双样本孟德尔随机化分析炎症因子与骨关节炎的因果关系

Two-sample Mendelian randomization analysis for causal relationships between inflammatory factors and osteoarthritis

摘要

背景 研究发现炎症因子跟骨关节炎(osteoarthritis，OA)的进展存在很大关系，但炎症因子与OA的发生关系尚不明确。 目的 利用孟德尔随机化(mendelian randomization，MR)分析91种炎症因子与OA之间的因果关系。 方法 获取91种炎症因子和OA的全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)数据，以逆方差加权法(inverse-v weighted，IVW)为主，Egger回归法(MR-Egger)等其他4种方法作为补充评价因果效应；再使用Cochran Q、MR-PRESSO、MR-Egger截距检验和留一法对分析评估结果进行敏感性分析。 结果 MR分析共鉴定出5种炎症因子，分别为趋化因子配体4(chemokine ligand 4，CCL4)、趋化因子配体23(CCL23)、肿瘤坏死因子相关凋亡性配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)、趋化因子配体11(CCL11)、白细胞介素20受体α(interleukin-20 receptor α，IL-20Rα)，均与OA的关联效应值差异具有统计学意义(P＜0.05)。IVW：CCL4(OR=1.002 6，95% CI：1.000 8 ~ 1.004 5)、CCL23(OR=0.997 7，95% CI：0.995 5 ~ 0.999 8)；TRAIL(OR=0.996 9，95% CI：0.994 4 ~ 0.999 3)；CCL11(OR=0.996 9，95% CI：0.993 9 ~ 0.999 9)；IL-20Rα(OR=0.995 8，95% CI：0.991 8 ~ 0.999 8)；Cochran Q检验未发现异质性，MR-PRESSO检验未检出离群值，MR-Egger截距检验显示结果无水平多效性，留一法分析进一步支持结果的稳健性。 结论 MR分析结果支持炎症因子和OA存在潜在的因果关系，其中CCL4是OA的危险因素，而CCL23、TRAIL、CCL11、IL-20Rα则为保护因素。

Abstract

Background Studies have found that inflammatory factors are closely associated with the progression of osteoarthritis, but the relationship between inflammatory factors and osteoarthritis (OA) remains unclear. Objective To analyze the causal relationship between 91 inflammatory factors and OA using Mendelian randomization (MR). Methods Genome-wide association study (GWAS) data of 91 inflammatory factors and OA were obtained. The inverse variance weighted method (IVW) was used as the main method, and four other methods, including MR-Egger regression, were used as supplementary methods to evaluate the causal effect. Sensitivity analysis was conducted using Cochran Q, MR-PRESSO, MR-Egger intercept test, and leave-one-out analysis. Results MR analysis identified five inflammatory factors significantly associated with OA (all P＜0.05): chemokine ligand 4 (CCL4), chemokine ligand 23 (CCL23), tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), chemokine ligand 11 (CCL11), and interleukin-20 receptor α (IL-20Rα). The IVW method yielded the following odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (CIs): CCL4 (OR=1.002 6, 95% CI: 1.000 8 - 1.004 5), CCL23 (OR=0.997 7, 95% CI: 0.995 5 - 0.999 8), TRAIL (OR=0.996 9, 95% CI: 0.994 4 - 0.999 3), CCL11 (OR=0.996 9, 95% CI: 0.993 9 - 0.999 9), and IL-20Rα (OR=0.995 8, 95% CI: 0.991 8 - 0.999 8). Sensitivity analyses showed no evidence of heterogeneity (Cochran's Q test), outliers (MR-PRESSO test), or horizontal pleiotropy (MR-Egger intercept test), with leave-one-out analysis further confirming the robustness of the results. Conclusion MR analysis supports potential causal relationships between these inflammatory factors and OA, identifying CCL4 as a risk factor and CCL23, TRAIL, CCL11, and IL-20Rα as protective factors.

Graphical abstract

关键词

炎症 / 炎症因子 / 骨关节炎 / 孟德尔随机化 / 全基因组关联研究

Key words

inflammation / inflammatory factors / osteoarthritis / Mendelian randomization / genome-wide association study

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是常见的关节慢性退行性疾病，是导致慢性疼痛和残疾的主要原因之一^[1]。主要表现为关节软骨损伤、骨赘形成、软骨下骨硬化等^[2]。目前，全球范围内约6亿人患有OA，女性多于男性，且随着年龄患病率逐渐增高^[3]。OA与年龄、性别、遗传、外伤、肥胖等危险因素相关，还与职业、生活行为、肠道菌群、营养物质、细胞因子等多种因素相关^[4]。越来越多的证据表明，炎症在OA的发生发展中发挥着关键作用。例如，白细胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)在OA的发病机制中起着重要作用，并有望成为缓解OA疼痛的治疗靶点^[5-8]。尽管这些观察性研究探讨了炎症因子在诊断和治疗OA方面的作用，但其结果可能会受到混杂变量或反向因果关系的影响，从而存在一定争议。因此，OA与炎症因子间的关系需进一步阐明。

孟德尔随机化(mendelian randomization，MR)是通过分析数据中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)来探索疾病与危险因素之间因果关联的新方法^[9]。这种分析方法利用SNP的随机分配特点，将其作为工具变量进行分析，可有效减少混杂因素、测量误差和反向因果关系，从而大大提高研究结果的可靠性。基于此，本研究通过评估炎症因子与OA之间的因果关系，为OA的预防和治疗提供实验基础和理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究设计

