粪菌移植对实验性牙周炎小鼠认知功能以及肠道菌群影响的研究

Effects of fecal microbiota transplantation on cognitive function and gut microbiota in experimental periodontitis mice

摘要

背景 肠道菌群可能介导牙周炎相关的认知功能损伤，但尚无直接证据表明调节肠道菌群能否改善这种损伤。 目的 本研究旨在探讨粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation，FMT)对实验性牙周炎小鼠认知能力和肠道菌群的影响，并探究肠道菌群在牙周炎相关认知功能减退中的作用机制。 方法 将48只C57BL/6小鼠随机分为4组(每组n=12)：对照组(control，C)，牙周炎组(periodontitis，P)，牙周炎+对照粪菌移植组(C-P)，对照+牙周炎粪菌移植组(P-C)。采用丝线结扎诱导实验性牙周炎，8周后隔日灌胃粪菌悬浊液，持续2周。通过旷场实验、新物体识别实验和Y迷宫实验评估小鼠焦虑样行为和认知功能。收集粪便样本进行16S rRNA基因测序分析肠道菌群变化。采用酶联免疫吸附法检测血清及脑组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白细胞介素(interleukin，IL)-1β水平，免疫印迹法检测血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达。 结果 牙周炎诱导小鼠牙槽骨吸收(P＜0.001)，并导致小鼠空间工作记忆和物体识别能力受损(P＜0.05)。同时，牙周炎组小鼠血清及脑组织中TNF-α和IL-1β水平升高(P＜0.05)，血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达降低(P＜0.05)。16S rRNA测序分析显示，牙周炎组小鼠肠道中Muribaculum和Colidextribacter菌属丰度增加(P＜0.05)。FMT治疗改善牙周炎小鼠的牙槽骨吸收(P＜0.001)和认知功能(P＜0.05)，同时降低炎症因子水平(P＜0.01)，并恢复血脑屏障完整性(P＜0.05)。 结论 FMT 可能通过调节肠道菌群平衡、减轻全身及脑组织炎症反应，并修复血脑屏障损伤，从而改善牙周炎相关的认知功能减退。

Abstract

Background The gut microbiota may mediate cognitive impairment associated with periodontitis, but there is no direct evidence indicating whether modulating the gut microbiota can ameliorate such impairment. Objective To investigate the effects of fecal microbiota transplantation (FMT) on cognitive function and gut microbiota in experimental periodontitis mice and elucidate the mechanisms by which gut microbiota influences periodontitis-related cognitive decline. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into four groups (n=12 per group): control group (C), periodontitis group (P), periodontitis + control FMT group (C-P), and control + periodontitis FMT group (P-C). Experimental periodontitis was induced by silk ligation. After 8 weeks, fecal microbiota suspensions were administered via gavage every other day for 2 weeks. Anxiety-like behavior and cognitive function were assessed using open field test, novel object recognition test, and Y-maze test. Fecal samples were collected for 16S rRNA gene sequencing to analyze changes in gut microbiota. Serum and brain levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were measured by ELISA. The expression of blood-brain barrier tight junction proteins ZO-1 and Occludin was detected by Western blot. Results Periodontitis induction led to alveolar bone resorption in mice (P＜0.001) and impaired spatial working memory and object recognition (P＜0.05). Meanwhile, serum and brain levels of TNF-α and IL-1β were increased in the periodontitis group (P＜0.05), while the expression of blood-brain barrier tight junction proteins ZO-1 and Occludin was decreased (P＜0.05). 16S rRNA sequencing revealed an increased abundance of Muribaculum and Colidextribacter genera in the gut microbiota of periodontitis mice (P＜0.05). FMT treatment improved alveolar bone resorption (P＜0.001) and cognitive function (P＜0.05) in periodontitis mice, reduced inflammatory cytokine levels (P＜0.01), and restored blood-brain barrier integrity (P＜0.05). Conclusion FMT may ameliorate periodontitis-related cognitive decline by modulating gut microbiota balance, reducing systemic and brain inflammation, and repairing blood-brain barrier damage.

