CRISPR/Cas9介导的定点同源重组基因插入单质粒系统的设计和验证研究

Design and validation of a CRISPR/Cas9-mediated site-specific homologous recombination for single-plasmid gene insertion system

摘要

背景 CRISPR/Cas9系统现已成为基因编辑的核心工具，但在使用过程中仍面临长片段基因整合困难、转基因沉默等挑战。 目的 拟设计一种基于CRISPR/Cas9系统的环状单质粒，可在多种细胞内实现外源基因的定点插入和稳定表达。 方法 将Cas9、靶向特定基因位点的sgRNA及同源重组供体模板[选用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为报告基因进行验证]整合至单一环状质粒系统，使用阳离子聚合物转染法将该单质粒递送至细胞内，并通过荧光显微镜观察、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增及Sanger测序进行验证。 结果 该单质粒系统在人类HEK293T和小鼠3T3细胞中实现了长片段基因的精准定点插入。荧光显微镜观察发现，该质粒在转染后第6天仍保持稳定GFP表达；PCR扩增和测序验证了插入位点的准确性。流式细胞分析显示，在无药物筛选条件下，293T细胞的靶向整合效率达5.3%。qPCR分析表明，插入后内源ACTB基因表达未受显著影响(变化范围0.2 ~ 1.3倍)，证实了该策略的安全性。 结论 本研究为长片段基因的稳定整合提供了一种简便、高效的解决方案，在工程化细胞构建、转基因体外模型构建中具有重要应用价值。

Abstract

Background The CRISPR/Cas9 system has emerged as a cornerstone technology for genome editing. However, it still faces challenges such as inefficient long-fragment integration and transgene silencing. Objective To design a circular single-plasmid CRISPR/Cas9 system to achieve site-specific integration and stable expression of exogenous genes in multiple cell types. Methods Cas9, sgRNA targeting specific gene loci and homologous recombination donor templates (green fluorescent protein was selected as the reporter gene for verification) were integrated into a single circular plasmid system. The single plasmid was delivered into the cells by cationic lipid-based transfection method and verified by fluorescence microscopy observation, PCR amplification and sequencing. Results The single-plasmid system achieved precise site-specific insertion of long gene fragments in both human HEK293T cells and mouse 3T3 cells. Fluorescence microscopy observations revealed that stable GFP expression was maintained even on the 6th day post-transfection. PCR amplification and Sanger sequencing were used to confirm the accuracy of the insertion sites. Flow cytometry analysis demonstrated that, under drug-free selection conditions, the targeted integration efficiency in 293T cells reached 5.3%. qPCR analysis indicated that the expression of the endogenous ACTB gene remained largely unaffected following insertion (variation range: 0.2 - 1.3-fold), confirming the safety of this strategy. Conclusion This study provides a simple and efficient solution for stable integration of long-fragment gene, which has significant potential in engineered cell construction and in vitro transgenic model development.

Graphical abstract

关键词

CRISPR/Cas9系统 / 基因定点插入 / 长片段基因整合 / 单质粒系统 / 工程化细胞构建

Key words

CRISPR/Cas9 / site-specific integration / integration of long-fragment gene / single plasmid system / engineering cell construction

CRISPR/Cas9系统是源于细菌和古生菌的一种适应性免疫系统，该系统可针对性切除外来病毒及质粒整合在细菌基因组上的片段，从而抵抗外源性遗传物质的入侵^[1-2]。2012年发表的研究表明，CRISPR/Cas9系统通过特异性双RNA引导结构指导DNA内切酶Cas9进行DNA特异性位点的切割。该研究进一步简化了CRISPR/Cas9系统，提出设计特异性单RNA引导系统(single guide RNA，sgRNA)实现靶向特异基因位点的切割，奠定了CRISPR/Cas9基因组编辑技术发展的基础^[1,3-4]。该系统在特定位点诱导DNA双链断裂(double strand break，DSB)，激活内源性DNA修复途径——非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组修复(homology directed repair，HDR)^[5]。NHEJ通常导致碱基缺失或插入突变，而HDR在提供同源臂供体模板的情况下，可实现基因精准插入或替换。CRISPR/Cas9系统介导的精准基因编辑广泛应用于医学、生物技术、农业等领域，在基因改造模型构建^[6]、基因治疗^[7]和功能基因组学研究^[8]中具有重要意义。