本研究采用MR方法，选择91个炎症因子作为暴露，与这91个炎症因子显著相关的SNPs作为工具变量，OA作为结局变量。为了筛选出可靠的工具变量，得到可靠的结果，本研究进行的MR分析需要满足以下3个关键假设：(1)作为Ⅳ选择的遗传变异与暴露因素强相关(关联性假设)；(2)遗传变异不得与任何混杂因素有关(独立性假设)；(3)遗传变异仅通过暴露因素影响结局(排他性假设)^[10]。见图1。

1.2 数据来源

本研究使用了从GWAS数据库中提取的两个数据集。91种循环炎症因子的GWAS数据集来自Olink Target平台对14 824例欧洲血统参与者的91种炎症相关血浆因子的全基因组蛋白数量性状位点研究(GWAS编号为GCST90038686)^[11]。OA的GWAS数据可在FinnGen数据库(https://gwas. mrcieu.ac.uk)中公开获取，数据ID号为finngen_-R11_-M13_-OSTEOARTHRITIS。该OA数据集涵盖了约9 587 836个SNP和484 598例个体，其中包括疾病组(n=39 515)和健康对照组(n=445 083)^[12]。

1.3 强IVs的筛选

本研究中，鉴于与炎症因子相关SNP位点难以满足传统的统计显著性阈值P＜5×10^-8，将其放宽至P＜5×10^-5。为确保筛选出的遗传变异具有独立性，引入了连锁不平衡的标准，设定参数为r²=0.001和窗口长度kb=10 000。为了进一步验证这些工具变量的有效性，利用F=R² (N-k-1)/K (1-R²)计算每个SNP的F值，R²表示所选SNP的累积解释方差，计算公式如下：R²=(2×EAF× (1-EAF) ×β ²)/[(2×EAF× (1-EAF) ×β ²) + (2×EAF× (1-EAF) ×N× SE²)]，其中N表示暴露样本数量，EAF表示效应等位基因频率，β表示效应值，SE表示标准误差^[13]。F统计量值小于10的工具变量被认为是弱工具，从MR分析中排除。

1.4 敏感性分析

为确保结果的准确性，本研究采用了多种检验方法。(1)使用Cochran's Q检验进行异质性评估，若P＞0.05，表明不存在显著异质性。(2)采用MR-Egger截距检验来评估基因水平的多效性；当截距值接近0且P＞0.05时，认为水平多效性不存在，从而支持排他性假设的成立。(3)采用MR-PRESSO全局检验检测潜在的离群值^[14]，而留一法则通过逐一剔除Ⅳ并重新计算剩余Ⅳ的MR结果，以评估特定Ⅳ对整体MR结果的敏感性。如果剔除某个Ⅳ后其余Ⅳ的MR估计值与总体结果存在显著差异，则提示MR结果对该Ⅳ具有较强的敏感性。

1.5 统计学方法

本研究中，我们主要采用IVW方法来探讨炎症因子与OA之间的因果关系，即通过计算每个SNP的Wald比率来评估每个SNP对RA的因果效应。此外，为了增强分析的稳健性，我们还运用了多种MR分析方法，包括MR-Egger、WME、VW以及SM法，以全面评估炎症因子与OA之间的潜在关联。MR-Egger法虽然在统计学上可能不如其他方法强大，但它在识别潜在的方向偏差和效应大小方面具有独特优势^[15-16]。结果以优势比(OR)及95%可信区间(CI)表示。OR＞1表示暴露与结局呈正相关，OR＜1表示暴露与结局呈负相关，P＜0.05则表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 强IVs

最终纳入152个SNP用于双样本MR分析，其中，CCL4有34个SNP，CCL23有35个SNP，TRAIL有37个SNP，CCL11属26个SNP，IL-20Rα20个SNP。F值均＞10，符合MR的关联性假设。

2.2 炎症因子与OA的因果效应

正向MR结果以IVW为主的分析提示：CCL4与OA呈正相关(OR=1.002 6，95% CI：1.000 8 ~ 1.004 5)；CCL23(OR=0.997 7，95% CI：0.995 5 ~ 0.999 8)、TRAIL(OR=0.996 9，95% CI：0.9944 ~ 0.999 3)、CCL11(OR=0.996 9，95% CI：0.993 9 ~ 0.999 9)、IL-20Rα(OR=0.995 8，95% CI：0.9918 ~ 0.999 8)均与OA呈负相关。见表1。反向MR结果未发现OA与CCL4、CCL23、TRAIL、CCL11、IL-20Rα存在因果关系(均P＞0.05)。

此外，本研究还使用了IVW、加权中位数法、加权模式法、简单中位数法、MR Egger回归法对结果进行补充验证，5种方法的结果一致(OR均＜1或OR均＞1)，且5种方法的回归线方向基本一致，证明因果关系具有一定的稳定性，见图2。

2.3 敏感性分析

异质性检验：Cochran Q检验结果显示，所纳入SNP之间无异质性(CCL4：P=0.646 4；CCL23：P=0.595 9；TRAIL：P=0.037 9；CCL11：P=0.581 6；IL-20Rα：P=0.256 7)。水平多效性：MR-Egger回归截距的结果显示，炎症因子和OA之间的相关性无水平多效性(CCL4：截距=0.000 1，P=0.428 3；CCL23：截距=0.000 3，P=0.187 3；TRAIL：截距=0.000 1，P=0.606 6；CCL11：截距=-0.000 1，P=0.577 4；IL-20Rα：截距=4.749 9，P=0.930 1)。可认为排他性假设成立，证明因果关系稳健。MR-PRESSO全局检验没有发现离群值。此外，漏斗图中各个SNP所代表的点大致呈对称分布，表明受潜在偏倚影响的可能性小，见图3。

基金资助

上海市浦东新区卫生健康委员会优秀青年医学人才培养计划(PWRq2021-45)

上海市浦东新区卫生系统重点学科(PWZxk2022-09)

上海市浦东新区公利医院青年英才(GLRq2020-06)