Graphical abstract

关键词

牙周炎 / 16S rRNA / 认知功能 / 粪菌移植 / 肠道菌群

Key words

periodontitis / 16S rRNA / cognitive function / fecal microbiota transplantation / gut microbiota

牙周炎是一种以牙周附着丧失和牙槽骨进行性吸收为特征的慢性炎症性疾病，是导致牙齿丧失的主要原因^[1]。其病理影响远超出口腔范围，可通过引发系统性炎症反应损害全身健康^[2]。近年来，微生物-肠-脑轴的发现为理解牙周炎与神经系统疾病(如认知功能障碍)的关联提供了新视角^[3-4]。

研究证实，牙周炎可通过“口腔-肠道-脑轴”途径损害认知功能，其核心机制在于牙周致病菌(如牙龈卟啉单胞菌、核梭杆菌等)或其代谢产物可迁移至肠道，破坏菌群稳态和肠黏膜屏障，导致内毒素和促炎细胞因子进入循环，进而破坏血脑屏障并诱发神经炎症^[5-6]。动物实验提示，移植牙周炎患者的唾液菌群可改变小鼠肠道菌群并诱发认知损伤^[7]。然而，一个关键的科学问题仍未解决，即通过调节肠道菌群稳态能否逆转这一病理过程？

粪便菌群移植作为一种能直接重建肠道微生态的疗法^[8]，在干预神经系统性疾病方面展现出潜力^[9]，其机制可能涉及调节菌群、修复屏障及减轻炎症^[10]。基于此，本课题组提出假说，即FMT可通过纠正牙周炎引起的肠道菌群失调，从而缓解认知损伤。本研究拟通过建立牙周炎小鼠模型，综合运用行为学、微生物组学和分子生物学方法，系统评估FMT的治疗效果，旨在为防治牙周炎相关的认知障碍提供新思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2023年5月至2024年1月，选择8周龄的雄性C57BL/6J小鼠48只，质量在22 ~ 26 g。小鼠由北京华阜康生物技术股份有限公司提供[许可证号：SCXK(京)2019-0008]。将小鼠饲养在(24±2)℃，40% ~ 70%湿度，12 h光/暗循环的环境下，允许自由获取食物和水。实验开始前小鼠在该环境适应性喂养一周。动物实验已通过军事科学院军事医学研究院实验动物管理与使用委员会审批(审查编号：IACUC-DWZX-2021-590)。

1.2 主要实验器材、仪器

非吸收性外科缝线(扬州环宇医疗器械有限公司)、灌胃针(上海玉研科学仪器有限公司)、台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf)、Micro-CT(德国Siemens)、电子天平(德国Sartorius)、制冰机(美国Scotsman)、测序仪(美国Illumina)。

1.3 主要试剂

3%戊巴比妥钠(北京博奥派克生物科技有限公司)、FastPfu Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA试剂盒、速纯粪便DNA提取试剂盒(上海敏杰生物科技有限公司，中国)。

1.4 实验分组与模型建立

48只小鼠适应性喂养一周后，随机分为2组：对照组(control，C)和牙周炎组(periodontitis，P)。采用经典的结扎法建立牙周炎模型，经麻醉后，在小鼠双侧上颌第一、二磨牙之间放置无菌丝线并持续结扎8周，其间每周检查，确保丝线位置稳定。造模6周后，将对照组小鼠随机分为对照组(C)和对照+牙周炎粪菌移植组(P-C)，牙周炎组小鼠随机分为牙周炎组(P)和牙周炎+对照粪菌移植组(C-P)，最终形成4个实验组。基于前期研究，造模8周能稳定诱导出牙槽骨吸收和认知功能损伤，适用于评估FMT对已确立病理状态的治疗潜力^[11]。因此，在第7周与第8周，对C-P组与P-C组小鼠实行干预，隔日进行一次粪菌移植治疗。

1.5 粪便菌群移植

第6周开始，分别隔天收集C组和P组小鼠的新鲜粪便颗粒(2 ~ 3粒/只)。所有操作需要的器械与耗材均经高压蒸汽灭菌。迅速将粪便颗粒置于预冷的去离子水中，配制成浓度为100 mg/mL的悬浊液。使用无菌匀浆器在冰上间歇性研磨，避免产生过多热量。接着，将粗制悬液在4℃条件下，以800 × g离心5 min，以去除大颗粒杂质。小心收集上清液，即为所需粪菌悬液，置于冰上保存，并确保在制备后1 h内用于灌胃，以最大限度保持微生物活性。本实验的小鼠粪菌移植参考了标准化方案进行^[12]。受体小鼠即C-P组和P-C组小鼠于造模第7周起，每2 d接受一次新鲜制备的菌悬液灌胃(200 μL/只)，持续2周。C组和P组以同等体积的无菌生理盐水灌胃。

