FOXC1通过NF-κB信号通路介导HPV阳性宫颈癌细胞恶性表型的机制研究

Mechanistic role of FOXC1 in promoting malignant phenotypes of HPV16-positive cervical cancer via NF-κB signaling pathway

摘要

背景 人乳头瘤病毒16型(​human papillomavirus type 16，HPV16)E6致癌蛋白是宫颈癌发生的关键因子，然而其介导细胞增殖与凋亡的发生机制尚不十分清楚。 目的 本研究旨在探讨HPV16 E6是否通过FOXC1激活NF-κB通路，并阐明FOXC1在HPV阳性宫颈癌细胞增殖与凋亡中的调控机制。 方法 通过Western Blot检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中FOXC1、Ki-67和Caspase-3蛋白的表达；构建FOXC1敲低(sh-FOXC1)的HPV阳性宫颈癌细胞模型(Siha、Hela)，利用Western blot检测FOXC1敲低后，细胞内Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和NF-κB p65蛋白表达变化；qRT-PCR检测FOXC1敲低后各组细胞内NF-κB下游促炎因子IL-6、TNF-α mRNA表达水平。利用平板克隆、TUNEL凋亡检测技术分析FOXC1敲低对细胞增殖、凋亡的影响；通过在Siha 细胞中sh-FOXC1组中过表达HPV16 E6验证HPV16 E6与FOXC1-NF-κB轴的调控关系，通过Western blot检测各组细胞内E6、FOXC1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达变化；利用平板克隆、TUNEL凋亡检测技术检测各组细胞增殖凋亡能力变化。 结果 FOXC1蛋白表达量为正常组织的4.61倍，Ki-67表达升高2.17倍，而凋亡标志物Caspase-3表达降低至正常组织的38.82%(P＜0.01)。FOXC1蛋白在Siha、Hela细胞中的表达量分别为C33A细胞的5.43倍和21.41倍，为永生化宫颈上皮细胞HCerEpiC的6.41倍和25.49倍(P＜0.01)。Western blot结果显示，敲低FOXC1表达后sh-FOXC1组促凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达较对照Siha组升高1.94倍和1.66倍(P＜0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2及p-NF-κB p65表达降低至55.41%和51.09%(P＜0.05)；总NF-κB p65无显著变化(P＞0.05)。qRT-PCR结果显示，与Siha组相比，sh-FOXC1细胞内NF-κB下游促炎因子IL-6、TNF-α mRNA表达降低(P＜0.01)。平板克隆实验和TUNEL凋亡检测结果显示，与sh-NON组相比，sh-FOXC1组细胞克隆形成率降至53.54%，凋亡水平升高，增加2.73倍(P＜0.01)，Hela细胞系的结果与其一致。在Siha 细胞中，Western blot结果显示，与sh-FOXC1组相比，sh-FOXC1-OE E6组细胞内E6、FOXC1、p-NF-κB p65、Bcl-2蛋白表达分别回升1.36倍、4.17倍、4.26倍、3.34倍(P＜0.05)；Caspase-3、Bax表达回降至61.77%和68.94%(P＜0.05)；细胞克隆形成的集落数量回升2.83倍(P＜0.01)；细胞凋亡率降低至45.54%(P＜0.01)。 结论 HPV16 E6可能通过上调FOXC1激活NF-κB通路，进而促进宫颈癌细胞增殖并抑制凋亡，提示FOXC1可能成为HPV阳性宫颈癌治疗的潜在靶点。

