神经调节蛋白4通过自噬机制促进炎性微环境中骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

Neuregulin 4 promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in inflammatory microenvironment via autophagy activation

摘要

背景 炎性微环境抑制骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化，神经调节蛋白4(neuregulin 4，Nrg4)对多器官具有抗炎作用，但Nrg4能否促进炎性微环境中BMSCs成骨分化及其作用机制尚不清楚。 目的 探讨Nrg4对炎性微环境中BMSCs成骨分化的影响及机制。 方法 将BMSCs分为4组：对照组，TNF-α组(TNF-α诱导炎性微环境)，Nrg4干预组(TNF-α+Nrg4)和氯喹(CQ)抑制自噬组(TNF-α+Nrg4+CQ)。碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定ALP活性，Western blot检测成骨相关蛋白ALP和骨钙素(osteocalcin，OCN)表达，自噬蛋白P62和LC3B表达，茜素红染色检测矿化结节数量。 结果 与对照组相比，代表炎性微环境的TNF-α组中BMSCs ALP活性降低(P＜0.001)，ALP和OCN蛋白表达下降(P＜0.05)，P62表达上调，同时LC3B-Ⅱ下调(P＜0.05)，矿化结节数量减少(P＜0.001)；Nrg4干预组炎性微环境中BMSCs ALP活性(P＜0.001)、ALP和OCN蛋白表达均升高(P＜0.05)，P62表达下调同时LC3B-Ⅱ表达上调(P＜0.05)，矿化结节数量增加(P＜0.001)；当采用氯喹抑制自噬后，Nrg4促进炎性微环境中BMSCs成骨分化的作用明显减弱(P＜0.05)。 结论 Nrg4可以促进炎性微环境中BMSCs成骨分化，并且这种作用与激活自噬有关。

Abstract

Background The inflammatory microenvironment inhibits osteogenic differentiation of bone-marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Neuregulin 4 (Nrg4) exerts anti-inflammatory effects on multiple organs, but whether Nrg4 can promote osteogenic differentiation of BMSCs in an inflammatory microenvironment and its underlying mechanism remain unclear. Objective To investigate the effects of Nrg4 on osteogenic differentiation of BMSCs in the inflammatory microenvironment and related mechanisms. Methods BMSCs were divided into four groups: vehicle, TNF-α, Nrg4 (TNF-α+Nrg4), and chloroquine (TNF-α+Nrg4+Chloroquine). ALP activity was measured using alkaline phosphatase (ALP) assay kit, while the expression of osteogenic-related proteins ALP and osteocalcin (OCN), as well as autophagy-related proteins P62 and LC3B, was detected by Western blot. The number of mineralized nodules was assessed by alizarin red staining. Results Compared with the control group, BMSCs in the inflammatory microenvironment in TNF-α group exhibited reduced ALP activity (P＜0.001), decreased expression of ALP and OCN proteins (P＜0.05), upregulated P62 expression accompanied by downregulated LC3B-Ⅱ (P＜0.05), and fewer mineralized nodules (P＜0.001). Nrg4 treatment promoted ALP activity in BMSCs under inflammatory conditions (P＜0.001), increased the expression of ALP and OCN proteins (P＜0.05), downregulated P62 while upregulating LC3B-Ⅱ (P＜0.05), and enhanced the number of mineralized nodules (P＜0.001). However, when autophagy was inhibited by chloroquine, the pro-osteogenic effect of Nrg4 on BMSCs in the inflammatory microenvironment was significantly attenuated. Conclusion Nrg4 promotes osteogenic differentiation of BMSCs in the inflammatory microenvironment, and this effect is associated with autophagy activation.

Graphical abstract

关键词

神经调节蛋白4 / 炎症微环境 / 骨髓间充质干细胞 / 成骨分化 / 自噬 / 骨再生 / 组织工程

Key words

neuregulin 4 / inflammatory microenvironment / bone-marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) / osteogenic differentiation / autophagy / bone regeneration / tissue engineering

多种炎性反应性疾病(如牙周炎、慢性根尖周炎及颌骨骨髓炎等)均可导致颌骨组织损伤，而骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨分化在颌骨损伤修复中发挥着关键的病理生理学作用。过度的炎症刺激抑制BMSCs成骨分化^[1]，对颌骨损伤修复造成不利影响^[2]。神经调节蛋白4(neuregulin 4，Nrg4)是一种主要由棕色脂肪组织分泌的细胞因子，对肝脏、心脏、肾脏和血管等多种器官组织起着代谢保护作用^[3-5]。新近有研究表明，神经调节蛋白4通过抗炎缓解心脏重构，减轻血管内皮炎症与动脉粥样硬化，提高脂肪细胞胰岛素敏感性，缓解骨关节炎^[6]等。因此，本研究假设Nrg4可能通过调节自噬来缓解炎症对BMSCs成骨分化的抑制作用，为临床治疗炎性骨病提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