1.6 行为学实验

实验结束时，对4组小鼠依次进行以下行为学测试，测试间隔24 h，均在相同时间段进行以减少昼夜节律影响。

1.6.1 旷场实验

用于评估小鼠的自主活动以及焦虑样行为。将小鼠置于40 cm × 40 cm × 40 cm旷场箱中心，记录其10 min内的活动。使用Graphprism软件分析总运动距离及在中心区域停留时间。在边缘区域停留时间越长、进入中心区域时间越短，提示焦虑样行为越明显。

1.6.2 Y迷宫实验

用于评估空间工作记忆。Y迷宫由三个等长、互成120°的黑色塑料臂(标记为A、B、C)构成。将小鼠置于迷宫中央，允许其自由探索7分钟，记录其进入各臂的顺序。一次完整的自发交替定义为连续进入3个不同臂(如A-B-C)自发交替率(%)=[(自发交替次数)/(总进臂次数-2)]×100%。

1.6.3 新物体识别实验

用于评估学习与记忆能力。实验共3天。第1天(适应)，将小鼠单独放入空旷箱自由探索20分钟。第2天(熟悉)，在箱内固定位置放置两个相同物体(A1、A2)，记录小鼠在10 min内探索两物体的总时间。第3天(测试)，将A2替换为一个新物体(B)，记录小鼠在5 min内探索旧物体(A1)与新物体(B)的时间。识别指数以探索新物体的时间占总探索时间的百分比表示。

1.7 样本收集

(1)粪便样本：于末次FMT干预后24 h，将各组小鼠单独置于无菌笼具，使用无菌器械收集新鲜粪便颗粒3 ~ 5粒，立即置于-80℃保存，用于肠道菌群分析。

(2)组织样本：行为学测试结束后，麻醉并处死小鼠。采集眼球血，4℃、12 000 rpm、10 min离心，取血清，分装冻存于-80℃。迅速取脑，于冰上分离海马组织，一部分用于蛋白提取，一部分匀浆后离心取上清，用于炎症因子检测。收集上颌骨，剥离软组织后，固定于4%多聚甲醛中，用于Micro-CT分析。

1.8 Micro-CT观察骨吸收情况

固定后的上颌骨样本使用Micro-CT扫描。扫描参数：电压50 kV，电流114 μA，分辨率50 μm。利用MIMICS软件进行三维重建。使用Image J软件，于上颌第一磨牙的腭侧和颊侧，分别测量近中、中央、远中3个位点的釉牙骨质界(cemento-enamel junction，CEJ)至牙槽嵴顶(alveolar bone crest，ABC)的垂直距离，取6个位点的平均值作为该样本的牙槽骨丧失量。

1.9 血清及海马组织炎症因子(TNF-α、IL-1β)检测

严格按照商品化ELISA试剂盒说明书操作，分别检测血清及海马组织匀浆上清中TNF-α和IL-1β水平。使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度，根据标准曲线计算样品浓度。

1.10 免疫印迹法检测ZO-1、Occludin蛋白的表达情况

取海马组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液匀浆，提取总蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，后转印至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，随后与一抗4℃孵育过夜：兔抗ZO-1(1∶1 000)、兔抗Occludin(1∶5 000)，以GAPDH(1∶5 000)作为内参。次日，室温孵育HRP标记的羊抗兔二抗(1∶50 000) 1 h。使用ECL化学发光试剂显影，通过Image J软件分析目标条带的灰度值，以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值进行半定量分析。

1.11 肠道菌群16S rRNA基因测序与分析

DNA提取与测序，使用FastPure Stool DNA Kit提取粪便微生物总DNA；以338F/806R引物对16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增；扩增产物经纯化、建库后，在Illumina Nextseq2000平台进行双端测序。