Abstract

Background The E6 oncoprotein of human papillomavirus type 16 (HPV16) is a key factor in cervical carcinogenesis, yet its mechanisms mediating cell proliferation and apoptosis remain to be elucidated. Objective To investigate whether HPV16 E6 activates the NF-κB pathway via FOXC1 and elucidate the regulatory mechanism of FOXC1 in proliferation and apoptosis of HPV-positive cervical cancer cells. Methods Western blot was used to detect the expression of FOXC1, Ki-67 and Caspase-3 in cervical cancer and normal cervical tissue. HPV-positive cervical cancer cell models (Siha, Hela) with FOXC1 knockdown (sh-FOXC1) were constructed, and Western blot was used to detect the expression changes of Caspase-3, Bcl-2, Bax, phosphorylated NF-κB p65 (p-NF-κB p65) and NF-κB p65 in the cells after FOXC1 knockdown. qRT-PCR was used to detect the expression levels of NF-κB downstream pro-inflammatory factors IL-6 and TNF-α mRNA in each group of cells. Colony formation and TUNEL apoptosis assays were used to analyze the effects of FOXC1 knockdown on cell proliferation and apoptosis. Overexpression of HPV16 E6 in the sh-FOXC1 group of Siha cells was used to verify the regulatory relationship between HPV16 E6 and the FOXC1-NF-κB axis, and Western blot was used to detect the expression changes of E6, FOXC1, Caspase-3, Bcl-2, Bax, p-NF-κB p65 and NF-κB p65 in each group of cells. Colony formation and TUNEL apoptosis assays were used to detect the changes in cell proliferation and apoptosis ability in each group. Results FOXC1 protein expression was 4.61-fold higher in tumor tissues compared to normal controls (P＜0.01), accompanied by a 2.17-fold increase in Ki-67 and a significant reduction of Caspase-3 to 38.82% of normal levels. In cell lines, FOXC1 expression showed 5.43-fold (SiHa) and 21.41-fold (HeLa) elevation versus C33A cells, and 6.41-fold/25.49-fold increases relative to immortalized HCerEpiC cells (all P＜0.01). FOXC1 knockdown (sh-FOXC1) induced pro-apoptotic effects, with Caspase-3 and Bax expression increasing 1.94-fold and 1.66-fold respectively in SiHa cells (P＜0.05), while anti-apoptotic Bcl-2 and p-NF-κB p65 decreased to 55.41% and 51.09% (P＜0.05). Total NF-κB p65 remained unchanged (P＞0.05). Correspondingly, qRT-PCR demonstrated significant downregulation of NF-κB-dependent cytokines IL-6 and TNF-α mRNA (P＜0.01). Functional assays showed sh-FOXC1 reduced colony formation by 46.46% (to 53.54% of control) and increased apoptosis 2.73-fold (P＜0.01), with consistent results in HeLa cells. Rescue experiments through HPV16 E6 overexpression (sh-FOXC1-OE E6) reversed these effects: E6, FOXC1, p-NF-κB p65 and Bcl-2 rebounded 1.36-, 4.17-, 4.26- and 3.34-fold respectively (P＜0.05), while Caspase-3/Bax declined to 61.77%/68.94% (P＜0.05). This was associated with 2.83-fold increased colony formation (P＜0.01) and reduced apoptosis to 45.54% of knockdown levels (P＜0.01). Conclusion HPV16 E6 may activate the NF-κB pathway by upregulating FOXC1, thereby promoting the proliferation of cervical cancer cells and inhibiting apoptosis. These findings suggest that FOXC1 could potentially serve as a therapeutic target for HPV-positive cervical cancer.

Graphical abstract

关键词

宫颈癌 / FOXC1 / NF-κB信号通路 / HPV16 E6 / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / 分子机制

Key words

cervical carcinoma / FOXC1 / NF-κB signaling pathway / HPV16 E6 / cellular proliferation / cellular apoptosis / molecular mechanism

宫颈癌(cervical cancer，CC)是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，且发病年龄呈显著年轻化趋势。超过70%的宫颈癌病例与高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)16型和18型的持续感染相关^[1]。尽管HPV疫苗在预防CC方面取得了显著进展，但对已进展为浸润性癌的患者，传统治疗手段如根治性手术、同步放化疗等常伴随严重并发症，且晚期患者易产生放化疗耐药^[2-3]。除了HPV感染，宿主基因的表观遗传变化、信号通路的异常激活以及肿瘤微环境的改变也在宫颈癌的进展中起着重要作用。因此，研究HPV与宿主基因之间的相互作用机制，对于开发新的治疗方法非常重要。

