益菌对紊乱的肠道菌群进行干预可能是治疗T1DM的潜在途径。本研究重点探索STZ诱导雄NOD小鼠T1DM模型的肠道菌群谱的变化及主要差异菌，发现T1DM组的单球菌属和联合乳杆菌属减少，鼠杆菌属、另枝菌属、候选糖单胞菌属和惰性真杆菌增加，结果相关性分析发现这些肠道差异菌与T1DM密切相关。

本实验结果显示，T1DM组小鼠的肠道菌群α-多样性指数Observed OTUs、Chao1、Simpson和Shannon指数(P均＜0.05)都高于CON组，β-多样性指数的NMDS分析、PCoA分析和PCA分析结果显示两组的菌群组成不同(P均＜0.05)，进一步分析发现T1DM组小鼠的肠道菌群多样性增加，本研究结果与下述人类研究结果基本一致。Liu等^[16]通过对中国51例T1DM儿童和47例年龄和性别匹配的健康对照者中获取的粪便样本进行16S rRNA基因测序，发现T1DM儿童粪便的Shannon和Sinpson指数高于Control组，

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