生物信息学分析，使用QIIME2流程处理原始数据。经DADA2降噪后获得扩增子序列变异(amplicon sequence variants，ASVs)表。使用Naive Bayes分类器进行物种注释。使用以下方法进行组间比较：(1)Alpha多样性。采用Chao1指数(物种丰富度)和Shannon指数(物种多样性)。(2)Beta多样性。采用基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(principal coordinates analysis，PcoA)和非度量多维尺度分析(nonmetric multi-dimensional scaling，NMDS)评估群落结构差异。(3)物种组成。在门和属水平展示群落结构。(4)功能预测。使用PICRUSt2工具预测菌群代谢功能，并进行KEGG通路注释。

1.12 统计学分析

采用GraphPadPrism10软件进行统计分析。所有实验数据均以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；采用R软件对肠道菌群测序结果进行Kruskal-Wallis检验；采用Spearman相关分析细菌相对丰度与其他实验结果的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FMT对实验性牙周炎小鼠牙槽骨吸收的影响

为评估菌群移植对实验性牙周炎小鼠牙槽骨的保护作用，本研究在建立牙周炎模型8周后，进行了为期两周的菌群移植干预实验。Micro-CT三维重建分析结果显示，与对照组相比，牙周炎组小鼠表现出的牙槽骨吸收现象；牙周炎+对照粪菌移植组牙槽骨吸收程度减轻；而对照+牙周炎粪菌移植组小鼠，未观察到明显的牙槽骨吸收。通过定量分析釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离(cemento-enamel junction to alveolar bone crest，CEJ-ABC)发现，牙周炎组骨吸收程度高于对照组(P＜0.001)，牙周炎+对照粪菌移植组小鼠牙槽骨吸收程度减轻(P＜0.001)；而对照+牙周炎粪菌移植组小鼠，其骨吸收程度与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。由此可知，结扎法可成功诱导小鼠牙槽骨吸收，而健康供体来源的菌群移植能改善牙周炎导致的牙槽骨吸收状况(图1)。

2.2 FMT对实验性牙周炎小鼠行为学的影响

为了评估菌群移植对实验性牙周炎小鼠焦虑样行为以及认知功能的影响，本研究在FMT干预后进行了系统的行为学评估，包括旷场实验、Y迷宫实验和新物体识别实验。旷场实验分析表明，各组小鼠的总运动距离以及进入中心区域时间无统计学差异。Y迷宫实验结果显示，牙周炎组小鼠自发交替率低于对照组(P＜0.05)，经牙周炎+对照粪菌移植组小鼠自发交替率无统计学差异。新物体识别实验分析显示，牙周炎组小鼠辨识指数低于对照组(P＜0.05)；对照组菌群移植治疗改善了牙周炎小鼠识别能力(P＜0.05)。以上数据表明，8周的牙周炎结扎诱导未引起小鼠的焦虑样行为；牙周炎可导致小鼠空间工作记忆和物体识别记忆功能受损，而对照组来源的菌群移植能有效改善牙周炎引起的物体识别记忆功能，使其恢复至正常水平(图2)。

2.3 FMT对实验性牙周炎小鼠血脑屏障完整性及全身和脑组织炎症因子的影响

为了探究FMT改善实验性牙周炎小鼠认知功能的机制，本研究采用蛋白印记法和酶联免疫吸附实验，检测各组小鼠血脑屏障紧密连接蛋白与炎症因子水平。研究发现，与对照组相比，牙周炎组小鼠脑组织中ZO-1和Occludin蛋白表达量下降(P＜0.05)，而牙周炎+对照粪菌移植组小鼠脑组织的ZO-1和Occludin蛋白水平上升(P＜0.05)；对照+牙周炎粪菌移植组脑组织中ZO-1和Occludin蛋白水平降低(P＜0.01；P＜0.05；A-B)。炎症因子检测结果显示，牙周炎组小鼠血清中TNF-α及IL-1β含量高于对照组(P＜0.001；P＜0.05)；FMT治疗后，牙周炎+对照粪菌移植组小鼠血清中TNF-α及IL-1β水平降低(P＜0.001；P＜0.01)，P-C组TNF-α水平增高(P＜0.01)；在脑组织中，牙周炎组小鼠的TNF-α及IL-1β含量同样高于对照组(P＜0.05；P＜0.01)，且牙周炎+对照粪菌移植组小鼠脑组织的IL-1β水平降低(P＜0.01)。综上，本研究结果表明，FMT治疗能够降低牙周炎小鼠全身炎症因子水平，有效改善血脑屏障损伤程度，为FMT改善实验性牙周炎小鼠认知功能提供了重要依据(图3)。

