包封负载EGCG的介孔聚多巴胺纳米粒子的壳聚糖/F127复合水凝胶的构建、表征及体外促成骨分化与安全性评价

Construction, characterization, in vitro osteogenic differentiation and biosafety evaluation of chitosan/F127 composite hydrogels encapsulating mesoporous polydopamine nanoparticles loaded with EGCG

摘要

背景 骨缺损修复是临床骨科的常见难题，传统修复材料存在生物活性低、药物缓释效果差等缺陷。 目的 构建负载表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)的介孔聚多巴胺(mesoporous polydopamine，MPDA)纳米粒子/壳聚糖/F127复合水凝胶(MPDA@EGCG-CF)，评价其理化特性、生物安全性及体外促成骨分化能力。 方法 制备MPDA@EGCG纳米粒子及MPDA@EGCG-CF、MPDA-CF、CF水凝胶，以普通培养基处理的细胞作为对照(control，Ctrl)组；并通过扫描电子显微镜、纳米粒径电位仪对其粒径、电位、形态学进行观察；将上述纳米粒子与壳聚糖/F127水凝胶相结合制备复合水凝胶(MPDA@EGCG-Chitosan/F127，MPDA@EGCG-CF)，并通过扫描电子显微镜、流变仪、CCK-8试剂盒、细胞活/死染色、溶血实验、碱性磷酸酶染色及定量分析、茜素红染色及定量分析、免疫印迹法对该复合水凝胶的形态学、流变特性、体外释放特性、安全性以及体外促成骨能力进行检测。 结果 成功构建MPDA@EGCG-CF水凝胶。体外释放结果显示，该复合水凝胶可在局部持续释放EGCG长达1周以上。形态学观察结果显示，该水凝胶有着良好的形态学特征，为多孔结构。细胞实验及溶血实验结果显示，该复合材料有着良好的安全性；碱性磷酸酶染色、茜素红染色及免疫印迹试验结果表明，相较于Ctrl组以及包封非载药MPDA水凝胶组，其具备明显的体外促成骨分化能力(P＜0.05)。 结论 具有骨诱导性的包封负载EGCG的MPDA的壳聚糖/F127复合水凝胶可实现EGCG的局部长期释放，在体外可明显促进成骨分化，展现出良好的骨再生应用潜力。

Abstract

Background Bone defect repair is a common challenge in clinical orthopedics, and traditional repair materials are limited by drawbacks such as low biological activity and poor drug controlled-release performance. Objective To construct a composite hydrogel capable of promoting bone defect repair by combining the properties of epigallocatechin gallate (EGCG) and mesoporous polydopamine (MPDA), while leveraging the excellent biocompatibility and mechanical properties of chitosan/F127 hydrogel. Methods Cells treated with regular culture medium were used as the control (Ctrl) group. EGCG-loaded MPDA (MPDA@EGCG) nanoparticles were prepared, and their particle size, Zeta potential, and morphology were characterized using scanning electron microscopy (SEM) and a nanoparticle size and Zeta potential analyzer. Subsequently, the aforementioned nanoparticles were incorporated into chitosan/F127 hydrogel to fabricate the composite hydrogel (MPDA@EGCG-CF). The morphology, rheological properties, in vitro release behavior, biosafety, and in vitro osteogenic capacity of the composite hydrogel were evaluated via SEM, a rheometer, the CCK-8 assay, live/dead cell staining, hemolysis test, alkaline phosphatase staining with quantitative analysis, alizarin red staining with quantitative analysis, and Western blot analysis. Results The MPDA@EGCG-CF hydrogel was successfully constructed. In vitro release studies demonstrated that the composite hydrogel could achieve sustained local release of EGCG for more than one week. Morphological observations via SEM revealed that the hydrogel exhibited favorable morphological characteristics with a porous structure. Cell experiments and hemolysis test confirmed the good biosafety of the composite material. Results from alkaline phosphatase (ALP) staining, alizarin red staining, and Western blot analysis indicated that, compared with the Ctrl group and the hydrogel group encapsulating non-drug-loaded MPDA, the MPDA@EGCG-CF hydrogel displayed significantly enhanced in vitro osteogenic differentiation capacity (P＜0.05). Conclusion The constructed osteoconductive chitosan/F127 composite hydrogel encapsulating EGCG-loaded MPDA can realize long-term local release of EGCG and remarkably promote osteogenic differentiation in vitro, exhibiting promising application potential for bone regeneration.

