S1PR3对肝细胞癌恶性生物学行为的影响及其机制研究

Effect of S1PR3 on malignant biological behavior of hepatocellular carcinoma and exploration of its mechanism

摘要

背景 1-磷酸鞘氨醇受体3(sphingosine-1-phosphate receptor 3，S1PR3)在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，但S1PR3在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的具体功能尚不明确。 目的 探讨S1PR3对HCC恶性生物学行为的影响及其作用机制。 方法 人肝癌细胞系Huh7和HepG2细胞随机分为两组，分别采用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和S1PR3特异性抑制剂TY-52156处理，通过CCK-8实验检测细胞增殖能力，Transwell实验评估细胞迁移与侵袭能力，转录组测序筛选差异表达基因及潜在信号通路，Western blot验证关键分子表达，建立肝细胞癌类器官模型，通过CellTiter-Glo实验检测抑制剂处理后的细胞活力。 结果 与对照组相比，CCK-8实验与Transwell实验显示TY-52156可以抑制Huh7和HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭(P＜0.05)。转录组测序及后续分析提示，精氨基琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1，ASS1)可能作为S1PR3的下游效应分子参与调控过程。Western blot结果显示抑制S1PR3可上调ASS1表达(P＜0.05)。在类器官模型中，CellTiter-Glo实验提示，TY-52156处理后，与对照组相比可引起肿瘤类器官模型死亡(P＜0.001)。 结论 抑制S1PR3可削弱HCC细胞系的增殖、迁移及侵袭能力；ASS1作为S1PR3的下游差异表达分子，其表达水平可被S1PR3负调控；S1PR3抑制剂可有效杀伤HCC类器官。

Abstract

Background Sphingosine-1-phosphate receptor 3 (S1PR3) plays an important role in the development and progression of various tumors; however, its specific function in hepatocellular carcinoma (HCC) remains unclear. Objective To investigate the impact of S1PR3 on the malignant biological behavior of hepatocellular carcinoma (HCC) and elucidate its underlying mechanisms. Methods The human hepatocellular carcinoma cell lines Huh7 and HepG2 were randomly devided into two groups, and treated with the SIPR3-specific inhibitor TY-52156 and dimethyl sulfoxide (DMSO) separately. Cell proliferation was assessed by CCK-8 assay; migration and invasion abilities were evaluated using Transwell assays; differentially expressed genes and potential signaling pathways were identified by transcriptome sequencing; key molecular expression levels were verified by Western blot; additionally, a hepatocellular carcinoma organoid model was established, and cell viability after inhibitor treatment was measured by CellTiter-Glo assay. Results Compared with the control group, CCK-8 and Transwell assays showed that TY-52156 significantly inhibited the proliferation, migration, and invasion of Huh7 and HepG2 cells (P＜0.05). Transcriptome sequencing and subsequent analyses suggested that argininosuccinate synthetase 1 (ASS1) night act as a downstream effector of S1PR3 in this regulatory process. Western blot results demonstrated that S1PR3 inhibition upregulated ASS1 expression (P＜0.05). In the organoid model, CellTiter-Glo assay revealed that TY-52156 treatment induced significant death of tumor organoids (P＜0.001). Conclusion Inhibition of S1PR3 reduces the proliferation, migration, and invasion capacities of HCC cell lines. As a downstream differentially expressed molecule of S1PR3, ASS1 is negatively regulated by S1PR3. The S1PR3 inhibitor effectively kills HCC organoids.

Graphical abstract

关键词

肝细胞癌 / S1PR3 / TY-52156 / ASS1 / 类器官

Key words

hepatocellular carcinoma / S1PR3 / TY-52156 / ASS1 / organoid

在我国，原发性肝癌的发病率居恶性肿瘤第4位，致死率居第2位，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占75% ~ 85%^[1]。HCC起病隐匿，部分患者就诊时已不适合接受根治性治疗(如手术切除)，因此系统抗肿瘤治疗在中晚期肝细胞癌的全程管理中占据核心地位^[2]。由于肿瘤的高度异质性，一些患者对当前靶向药物表现出原发或继发耐药。加之HCC有高复发转移风险，患者总体生存率仍不理想^[3]。深入揭示HCC发生发展的新分子机制，挖掘能够预测疾病进展的新型生物标志物与治疗靶点，对提升患者生存率具有迫切而重要的临床价值^[4]。