虽然CRISPR/Cas9技术的快速发展使得基因组精准编辑成为可能，但长片段基因的定点整合仍面临许多挑战。理论上HDR可实现基因的精准定点插入，但事实上，HDR本身效率较低，并受NHEJ的竞争抑制，且基因编辑效率随插入基因片段长度的增加而下降^[9]。既往研究表明，当插入的基因片段长度超过3 kb时，HDR效率显著降低^[10]。先导编辑(prime editing，PE)技术的出现，减少了对DSB和HDR的依赖，但仅限于单碱基替换、小片段基因插入和敲除的编辑，无法实现长基因片段的整合。有研究提出，抑制NHEJ/NMEJ途径所必需的酶，可提高基因编辑的效率及精确度^[11-13]。此外，也有研究报道通过NHEJ途径而非HDR途径实现长片段基因在人原代T细胞中的整合^[14]。

在供体递送方面，病毒载体是目前递送CRISPR/Cas9系统进入细胞的最常见、高效的方法^[9]，但也存在一定局限性，如仅限于短基因片段的插入、表达易沉默、存在随机整合导致的安全风险等问题。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)最大包装容量仅为4.7 kb，面对体积庞大的CRISPR/Cas9基因编辑系统，常需要将递送系统分割为两个载体^[15]，或探索使用更小的Cas蛋白^[16-18]。在使用病毒载体时，转基因沉默也是进行复杂细胞工程改造的主要障碍，多种机制可使细胞沉默转入基因，如通过识别病毒顺式元件，实现基因或转录物的主动表观遗传沉默^[19]，且病毒DNA的随机整合也有导致肿瘤发生的风险^[20]。既往研究使用整合酶缺陷型慢病毒(integrase-deficient lentiviruses，IDLV)作为递送载体，实现了长片段基因的定点整合及稳定表达，且降低了病毒基因组随机整合的风险^[19]。

质粒系统因具有易构建、操作简便、成本相对较低等优点而备受关注。然而，现有的单质粒系统在长基因片段插入方面仍缺乏优化。因此，为实现长基因片段的整合，并优化现有递送系统的不足，本研究提出构建包含Cas9、sgRNA及同源重组供体模板的单一环状质粒载体。通过该载体，可将外源基因直接插入内源必需基因编码区的上游和阅读框内，使得插入基因受到内源基因启动子的调控，确保其长期稳定表达。

1 材料与方法

1.1 质粒与主要试剂

载体pLDDg-GFP-hACTB-Cas(靶向人源ACTB基因)、pLDDg-GFP-mActb-Cas(靶向鼠源Actb基因组)的克隆构建及质粒抽提均由通用生物(安徽)股份有限公司完成；转染试剂JetPRIME(101000046)购自Polyplus公司；磷酸缓冲液PBS(C10010500BT，Gibco)、0.25% EDTA胰酶(25200056，Gibco)、双抗-青/链霉素(10 000 IU/mL)、DMEM细胞培养基(C11995500BT，Gibco)均购自LifeTech公司，胎牛血清FBS(FND500)购自Excell公司；细胞冻存液购自上海碧云天生物有限公司。