Graphical abstract

关键词

骨再生 / 表没食子儿茶素没食子酸酯 / MC3T3-E1细胞 / 壳聚糖 / 介孔聚多巴胺

Key words

bone regeneration / epigallocatechin gallate / MC3T3-E1 cells / chitosan / mesoporous polydopamine

由外伤、骨肿瘤或感染引发的骨缺损是临床骨科常见的难治性病症，天然骨组织的自我修复能力有限，需借助外部干预实现缺损修复^[1-2]。目前临床常用的自体骨移植虽为骨再生“金标准”，受限于供体不足、手术创伤大等问题；同种异体骨移植则面临伦理争议与免疫风险；传统骨替代材料又存在骨诱导活性弱、易引发炎症反应等缺陷，难以满足临床需求^[3-5]。骨组织工程技术的兴起为解决这一难题提供了新思路，其中水凝胶因具备良好的生物相容性、可塑形性及药物载体特性，成为骨缺损修复领域的研究热点^[6-7]。单一天然或合成水凝胶存在机械性能差、生物相容性不足等局限，通过复合改性可有效优化其性能^[8-9]。绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)虽具有促成骨、抗炎的潜在活性，却因体内降解快、生物利用度低的缺陷难以直接应用^[10-11]。介孔聚多巴胺(mesoporous polydopamine，MPDA)纳米粒子凭借优异的载药与控释能力，可有效改善EGCG的递送效率^[12-13]。基于此，本研究以材料复合与纳米载药协同增效为核心策略，构建负载EGCG的MPDA纳米粒子/壳聚糖-F127复合水凝胶，系统探究其体外促成骨效能，旨在优化骨修复材料性能，为骨缺损修复提供兼具良好生物相容性与高效促成骨活性的新型材料方案。

1 材料和方法

1.1 实验材料

Pluronic F127(麦克林，P822479)，1，3，5-三甲基苯(1，3，5-trimethylbenzene，TMB)(阿拉丁，T100416)，盐酸多巴胺(麦克林，D806618)，EGCG(麦克林，E808891)，氢氧化铵溶液(麦克林，A834475)，甲基丙烯酰化壳聚糖(methyl acryloyl chitosan，CSMA)(EFL，EFL-S-CSMA-100K)，聚醚F127二丙烯酸酯(polyether F127 dimethacrylate，F127DA)(EFL，EFL-F127DA-001)，MC3T3-E1细胞(赛维尔)，α-MEM培养基(赛维尔，G4554)，胎牛血清(赛维尔，G8003)，青链霉素混合液(赛维尔，G4003)，CCK-8试剂盒(Biosharp，BS350E)，细胞活/死染色试剂盒(碧云天，C2015S)，成骨诱导分化试剂盒(赛维尔，G4119)，碱性磷酸酶染色试剂盒(赛维尔，G1087)，茜素红染色试剂盒(赛维尔，G1038)，兔抗I型胶原蛋白α1链(collagen type I alpha 1 Chain，COL1A1)(CST，72026T)，兔抗Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)(CST，72026T)，兔抗碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(CST，72026T)，兔抗骨钙素(osteocalcin，OCN)(CST，72026T)，兔抗β-肌动蛋白(beta-actin，β-actin)(赛维尔，GB15003)。

1.2 纳米粒子的制备与表征

按照文献中的方法制备纳米粒子^[14]。将1 g Pluronic F127和1g TMB加入100 mL的混合溶剂(水/乙醇，1∶1，v/v)。磁力搅拌30 min，加3.75 mL氢氧化铵溶液和1.5 g盐酸多巴胺，室温下继续反应2 h。将悬浮液在13 000 r/min离心10 min，收集沉淀物并用水/乙醇(1∶1，v/v)洗涤两次。将沉淀物真空干燥24 h，得到黑色MPDA纳米粒子。50 mg EGCG溶于100 mL水，加入100 mg MPDA纳米粒子。将混合物在室温下搅拌过夜，13 000 r/min离心10 min，收集沉淀，真空下干燥得到MPDA@EGCG纳米粒子。使用紫外-可见分光光度计(UV-1900i，Shimadzu)按标准曲线测量上清液中EGCG的浓度，计算载药量。使用扫描电子显微镜检测MPDA和MPDA@EGCG的形貌，使用纳米粒径电位仪(Zetasizer Lab，Malvern Panalytical)检测MPDA和MPDA@EGCG的粒径和Zeta电位。通过傅里叶变换红外光谱仪(Cary 630，Agilent)验证MPDA@EGCG中的EGCG负载。

1.3 水凝胶的制备与表征

取400 μL 10% (w/v) F127DA溶液(含0.25% (w/v)光引发剂)与600 μL 2% (w/v)CSMA(含0.25%(w/v)光引发剂)溶液，加入MPDA或MPDA@ EGCG，混合均匀，用405 nm光源照射30 s，得到MPDA-CSMA/F127DA(MPDA-CF)水凝胶或MPDA@EGCG-CSMA/F127DA(MPDA@EGCG-CF)水凝胶，不加纳米粒子，直接照射得到CSMA/F127DA(CF)水凝胶。使用扫描电子显微镜观察冻干水凝胶的微观结构。使用HAAKE Rehostress RS6000流变仪测试不同水凝胶的流变特性。将400 μL CF、MPDA-CF和MPDA@EGCG-CF水凝胶分别施加到流变仪上，并将上板降低至1 mm的间隙尺寸，以测试储能模量(G’)和损耗模量(G’’)(0 ~ 3 min，1 Hz)。为了研究水凝胶的体外的缓释作用，在离心管中制备了1 mL MPDA@EGCG-CF水凝胶。加10 mL PBS溶液，在37℃下以100 r/min振荡孵育。在固定时间点，从每个试管中取出100 μL溶液并加入100 μL新鲜PBS，将样品以14 800 g离心10 min，通过酶标仪测定276 nm处的吸光度计算EGCG浓度。每组样本有3次重复。