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是一种脂质介质，由鞘氨醇经鞘氨醇激酶催化磷酸化生成^[5]。S1P与癌症、心脑血管疾病、自身免疫性疾病、感染、糖尿病等疾病密切相关^[6-9]。同时S1P具有自分泌和旁分泌活性，可通过细胞表面的S1P受体及细胞内信号通路发挥作用^[10]。在已知的5种S1P受体中，1-磷酸鞘氨醇受体3(sphingosine-1-phosphate receptor 3，S1PR3)在多种癌症(如肺癌、肾癌和口腔癌等)中发挥促进癌细胞增殖、迁移和侵袭的重要作用^[11-13]。研究显示HCC患者血清中S1P水平升高^[14]。有报道表明S1PR3可提高HCC中癌症干细胞样细胞的比例^[15]。进一步探究S1PR3在HCC中的功能机制具有重要意义。TY-52156作为S1PR3的一种特异性抑制剂已经被广泛应用于多项研究^[16]。TY-52156可抑制乳腺癌及急性淋巴细胞性白血病的进展，但对肝细胞癌的作用尚不清楚^[17-18]。本研究使用TY-52156抑制S1PR3，以系统评估其对肝细胞癌恶性生物学行为的影响及其机制，探索S1PR3作为治疗靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

人HCC细胞系Huh7、HepG2购自中国细胞库，肝细胞癌类器官及类器官培养检测系统定制于黑玉科学公司。

1.2 主要试剂

标准胎牛血清(上海源培，S660KJ)，青霉素/链霉素双抗(上海源培，S110JV)，DMEM培养基(上海源培，L130KJ)，PBS(上海源培，B310KJ)，细胞消化液Accutase(Gbico，00-4555-56)，类器官培养基试剂盒(黑玉科学，DJ2805-HCC)，CCK-8(Beyotime，C0042)，TRIzol(Beyotime，R0016)，BCA法蛋白检测试剂盒(Solarbio，PC0020)，PVDF膜(Millipore，IPVH00010)，PET膜细胞小室(Kirgen，K56024)，4%多聚甲醛固定液(Beyotime，P0099)，结晶紫染色液(Beyotime，C0121)，基质胶(Corning，356231)，VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit 试剂盒(Vazyme，NR616-02)，TY-52156(MCE，HY19736)，抗S1PR3抗体(Abcam，ab170952)，羊抗兔-HRP(Bioss，bs-0295G-HRP)，GAPDH(Proteintech，10494-1-AP)；celltiter-glo试剂盒(Promega，G7573)。

1.3 细胞培养

人HCC细胞系Huh7、HepG2均使用含有10%标准胎牛血清和1%青霉素/链霉素双抗的DMEM，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.4 CCK-8实验检测细胞增殖情况

重悬细胞，将细胞接种于96孔板中(2×10³ /孔)，随机分为两组，分别用20 μM TY-52156和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)处理。两组细胞分别在0 h、24 h、48 h和72 h加入10 μL CCK-8试剂。在37℃培养箱中孵育1 h，测量各孔在450 nm处的吸光值。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况

将密度为10×10⁴/mL的细胞悬液以200 μL/孔接种至Transwell上室(无血清培养基)，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL。在上下室中加入TY-52156调整其浓度为20 μM，并设置一组使用DMSO处理作为对照。培养48 h后，采用4%多聚甲醛固定细胞15 min，经结晶紫染色后，采用倒置显微镜对迁移至下室的细胞进行计数分析。侵袭实验中将基质胶与DMEM培养基按照1∶8比例稀释后，加入Transwell小室，37℃孵育4 h使其凝固。而后操作步骤迁移实验。

1.6 Western blot检测ASS1的表达情况

采用20 μM TY-52156和DMSO分别处理细胞72 h后提取细胞总蛋白，采用BCA法蛋白检测试剂盒测定精氨基琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1，ASS1)浓度。经SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转至PVDF膜上。膜在4℃下与相应一抗(GAPDH 1∶5 000稀释、ASS1 1∶20 000稀释)孵育过夜，再与相应二抗孵育。采用增强化学发光试剂在成像系统中显影，并通过Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.7 转录组测序