神经调节4重组蛋白(英国Abcam公司，货号ab174432)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、氯喹(CQ)购自美国Sigma公司，成骨诱导液、茜素红染色试剂盒(美国赛业生物公司)，碱性磷酸酶(ALP)半定量检测试剂盒(上海碧云天生物公司)，CD29、CD31、CD34、CD73、CD11b、CD44、CD45、CD90、CD105抗体(美国BD Biosciences公司)，BCA 蛋白定量试剂盒、P62抗体(美国CST公司)，ALP、LC3B抗体(英国Abcam公司)，骨钙素(osteocalcin，OCN)抗体 (美国Santa Cruz公司)。iD5型多功能酶标仪(美国Spectramax公司)，Synergy-HD型显微镜(日本Toshiba公司)，DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40型转膜仪(北京六一仪器厂)。

1.2 小鼠BMSCs表型鉴定

复苏冻存5周龄C57BL/6小鼠BMSCs，间充质干细胞表面标志物鉴定采用实验室常规方法^[7]。取P2代BMSCs采用0.5 g/L胰蛋白酶消化稀释成2×10⁵/mL单细胞悬液。将BMSCs单细胞悬液加入到200 μL EP管中，分别滴加带荧光标记的抗CD29、CD31、CD34、CD73、CD11b、CD44、CD45、CD90、CD105抗体，4℃避光孵育30 min。采用PBS缓冲液冲洗，去除未结合的抗体，流式细胞术检测BMSCs表面标志物。本研究经解放军总医院医学伦理委员会批准(2023-X19-28)。

1.3 ALP活性半定量检测

取P3代BMSCs以5.0×10³/孔的密度接种于96孔板，待细胞铺满80%面积时，更换为成骨诱导液继续培养。设置对照组(vehicle，仅加入成骨诱导培养液)、TNF-α诱导炎性微环境组(TNF-α，成骨诱导培养液中加入40 μg/L^[8] TNF-α)、神经调节蛋白4干预组(Nrg4，40 μg/L TNF-α+100 μg/L Nrg4^[9])和氯喹抑制自噬组(CQ，40 μg/L TNF-α+ 100 μg/L Nrg4+10 μmol/L CQ^[10])，每组3个复孔。分别于成骨诱导培养后的第1、3、5、7 d使用试剂盒检测ALP活性。

1.4 Western blot检测蛋白的表达

各组细胞成骨诱导培养1周后提取总蛋白，测定总蛋白浓度后以Western blot常规方法^[11]测定各组细胞中目的蛋白ALP(抗体稀释比例1∶1 000)，OCN(抗体稀释比例1∶500)，P62(抗体稀释比例1∶1 000)和LC3B(抗体稀释比例1∶2 000)相对表达量(以β-actin为内参)。

1.5 茜素红染色及半定量分析

各组细胞成骨诱导10 d，镜下观察到矿化结节。采用既往文献报道方法^[12]进行茜素红染色。染色步骤如下：弃成骨诱导培养液，ddH₂O冲洗2遍，室温下4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS缓冲液冲洗2遍，茜素红染液染5 min后去除染液，ddH₂O冲洗2遍后镜下拍照。向各组染色细胞中加入10%氯化十六烷基吡啶以溶解钙结节，移液枪取100 μL钙结节溶解液，于酶标仪570 nm处测定OD值。

1.6 统计学分析

采用SPSS26.0软件进行统计分析。对计量资料采用单因素方差分析，如果方差齐，采用LSD法进行进一步比较；如果方差不齐(P≤0.1)，采用Tamhane’s T2法进行进一步比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠BMSCs表面标志物鉴定

小鼠BMSCs高表达间充质干细胞表面标志物CD29(99.4%)，CD73(96.3%)，CD44(99.2%)，CD90(98.9%)和CD105(98.8%)。低表达内皮及造血细胞表面标志物CD31(2.28%)，CD34(2.29%)，CD11b(4.37%)和CD45(3.51%)。见图1。

2.2 神经调节蛋白4对炎性微环境中BMSCs ALP活性的影响

与对照组比较，TNF-α组ALP活性显著降低，差异有统计学意义(第3 d，P＜0.001；第5 d，P＜0.001；第7 d，P＜0.001)；而神经调节蛋白4干预提高炎性微环境中BMSCs的ALP活性(第3 d，P=0.001；第5 d，P＜0.001；第7 d，P＜0.001)；当采用氯喹抑制自噬后，神经调节蛋白4干预提高BMSCs ALP活性的作用显著减弱(第3 d，P=0.032；第5 d，P=0.003；第7 d，P=0.023)。见图2。

2.3 神经调节蛋白4对炎性微环境中BMSCs成骨分化相关蛋白表达的影响

与对照组相比，炎性微环境中BMSCs成骨相关蛋白ALP和OCN的表达均显著下降(P＜0.05)；而神经调节蛋白4干预显著提高ALP和OCN的蛋白表达(P＜0.05)。当采用CQ抑制自噬后，神经调节蛋白4提高炎性微环境中ALP和OCN表达的作用显著减弱(P＜0.05)。见图3。