2.4 FMT对实验性牙周炎小鼠肠道菌群的影响

2.4.1 FMT对实验性牙周炎小鼠肠道菌群多样性的影响

为了探讨FMT怎样调节结扎诱导的认知功能下降小鼠模型的微生物群落结构，对各组小鼠粪便样本进行16S RNA测序。首先，进行Alpha多样性分析评价细菌种类的丰富度和多样性。结果显示，4组小鼠Chao和Shannon指数差异均具有统计学意义(P=0.048；P=0.003)；与对照组比较，牙周炎组的Chao指数和Shannon指数升高(P=0.006；P＜0.001)；经牙周炎+对照粪菌移植组小鼠Chao指数和Shannon指数降低(P=0.032；P＜0.001)。其次，对照组和牙周炎+对照粪菌移植组之间的α-多样性没有差异(Chao指数：P=0.504；Shannon指数：P=0.640)；牙周炎组和对照+牙周炎粪菌移植组之间的α-多样性没有差异(Chao指数：P=0.335；Shannon指数：P=0.550)。基于Bray-Curtis距离算法在ASV水平上对4组样本进行主坐标(principal co-ordinates analysis，PCoA)和非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析评价各组群落结构差异。结果均显示，不同组间肠道菌群分布有分离(P=0.001)。以上数据提示，牙周炎可影响小鼠肠道菌群的丰富度和多样性以及改变小鼠肠道菌群结构，且FMT诱导了小鼠肠道微生物组成的改变，接受FMT的组别小鼠的肠道微生物组成与其供体组别密切匹配，表明微生物整合有效(图4)。

2.4.2 FMT对实验性牙周炎小鼠肠道菌群组成的影响及分类学分析

为了进一步确定FMT对肠道菌群结构的调控作用，本研究在门和属水平开展微生物丰度差异分析，重点关注特定菌群的丰度变化。通过韦恩图分析来描述各组菌群组成的相似性。结果显示，四组共有4 918个ASVs，对照组与牙周炎组共有29个ASVs，对照组与接受对照组FMT的牙周炎组共有32个ASVs，牙周炎组与接受牙周炎FMT的对照组共有63个ASVs；对照组、牙周炎组、牙周炎+菌群移植组、对照+菌群移植组独有的ASVs分别为1 440、1 887、1 632和1 766个(图5)。

为了进一步确定与牙周炎引起的认知功能下降发生相关的关键细菌，本研究比较了各组不同分类水平上微生物的相对丰度。属水平上相对丰度大于0.01%、总体显著性小于0.05的不同微生物的详细数据可见表。按样品中的相对丰度排序比较各组间肠道菌群的构成，门和属水平上可观察到各组微生物组成的变化。属水平上，各组间Allobaculum (P=0.010)、Parasutterlla (P=0.019)、Lactobacillus (P=0.006)、Alistipes (P=0.018)、Muribaculum (P＜0.001)和Colidextribacter (P＜0.001)的总体差异具有统计学意义。利用柱状图进一步显示这6个属的详细信息。与对照组比较，牙周炎组Allobaculum和Parasutterlla的丰度降低(P=0.007；P=0.015)，而Lactobacillus、Alistipes、Muribaculum和Colidextribacter的丰度增加(P=0.005；P=0.004；P=0.011；P＜0.001)。与牙周炎组相比，经牙周炎+对照粪菌移植Lactobacillus、Alistipes、Muribaculum和Colidextribacter的丰度降低(P=0.027；P=0.018；P=0.002；P=0.006)，Allobaculum和Parasutterlla的丰度升高(P=0.041；P=0.014)。综上可知，牙周炎可使小鼠肠道菌群结构发生改变，且FMT可调控肠道菌群组成，使其向供体菌群方向偏移，提示FMT可能通过重塑肠道菌群缓解牙周炎相关的认知功能下降(图5，表1)。