采用20 μM TY-52156和DMSO分别处理细胞72 h后，采用TRIzol试剂提取总RNA。使用NanoDrop2000分光光度计鉴定RNA纯度和定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性。使用VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit试剂盒说明书构建转录组文库。转录组测序由上海欧易生物技术有限公司进行。

1.8 类器官培养及CellTiter-Glo检测活力

观察类器官细胞团块直径达到200 μm时，收集类器官于15 mL离心管中，300 g离心3 min。弃上清，加入1 mL TryplE消化3 min后，吹打细胞至肉眼观察无明显颗粒物。重悬于类器官培养基中，加入基质胶后接种于24孔超低吸附板中静置固化，固化完成后补加培养基，每2 ~ 3 d更换一次培养基^[19]。分别用20 μM TY-52156和DMSO处理类器官，于处理后的0 h、24 h、48 h及72 h，每孔加入30 μL CellTiter-Glo试剂。将培养板振荡15 min，室温避光孵育15 min。孵育结束后，每孔取70 μL混合液转移至白色不透明板中，检测发光强度。

1.9 统计学分析

数据分析和图表显示均通过GraphPad Prism 9.1.0软件实现。实验结果的测量数据采用均数±标准差进行表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制S1PR3可以抑制肝细胞癌细胞系Huh-7和HepG2的增殖、迁移和侵袭能力

本研究采用两株经典肝细胞癌细胞系——高转移性的Huh-7和分化较好的HepG2——以评估S1PR3功能的普适性。采用S1PR3特异性抑制剂TY-52156对Huh7和HepG2两种肝细胞癌细胞系进行处理。CCK-8细胞增殖实验结果表明，与对照组相比，经TY-52156处理后的Huh-7和HepG2细胞的增殖能力均受到抑制(P＜0.01)。通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化，发现TY-52156处理可减弱Huh-7和HepG2细胞的迁移(P＜0.01)与侵袭(P＜0.05)能力。见图1。

2.2 S1PR3负调控下游分子ASS1表达

分别使用S1PR3抑制剂TY-52156和溶剂对照DMSO处理Huh7和HepG2细胞系，并进行RNA测序分析。火山图所示，两组处理条件下均鉴定出大量差异表达基因。进一步取Huh7和HepG2细胞系中共同差异表达的基因，共获得13个交集基因。KEGG通路富集分析结果显示，在Huh7和HepG2细胞系中，这些差异基因均显著富集于“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路”。在交集基因列表中，精氨基琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1，ASS1)基因与该代谢通路密切相关，为验证ASS1在蛋白水平的变化，Western blot检测了抑制S1PR3后ASS1的表达情况，结果显示TY-52156处理组中ASS1蛋白表达水平比DMSO对照组高(P＜0.05)。见图2。

2.3 S1PR3抑制剂能够有效杀伤肝细胞癌类器官

为在更接近体内模型的条件下评估S1PR3抑制对肝细胞癌的影响，采用患者来源的组织建立肝细胞癌类器官模型。经DMSO处理的对照组类器官形态完整，球体圆润，边界清晰，生长状态良好。与之相比，经TY-52156处理后，类器官随时间推移出现明显的形态学改变：球体逐渐崩解、结构松散，边缘模糊。通过用CellTiter-Glo方法检测活力，结果显示处理48 h后，实验组类器官细胞活性完全丧失，表明TY-52156可导致类器官彻底死亡(P＜0.001)。见图3。

3 讨论

HCC是一种具有高发病率与病死率的恶性肿瘤，其进展迅速、易耐药及高转移率的特性使得探索新的治疗靶点至关重要^[1-4]。S1P信号通路被证实在多种癌症中参与调控细胞存活、迁移与代谢重编程^[5-10]。其中，受体S1PR3在多种恶性肿瘤中表现出促癌功能^[11-13]，但其在HCC中的具体功能与机制尚未完全阐明。本研究首次系统性地证实了S1PR3在HCC细胞增殖、迁移及侵袭中的关键作用，并揭示其可能通过抑制ASS1的表达来驱动肿瘤进展。本研究在患者来源的肝细胞癌类器官模型中验证了S1PR3靶向抑制的强大抗肿瘤效果，为将该分子作为潜在治疗靶点提供了新的实验依据。