FOXC1(Forkhead box C1)是一种转录因子，属于叉头盒(Forkhead box，FOX)家族，其通过结合DNA特定序列调控下游靶基因表达，参与胚胎发育、组织分化及细胞命运决定等生物学过程^[4-5]。近年来，FOXC1在肿瘤发生发展中的作用备受关注^[6]。研究发现，在宫颈癌组织中，FOXC1蛋白的高表达水平与疾病的晚期临床分期、高度恶性的肿瘤表型以及患者的不良预后结局存在显著关联^[7]。FOXC1通过激活PI3K/AKT信号通路，显著增强了宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力^[8]。然而，FOXC1在宫颈癌中的高表达现象及其与HPV感染的具体关联尚未完全阐明。前期研究的Illumina Hiseq测序结果和免疫组化验证结果表明，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在病变宫颈组织中呈强阳性表达，并且其过表达可能与HPV16感染有关^[9-10]。本研究通过对比宫颈癌组织与宫颈炎组织中FOXC1的表达差异，结合HPV阳性宫颈癌细胞系模型，探讨FOXC1对宫颈癌细胞增殖、凋亡的调控作用及其分子机制，通过功能回复实验阐明HPV16 E6蛋白与FOXC1-NF-κB轴的功能关联，旨在揭示HPV介导的宫颈癌恶性进展新机制，为靶向干预提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 组织样本

本研究纳入2020年12月— 2021年12月新疆医科大学第一附属医院收治的8例宫颈癌患者及8例正常宫颈对照。样本量基于预实验统计效力计算(Power≥80%)并符合探索性研究需求。入组标准：术后病理确诊为宫颈癌；术前未接受放化疗/靶向治疗；新鲜组织经液氮速冻保存；所有参与患者均签署知情同意书。本研究经新疆医科大学第一附属医院医院伦理委员会审核批准(伦理批号：20180223-128)，实验流程符合《赫尔辛基宣言》伦理准则。

1.2 实验材料

人宫颈癌Siha(CL-0210)、C33a(CL-0045)、Hela(CL-0101)细胞系以及细胞专用培养基(CM-0210)均购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司，HcerEpic(C7001)人正常子宫颈上皮细胞系购自中国上海雅吉生物科技有限公司；实验中使用的sh-FOXC1和sh-NON慢病毒由上海吉凯生物科技有限公司设计和提供，附带转染使用说明书；OE-E6慢病毒由南京斑马鱼生物科技有限公司设计并构建。实验过程中使用的一抗详细信息：FOXC1抗体(ab227977)购自美国Abcam公司，GAPDH(10494-1-AP)、P-NFκB p65 (ser468)、Bax(50599-2-Ig)、Bcl-2(12789-1-AP)和Caspase-3(25128-1-AP)购自美国Proteintech Group公司；NF-κB p65(WL01980)购自中国沈阳万类生物科技有限公司；HPV16 E6 抗体(C1P5)(sc-460)购自圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司。细胞染色过程中所使用的1%结晶紫染色溶液购自中国北京索莱宝科技有限公司；染料法荧光定量试剂盒TB Green Premix Ex Taq™试剂盒(RR420A-1)购自日本takara公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

人宫颈癌Siha、C33a、Hela细胞系采用普诺赛生物科技提供的细胞专用培养基进行培养；永生化人宫颈上皮HcerEpic细胞系使用DMEM完全培养基，该培养基包含10%(v/v)胎牛血清(Fetal Calf Serum，FBS)及1%(v/v)青霉素-链霉素双抗溶液。所有细胞系均置于37℃恒温、5% CO₂湿度培养箱中进行常规传代培养，当细胞汇合度达80%时进行1∶3传代处理。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测基因的表达水平