2.4 神经调节蛋白4对炎性微环境中BMSCs成骨分化过程中自噬活性的影响

如图4所示，与对照组相比，炎性微环境中自噬蛋白LC3B-Ⅱ的表达均显著下降(P＜0.05)；而神经调节蛋白4干预提高LC3B-Ⅱ蛋白表达(P＜0.05)。为区分LC3B-Ⅱ蛋白表达增加是由于自噬激活引起的还是因为自噬体与溶酶体融合受阻造成的，本研究同时检测了自噬货物蛋白P62的蛋白表达。结果显示，神经调节蛋白4干预降低P62蛋白量，这表明LC3B-Ⅱ蛋白表达增加是自噬激活的结果。当采用CQ抑制自噬后，神经调节蛋白4提高炎性微环境中BMSCs自噬活性的作用显著减弱(P＜0.05)。

2.5 神经调节蛋白4对炎性微环境中BMSCs矿化水平的影响

茜素红染色结果见图5，与对照组相比，炎性微环境中BMSCs形成的钙结节显著减少，而神经调节蛋白4干预提高炎性微环境中BMSCs的矿化水平。当抑制自噬后，神经调节蛋白4干预提高炎性微环境中BMSCs矿化水平的作用显著减弱。本研究进一步对茜素红染色进行半定量分析，结果显示：与对照组相比，TNF-α组的OD值显著降低[(0.43±0.09) vs (1.15±0.21)，P＜0.001]，神经调节蛋白4干预提高茜素红染色OD值[(1.06±0.19) vs (0.43±0.09)，P＜0.001]，当抑制自噬后，神经调节蛋白4干预提高茜素红染色OD值的作用显著减弱[(0.38±0.11) vs (1.06±0.19)，P＜0.001]。

3 讨论

本研究发现，神经调节蛋白4可提高炎性微环境中BMSCs的ALP活性，上调早期成骨蛋白ALP与晚期成骨蛋白OCN的表达，增加矿化结节的数量。在作用机制上，可能与激活成骨分化过程中BMSCs的自噬活性有关。

在骨损伤修复的过程中，BMSCs分化为成骨细胞，是成骨细胞的重要细胞来源。大块骨损伤很难自愈，以BMSCs和支架材料为基础的组织工程为骨损伤修复提供了新手段。然而，当支架材料负载的BMSCs体内移植后，由于感染或者免疫排斥产生的炎性微环境抑制BMSCs成骨分化，并进而影响骨修复效果^[13-14]。因此，抑制炎性微环境对促进BMSCs成骨分化及修复骨损伤具有重要的临床意义。细胞因子，例如Nr4a1在治疗炎性骨病方面有巨大的潜在应用价值^[1]。神经调节蛋白4作为一种脂肪因子，其调节糖脂代谢紊乱先关靶器官损伤的作用已被广泛证实。最近基础研究发现，神经调节蛋白4对骨关节^[6]、血管内皮细胞^[15]、脂肪组织^[16]和心脏^[17]等组织器官发挥抗炎作用。本研究也发现，神经调节蛋白4促进炎症微环境中BMSCs成骨分化，提高炎性微环境中BMSCs的ALP活性，上调早期成骨蛋白ALP与晚期成骨蛋白OCN的表达，增加矿化结节的数量。在牙周炎大鼠模型中，Nrg4重组蛋白可提高牙槽骨的骨密度与骨体积分数^[18]，与本研究结果基本一致。

自噬是真核细胞特有的一种在进化上高度保守的降解回收机制，将细胞内部分大分子物质和受损的细胞器进行降解，回收和再利用。自噬活性是维持干细胞增殖和分化能力所必需的^[19]，而自噬紊乱在抑制炎性状态下BMSCs成骨分化中起着重要作用。TNF-α诱导的炎性微环境导致BMSCs细胞骨架重排，降低自噬活性并抑制BMSCs成骨分化^[20]。本研究在作用机制上发现，神经调节蛋白4通过激活自噬促进炎性微环境中BMSCs成骨分化。神经调节蛋白4降低P62蛋白表达，同时提高LC3B-Ⅱ蛋白表达；使用CQ抑制自噬后，神经调节蛋白4促进ALP活性，上调成骨相关蛋白表达与增加矿化结节的作用显著减弱。这从反面证实了自噬在神经调节蛋白4干预促进炎性微环境中BMSCs成骨分化中的作用。自噬与成骨之间存在密切关系，激活自噬可促进BMSCs成骨分化^[21-22]。

本研究有一定局限。首先，自噬受mTOR依赖性与mTOR非依赖性信号通路的调节，AMPK可从上游抑制mTOR并激活自噬，也可通过非mTOR依赖性信号途径激活自噬^[23-24]。在炎性微环境BMSCs成骨分化的过程中，神经调节蛋白4激活自噬的信号途径值得深入探讨。其次，本研究局限在细胞层面验证机制，后续研究可在动物层面验证Nrg4在体内的成骨效果，以增强其临床转化价值。

综上所述，本研究发现神经调节蛋白4促进炎性微环境中BMSCs成骨分化，并且这种作用与激活细胞自噬活性有关。这为神经调节蛋白4在临床用于治疗炎性骨病提供了细胞层面的重要参考。

数据共享声明　本论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：taojingqiao1984 @163.com。

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基金资助

首都医科大学科研创新项目(XSKY2024259)