1.2 重组载体构建与合成

本研究设计了一种环状单质粒载体，其大小为14 370 bp。该质粒将pCas9表达盒、U6启动子驱动的sgRNA表达盒以及同源重组供体模板整合于单一环状DNA中。对于sgRNA序列的设计，为了分别靶向人源β-肌动蛋白(ACTB)基因和小鼠源β-肌动蛋白(Actb)基因，通过chopchop网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计并筛选了邻近起始密码子附近且预测编辑效率高的sgRNA序列(表1)。HDR供体模板包含以下关键元件：位于外源基因两侧、长度约350 ~ 400 bp、与靶位点同源的5’和3’同源臂(homology arms，HAs)；绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为报告基因；以及用于连接GFP与下游ACTB或Actb靶基因的P2A连接序列。此外，在供体模板两端同源臂的外侧引入了一段含原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif，PAM)的sgRNA序列，该设计旨在使进入细胞后表达的Cas9-sgRNA复合物能够切割质粒上的PAM位点^[21]，从而将环状质粒线性化并释放出游离的HDR修复模板，理论上可提高模板利用效率。综上，将含PAM区的sgRNA序列-上游5’同源臂序列-GFP序列-P2A连接序列-下游3’同源臂序列-含PAM区的sgRNA序列-U6启动子-sgRNA序列-gRNA通用发夹序列，依次串联得到一条新的DNA拼接序列。采用化学合成基因法合成该DNA片段，并借助分子生物学中的无缝克隆技术将其连接至含pCas9表达盒的骨架载体中，得到最终靶向人ACTB基因的载体pLDDg-GFP-hACTB-Cas和靶向小鼠Actb基因的载体pLDDg-GFP-mActb-Cas(图1A)。该质粒进入细胞后的工作原理如图1B所示。

1.3 细胞培养、传代与转染

实验中HEK293T细胞(ATCC CRL-3216)、3T3细胞(ATCC CRL-1658)均来源于本课题组细胞冻存库。HEK293T细胞和3T3细胞的培养体系均为DMEM完全培养基(由90%DMEM、10%FBS及1%双抗配置)，并置于37℃、5% CO₂细胞培养箱进行培养。根据细胞的生长密度进行传代，传代比例为1∶3。提前一天将HEK293T、3T3细胞传代于6孔板中。次日，待密度达70% ~ 80%进行转染。按照转染试剂说明将4.0 μg质粒pLDDg-GFP-hACTB-Cas或pLDDg-GFP-mActb-Cas与100 μL JetPRIME®缓冲液温和混匀。在以上混合液中加入8.0 µL的jetPRIME®转染试剂，涡旋10 s，室温下静置孵育10 min。缓慢滴入HEK293T或3T3细胞孔中，4 ~ 6 h更新培养基，并放回CO₂细胞培养箱中。

1.4 单克隆细胞筛选

细胞转染两周后，通过显微镜观察细胞的绿色荧光信号，圈画含绿色荧光的细胞群体。采用装有DMEM培养基的200 µL移液枪吹打画圈区域的细胞，并快速收集至15 mL离心管，500 g离心3 min。取细胞沉淀加入适量0.25%胰酶进行消化，加入DMEM完全培养基中和并定容至10 mL。经计数后，取100个细胞再次重悬至10 mL DMEM完全培养基中，按照每孔100 µL量用排枪转移至96孔板中。

本研究使用显微镜成像系统(Nikon，Japan)对细胞进行成像。每日观察GFP荧光的变化情况，使用×10镜头对含GFP荧光视野区域拍照记录。

1.5 PCR扩增及测序鉴定

取少量单克隆细胞沉淀于1.5 mL EP管中，使用快速DNA提取检测试剂盒(KG203，TIANGEN)进行基因组DNA提取。取1 μL DNA以相应的特定引物进行PCR扩增(KT211，TIANGEN)，反应体系为20 μL。反应结束后，对产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪(Bio-Rad，USA)中拍照成像。根据预期扩增条带大小来判定，并进一步切胶测序。实验中使用的PCR引物序列均由通用生物(安徽)股份有限公司合成，具体引物序列见表1。

1.6 流式细胞学分析

按照常规步骤对不同组别的细胞进行消化，400 g离心5 min，弃上清。细胞沉淀用PBS再次重悬并计数，使其终浓度为10⁷ cells/mL。取等量的300 μL细胞悬液(3×10⁶ cells)，并通过70 μm细胞筛网(Falcon)过滤到流式管中，直接在FACSAria™ Ⅲ流式细胞仪(BD Biosciences，USA)上采集分析GFP荧光信号(使用激光488 nm)，最后，采用FlowJo™ v10.8.1软件进行数据分析。