使用北京天根生物科技有限公司提供的RNAsimple总RNA提取试剂盒(DP419)从细胞中分离总的RNA。进一步利用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度及纯度(范围：A260/A280比值1.8 ~ 2.0)。配置含有RNA，逆转录酶，引物和反应缓冲液的逆转录反应混合物(20 μL)，并将将反应混合物在50℃条件下孵育30分钟完成cDNA合成。准备包含cDNA，引物，SYBR绿色染料的PCR反应混合物。设置预变性95℃ 30 s；扩增循环40次(95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)，于延伸阶段采集荧光信号。靶基因mRNA相对表达量以GAPDH为标准，采用2^-△△Ct法计算。所有引物序列经NCBI数据库中的Primer-BLAST验证特异性，见表1。

1.3.3 慢病毒转染及分组

根据上海吉凯生物科技有限公司的病毒转染操作指南，用靶向FOXC1的shRNA慢病毒(sh-FOXC1)和非靶向对照shRNA慢病毒(sh-NON)分别转染Siha和Hela细胞系，建立稳定敲低FOXC1的细胞模型及其对照组。取对数生长期的细胞，胰酶消化后重悬为5×10⁵个/mL的细胞悬液。接种100 μL悬液至6孔板，补充1.4 mL完全培养基，培养至细胞密度达40%后，弃去原培养基，更换为低血清(2% FBS)培养24 h，弃饥饿培养基，加入1 mL含20%血清的培养基和1.5 μL的sh-FOXC1及sh-NON病毒溶液。培养24 h后，更换为含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基进行筛选3次，持续使用含0.5 μg/mL 嘌呤霉素的培养基维持稳转细胞株。再以相似转染方法构建E6过表达的细胞，在靶细胞Siha(HPV16阳性)进行二次转染，命名为sh-FOXC1-OE E6，实验方法一致，但需要使用500 µg/mL的G418筛选其稳转细胞株。

1.3.4 Western blot检测蛋白的表达水平

收集各组细胞，加入预冷的RIPA裂解缓冲液(含1%蛋白酶抑制剂及1%磷酸酶抑制剂)，冰上裂解30 min后，经4℃、12 000×g离心15 min，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，调整至等量浓度(20 μg/μL)，加入5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10 min使蛋白变性。取30 μg/孔等量蛋白进行10%的SDS-PAGE电泳，采用甲醇转膜方式将其转移到0.22 μm的PVDF膜上，将转好的膜置于10%脱脂牛奶的TBST溶液中，室温封闭1 h。依次加入一抗，稀释比例为：FOXC1(1∶3 000)、NF-κB p65(1∶5 000)、Bax(1∶4 000)、Bcl-2(1∶2 000)、E6(1∶2 000)和GAPDH(1∶35 000)，室温下孵育120 min，NF-κB p65和P-NFκB p65 (ser536)是4℃过夜孵育。根据一抗的种属使用对应的HRP标记的二抗(兔抗或者鼠抗1∶10 000)，在室温下避光继续孵育2 h。利用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂显影，检测蛋白条带。以GAPDH为内参进行灰度分析。

1.3.5 平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力

将每组的单细胞悬液按500 cells/孔密度接种于6孔板，37℃培养15天(每5天更换含对应的完全培养基。弃去培养基后用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗3次，使用0.1%结晶紫染色20 min，PBS冲洗并晾干。拍照并记录，使用ImageJ计数克隆形成个数。