本研究通过特异性抑制剂TY-52156证实了S1PR3对HCC细胞系Huh7和HepG2恶性表型的促进作用并通过转录组测序与生物信息学分析，将S1PR3的下游效应分子锁定为ASS1。ASS1是尿素循环和天冬氨酸代谢中的关键酶，近年来被发现在多种实体瘤中发挥抑癌功能^[20-24]。本研究在蛋白水平验证了抑制S1PR3可显著上调ASS1的表达。这与先前报道中ASS1高表达与肝细胞癌患者良好预后相关、并能抑制肝细胞癌细胞生长的结论相一致^[25]。已有综述系统性地指出，S1P信号通路通过受体(如S1PR3)介导PI3K/Akt、MAPK等下游通路导致代谢平衡的破坏是肿瘤发生发展的关键环节^[26]。本研究推测，S1PR3可能通过这些下游信号通路抑制了ASS1的转录表达，导致细胞内天冬氨酸代谢重编程，进而促进嘧啶合成、维持肿瘤细胞快速增殖所需的原料供应，并可能增强肿瘤干细胞特性^[27-28]。这与Tsai等^[15]的研究相呼应，即S1PR3信号与HCC中癌症干细胞比例的维持有关。因此，本研究提出一个潜在的工作模型：“S1PR3信号激活→抑制ASS1表达→触发天冬氨酸/嘧啶代谢重编程→促进HCC细胞增殖、干性及转移”。同时也有研究表明，ASS1的抑癌功能不仅局限于调控细胞增殖，其在肿瘤侵袭转移过程中同样发挥关键作用：一方面，ASS1可通过调节STAT3的磷酸化抑制分化抑制因子1影响HCC的迁移侵袭^[29]；另一方面，ASS1表达升高能够促进L-精氨酸的生成进而削弱HCC细胞的转移能力^[30]。结合本研究中观察到的TY-52156对Huh7和HepG2细胞迁移侵袭的显著抑制作用，ASS1很可能是S1PR3同时调控肝细胞癌增殖与转移的共同下游关键分子。当然，ASS1下游精确的代谢物变化与信号网络仍需后续代谢组学与分子实验进一步解析。

为了在更接近人体肿瘤微环境的体系中评估S1PR3的靶向价值，本研究采用了患者来源肝细胞癌类器官模型。肿瘤类器官模型(patient-derived tumor organoid，PDO)能够三维模拟原发肿瘤的组织架构、细胞异质性及药物反应，尤其能保留肿瘤内癌症干细胞的异质性，该异质性是导致治疗耐药和复发的核心原因^[31]。本研究中，TY-52156处理导致了类器官结构的迅速崩解与细胞活力的完全丧失，其杀伤效果甚至比二维细胞培养模型更为显著和彻底。这一结果在技术层面也得到了最新研究的支持：微型化、高通量的PDO培养与检测平台已经成熟，能够实现对药物反应的稳健、可重复评估，极大地增强了临床前药物测试的生理相关性和预测价值^[32]。本研究在PDO层面的成功验证，不仅强有力地支持了S1PR3作为治疗靶点的可行性，也展示了利用PDO模型进行靶点快速验证的策略优势。

当然，本研究也存在一些局限性。第一，S1PR3调控ASS1转录的具体上游信号传导通路尚未完全阐明。第二，本研究主要关注了ASS1介导的细胞自主性增殖与迁移表型，而S1P信号通路已被证实能通过影响肿瘤相关免疫细胞的功能，深刻塑造免疫抑制性微环境^[26]，因此，S1PR3-ASS1轴是否以及如何通过调控肿瘤细胞代谢，进而影响微环境中免疫细胞的功能，是一个极具潜力的研究方向。第三，尽管类器官模型极具价值^[33]，但在动物体内模型中验证TY-52156的药效、药代动力学及系统性毒性，是将该靶点推向临床的必经步骤，这也是本课题组下一步重点研究的方向。

综上所述，本研究揭示了S1PR3在HCC中通过负调控抑癌基因ASS1来促进肿瘤进展的新机制，并在类器官模型中证实了靶向S1PR3的有效性。这些发现不仅拓展了研究人员对S1P信号通路在肝细胞癌中作用的认识，也为开发以S1PR3为靶点的新型肝细胞癌治疗策略提供了重要的理论依据和实验基础。

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