1.7 qPCR分析

将不同克隆细胞采用RNA提取试剂盒(LS1040，TIANGEN)提取总RNA，并使用NanoDrop One分光光度计(Thermo Fisher，USA)进行浓度测定。取1 µg总RNA，使用逆转录试剂盒(KR118，TIANGEN)进行基因组DNA去除及逆转录，相关反应体系参照说明书，并将获得的cDNA稀释至10 ng/µL进行后续的qPCR反应。qPCR反应采用FastReal 快速荧光定量(SYBR Green)试剂盒(FP217，TIANGEN)在ABI7500实时PCR仪器(Thermo Fisher，USA)上进行，相关反应体系配置及反应程序均参照说明书，上游引物序列分别是qACTB-Forward：ACTGGAACGGTGAAGGTGAC；qACTB-Reverse：AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT；qGAPDH-Forward：AGCCACATCGCTCAGACAC；qGAPDH-Reverse：GCCCAATACGACCAAATCC；qActb-Forward：GCCATTCAGGCTGTGCTGTC；qActb-Reverse：CAGGTCCAGACGCAGGATGG；qGapdh-Forward：TACAGCAACAGGGTGGTGG AC；qGapdh-Reverse：TGGGATAGGGCCTCTCT TGCT。每个样本均设有3个平行重复，基因相对表达量以2^-ΔΔCt法计算得到。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.0软件进行数据处理及作图，qPCR结果以(\overline{x}\pm s)表示，组间比较采用单因素方差分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单质粒系统在人HEK293T细胞中实现长片段基因定点插入

为评估所构建的环状单质粒载体(图1A，设计细节见方法1.2)在长片段基因定点插入中的应用潜力，首先在人类HEK293T细胞中进行验证。通过阳离子聚合物转染方式将pLDDg-GFP-hACTB-Cas9载体递送至HEK293T细胞，并进行不间断地传代培养。通过在不同时间点进行荧光显微镜成像观察，发现Day1、Day3荧光表达较强，考虑细胞中存在质粒自身瞬时表达的情况，随时间推移及细胞传代稀释，细胞中游离质粒DNA逐渐消耗，表达绿色荧光的细胞逐渐减少，但始终存在部分细胞一直呈现荧光信号，初步认为持续呈现荧光信号的细胞是已成功整合GFP基因的细胞(图2)。

为进一步评估该单质粒系统的转染效率，分别用仅不含gRNA序列的pLDDg-No gRNA-GFP-hACTB-Cas9质粒(该质粒除不含gRNA序列外，其他序列与pLDDg-GFP-hACTB-Cas9质粒完全相同)和pLDDg-GFP-hACTB-Cas9质粒转染293T细胞。流式细胞学分析数据表明，在第6天293T No gRNA-GFP组GFP信号为0.87%，考虑存在质粒的瞬时表达，但未发生基因编辑(GFP整合现象)；而293T hACTB-GFP组仍存在5.3%的GFP阳性细胞，结合持久的荧光观察结果，证实在未经筛选的前提下该质粒体系可实现基因敲入效率约为5.3%(图3)。经无限稀释单克隆筛选并获得单克隆细胞株，通过荧光显微镜观察初步筛选出3株表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞293T C1、293T C2、293T C3(图4A)。为验证GFP是否成功实现定点敲入，本研究设计了一对特异性引物(表1)，一条引物靶向插入序列，另一条引物靶向非同源臂的细胞基因组区域。对敲入片段进行PCR扩增检测，预期发生正确敲入的细胞可检测到741 bp条带。结果显示，293T C1、293T C2、293T C3三株细胞均在750 bp附近出现特异性扩增条带(图4B)，与预期条带大小相符。进一步切取293T C1条带并进行Sanger测序。将测序结果与预期序列进行比对，结果显示，二者序列完全一致，充分证实GFP基因已精准插入预定基因位点(图4C)。

基金资助

国家自然科学基金(32371490)