1.3.6 TUNEL细胞凋亡(显色法)检测细胞凋亡水平

将每组的单细胞悬液按5×10⁵ cells/孔密度接种于6孔板，37℃培养1 d后，先是对贴壁细胞进行PBS洗涤。使用碧云天免疫染色固定液(P0098)固定30 min，洗涤后加入碧云天通透液(P0097)室温孵育5 min，再次洗涤。用碧云天内源性过氧化物酶封闭液(P0100A)室温封闭20 min，洗涤三次以灭活过氧化物酶。生物素标记液按比例配制(1个样品：5 μL TdT酶+45 μL Biotin-dUTP，总50 μL)，现配现用，加入样品后37℃避光孵育60分钟，洗涤后以终止液处理10 min并洗涤三次。Streptavidin-HRP工作液按1∶49稀释(1个样品：1 μL Streptavidin-HRP+49 μL稀释液)，DAB显色液由A、B液等体积混合后立即使用。将Streptavidin-HRP工作液加入样品室温孵育30 min，洗涤后加入DAB显色液室温显色2 min(时间可调)，洗涤三次，显微镜下观察结果并拍照。

1.3.7 统计学分析

本研究数据分析分别采用GraphPad Prism 7.0软件进行图表可视化，SPSS19.0软件完成数据处理。所有实验独立重复≥3次。所有数据均为正态分布，计量资料以均数±标准差(\overline{x}\pm s)形式呈现，用独立样本t检验比较2组变量，多组间差异评估采用单因素方差分析。所有假设检验均以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织中FOXC1高表达伴随癌细胞增殖活性增强与凋亡抑制

本研究收集的8例宫颈癌患者(年龄48.88±7.95岁)的癌组织样本，所有患者术前均未接受新辅助化疗或放疗。病理分析显示：根据WHO分级标准，中-高分化癌5例(62.5%)，低分化癌3例(37.5%)；FIGO分期中ⅠA ~ ⅡA期3例(37.5%)，ⅡB期及以上5例(62.5%)。HPV分型检测表明：HPV16阳性5例(62.5%)，HPV18阳性2例(25.0%)，HPV阴性1例(12.5%)。基于此队列，我们首先采用Western Blot技术检测宫颈癌组织及正常宫颈组织内FOXC1、增殖相关蛋白Ki-67和凋亡相关蛋白Caspase-3的表达水平。结果显示，与正常宫颈组织相比，宫颈癌组织中FOXC1蛋白表达量显著上调(P＜0.01)，Ki-67表达量升高(P＜0.01)，而Caspase-3水平显著降低(P＜0.01) (图1)，差异均有统计学意义。

2.2 宫颈癌细胞系中建立FOXC1条件性敲低细胞模型

Western blot技术检测宫颈癌细胞Siha、Hela、C33a和正常宫颈上皮细胞HCerEpiC细胞FOXC1蛋白的表达水平。结果显示，与HCerEpiC相比，HPV阳性的宫颈癌细胞Siha、Hela细胞内FOXC1蛋白表达量上调(P＜0.01)(图2A)，C33a细胞内表达量无显著差异(P=0.997)，C33a细胞是HPV阴性，据此推测FOXC1可能在HPV阳性相关的宫颈癌中发挥了重要作用。因此，我们使用宫颈癌HPV阳性的Siha和Hela细胞构建FOXC1的shRNA敲低细胞系，Western blot结果显示，与Siha组比较，sh-NON组FOXC1蛋白无显著差异，而sh-FOXC1组中FOXC1的表达显著降低(P＜0.01)(图2B)，同样，Hela细胞的shRNA敲低细胞系构建完成。

2.3 敲低FOXC1可降低Siha、Hela细胞的增殖并促进其凋亡

Western Blot技术检测宫颈癌细胞Siha、Hela细胞个组内FOXC1、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果显示，与Siha组相比，sh-FOXC1组中FOXC1和Bcl-2的表达降低，Caspase-3和Bax蛋白的表达增高(P＜0.05)(图3A)。同样，Hela细胞内FOXC1、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化一致(图3A)。此外，利用平板克隆实验检测各组细胞的集落形成能力，结果显示，与sh-NON-Siha组相比，sh-FOXC1-Siha组细胞集落形成能力降低(P＜0.01)(图3B)。显色法TUNEL细胞凋亡检测结果显示，与sh-NON-Siha组相比sh-FOXC1-Siha组DAB染色阳性细胞增多，代表凋亡水平增强(P＜0.01)(图3C)。Hela细胞系的结果与其一致。

2.4 敲低FOXC1抑制NF-κB信号通路活化及下游炎症因子表达

Western blot结果显示，与Siha组相比，sh-FOXC1-Siha组中NF-κB p65的磷酸化水平(p-p65)表达降低，而总p65蛋白表达无显著差异(P＜0.01) (图4A)。qRT-PCR检测NF-κB下游促炎因子表达，与Siha组相比，sh-FOXC1-Siha组中IL-6、TNF-α mRNA表达水平降低(P＜0.01)(图4B)。Hela细胞系的结果与Siha细胞系结果一致。

2.5 HPVE6通过FOXC1-NF-κB信号通路调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡

通过在sh-FOXC1-Siha组细胞中过表达HPV16 E6(sh-FOXC1-OE E6)后，Western blot检测E6、FOXC1、p-NF-κB p65、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平的表达水平。结果显示，与sh-FOXC1组相比，sh-FOXC1-OE E6组细胞内E6、FOXC1、p-NF-κB和Bcl-2蛋白表达升高，Caspase-3和Bax蛋白的表达降低(图5A)。进一步应用平板克隆实验和显色法TUNEL细胞凋亡实验检测每组细胞的集落形成能力以及凋亡的改变，结果显示，sh-FOXC1组相比，sh-FOXC1-OE E6组细胞集落数量增多(P＜0.01)(图5B)，凋亡水平降低(P＜0.01)(图5C)。上述结果表明FOXC1是HPV 16 E6功能的重要下游靶点之一。

3 讨论

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤。据世界卫生组织最新统计，2022年全球新发宫颈癌病例超过约66.2万例，死亡病例约34.9万例^[11]。2022年我国新发宫颈癌病例是15.1万例，居女性癌症发病的第五位。高危型人乳头瘤病毒的持续感染是宫颈癌发生的必要病因，99.7%的宫颈癌病例中可检测到HPV感染证据，其中HPV16和HPV18型占中国宫颈鳞癌病例的84.5%^[12-13]。宫颈癌的发生与高危型HPV感染密切相关，但其分子机制尚未完全阐明。基于临床样本中FOXC1蛋白的异常高表达，本研究通过体外敲低FOXC1及过表达HPV16 E6实验证实，FOXC1是HPV16 E6介导的致癌效应的关键下游因子，其通过激活NF-κB通路进而抑制凋亡(下调Caspase-3/Bax、上调Bcl-2)并促进宫颈癌细胞增殖。

FOXC1作为FOX家族成员之一，既往研究多聚焦于其在胚胎发育及间质细胞分化中的作用，但FOXC1与人类疾病的关系仍有待进一步探索。最近的研究发现，在基底样乳腺癌中，FOXC1是其特异性诊断和预后生物标志物^[14]；在非小细胞肺癌中FOXC1蛋白表达上调，与肿瘤分化不良、肿瘤淋巴结转移分期、淋巴结转移相关，且提示患者预后不良^[15]。文献报道显示，FOXC1在宫颈癌组织中的表达增强，其免疫组织化学染色定位主要在细胞核和细胞质。我们通过对临床样本的初步分析发现，宫颈癌组织中FOXC1蛋白的表达显著高于正常宫颈组织。尽管上述研究提示FOXC1在宫颈癌中表达上调，但其在宫颈癌发生发展中的具体分子机制以及其对宫颈癌细胞生物学行为如增殖、凋亡的影响尚不清楚。在结直肠癌中，FOXC1通过TGF-β/Smad2/3/snail通路吸引M2巨噬细胞，促进EMT和结直肠癌进展^[16]。FOXC1通过靶向LATS2促进结直肠癌患者对奥沙利铂的耐药性^[17]。因此本研究推测FOXC1作为转录因子，可能通过多种机制驱动宫颈癌的发展。研究表明，FOXC1可直接激活细胞周期相关基因Cyclin D1的表达，从而加速G1/S期转换，促进肿瘤细胞增殖^[18-19]。FOXC1通过Wnt/β-连环蛋白信号通路放大促存活信号，并形成正反馈回路，进一步促进肿瘤生长和转移^[20]。这些机制共同使FOXC1成为宫颈癌进展中的重要调节因子，其在肿瘤增殖、转移和耐药性方面的作用不容忽视。本研究通过shRNA敲低FOXC1，结果显示，宫颈癌细胞增殖能力显著抑制，凋亡水平升高。Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡通路的核心调控者，其表达失衡可导致线粒体外膜通透性改变，释放细胞色素C并激活Caspase级联反应^[21]。本研究结果显示，FOXC1可能通过转录调控Bcl-2或间接影响其稳定性，从而抑制凋亡。尽管FOXC1在宫颈癌的多个过程中发挥关键作用，但对其作用机制的研究仍不完整，特别是其与NF-κB通路信号通路的关系。NF-κB通路是细胞增殖和转移的关键信号通路，其异常激活在多种癌症中常见，并与肿瘤的恶性特征密切相关^[22]。NF-κB通路的异常激活已被证实与宫颈癌化疗抵抗及免疫逃逸密切相关^[23]。更重要的是，前期课题组基于转录组测序和免疫组化验证，结果显示，NF-κB在宫颈癌组织中呈现过表达，其与HPV16阳性宫颈癌变显著相关^[11]，但具体的作用机制尚不清晰。此外，FOXC1是否通过该通路调节宫颈癌的增殖和凋亡能力尚未进行深入研究。在本研究中，FOXC1敲低显著降低NF-κB p65的磷酸化水平及下游促炎因子IL-6、TNF-α的表达，提示FOXC1通过激活NF-κB通路促进肿瘤细胞恶性增殖。值得注意的是，FOXC1在HPV阳性细胞系(Siha、Hela)中显著上调，而在HPV阴性细胞C33a中无显著差异，提示FOXC1的表达可能受HPV感染调控。在Siha细胞中，HPV16 E6过表达可部分逆转FOXC1敲低引起的增殖抑制和凋亡增强，且伴随p-NF-κB p65及Bcl-2水平恢复。这表明E6可能通过上调FOXC1表达激活NF-κB通路，进而抑制凋亡并促进增殖。

然而，目前的研究结果主要提示了E6通过FOXC1激活NF-κB信号通路的可能性，但FOXC1具体如何影响p65磷酸化等下游分子的具体机制尚未完全阐明。因此，后续研究通过染色质免疫共沉淀(ChIP)或双荧光素酶报告基因实验，直接验证FOXC1对NF-κB通路的调控作用。此外，本研究的不足是缺乏动物体内实验验证以及更广泛的临床样本分析。未来研究需扩大临床样本量尤其明确HPV分型并结合体内模型，阐明FOXC1通过NF-κB信号通路介导HPV阳性宫颈癌细胞增殖与凋亡的机制，并明确其在体内肿瘤发展和患者预后中的实际作用及临床相关性。

综上，本研究初步表明，转录因子FOXC1可能通过调控NF-κB通路参与HPV阳性宫颈癌的增殖与凋亡失衡过程。通过对宫颈癌的临床组织分析及体外功能实验，我们认为，HPV16 E6通过上调FOXC1表达，引起NF-κB通路的磷酸化激活，进而调控下游促炎因子IL-6、TNF-α及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，最终促进肿瘤细胞的恶性表型。因此，HPV感染与宿主细胞的基因表达和信号通路的改变相互作用，共同推动肿瘤的发生和进展。

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基金资助

新疆维吾尔自治区重点研发计划项目支持(2022B03019-1)

新疆维吾尔自治区研究生创新创业项目(XJ2024G173)