1.4 细胞培养与水凝胶提取物的制备

MC3T3-E1细胞培养在25 cm²细胞培养瓶。将细胞在补充有10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的α-MEM中培养，置于37℃和5% CO₂条件的细胞培养箱中。培养基每2 d更换一次。当生长密度达到80%时，进行细胞传代。将1 000 mg通过紫外线照射灭菌2 h的水凝胶浸没在10 mL α-MEM或成骨培养基中，37℃浸没24 h，用0.22 μm无菌过滤器过滤水凝胶的提取物。

1.5 CCK-8法检测细胞活力

通过CCK-8法检测MC3T3-E1细胞的活力和增殖情况。在MC3T3-E1细胞培养基中加入CF水凝胶提取液和不同浓度(1、2、3、4 mg/mL)的MPDA@EGCG/CF水凝胶提取液。培养24 h后取出培养基，用10% CCK-8溶液代替。在培养4 h后，用酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices，USA)测定上清液在450 nm处的吸光度。以培养基处理的细胞作为对照(control，Ctrl)组，计算相对细胞活力。使用3 mg/mL的MPDA@EGCG/CF、MPDA/CF以及CF水凝胶提取液培养细胞7 d(分别为CF、MPDA-CF与MPDA@EGCG-CF组)，并以培养基处理的细胞作为对照(Ctrl组)，分别在1、3、7 d时通过CCK-8法检测细胞活力。

1.6 活/死染色法检测细胞存活状态

对上述使用三种水凝胶提取液孵育7 d的MC3T3-E1细胞进行活/死染色。取出细胞培养板，用PBS轻轻洗涤细胞，用含有钙黄绿素和碘化丙啶的染色液在室温下染色15 min，在荧光显微镜(Olympus)下拍摄。

1.7 溶血实验检测水凝胶血液相容性

将3种水凝胶样品分别加入氯化钠注射液试管中。将PBS(阴性对照)和Triton溶液(阳性对照)分别加入试管中作为对照组。将3组试管置于恒温水浴(37°C)中保存30 min，将稀释的兔血加入每个试管中，并轻轻混合。将3组试管在37°C下孵育60 min，以800 g离心5 min。通过分光光度法在545 nm的波长处测量上清液的吸光度，制备3根试管进行测量，计算溶血率。

1.8 碱性磷酸酶染色及定量法检测成骨早期活性

将MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，细胞密度为7×10³/孔，1天后更换原培养基，分别加入成骨诱导培养基(Ctrl组)及水凝胶成骨诱导浸提液(CF、MPDA-CF与MPDA@EGCG-CF组)，诱导培养14 d后，将细胞与碱性磷酸酶染色工作液在室温下避光孵育30 min，吸去洗净液体后置于体视显微镜下观察并拍照。

1.9 茜素红染色及定量法检测矿化能力

细胞接种与分组培养同碱性磷酸酶染色。成骨诱导14 d后，室温下每孔加入100 μL茜素红染液室温孵育60 min，置于体视显微镜下观察并拍照。

1.10 免疫印迹法检测成骨相关蛋白表达

通过免疫印迹法(Western blot)检测成骨相关蛋白的表达水平。细胞培养步骤同前所述，对MC3T3-E1细胞成骨诱导培养14 d后，在冰上提取MC3T3-E1细胞的蛋白质。将蛋白质加载到10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，并转移到PVDF膜上。室温下用脱脂奶粉(5%，v/w)在TBST中封闭2 h，使用相应抗体孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将PVDF膜和二抗在室温下孵育4 h，采用ECL发光法显影。使用Image J软件(NIH，USA)检测和分析膜上蛋白质条带的灰度值。

1.11 统计学分析

采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析。计量数据采用Shapiro-Wilk检验评估正态性，Levene检验评估方差齐性，符合正态分布且方差齐者多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米粒子的微观形态与粒径

MPDA纳米粒子与MPDA@EGCG纳米粒子均呈现球形结构见图1A。图1B为MPDA纳米粒子与MPDA@EGCG纳米粒子的粒径分布情况，MPDA纳米粒子的平均粒径为179.5 nm，由于EGCG的加载，MPDA@EGCG纳米粒子的平均粒径增大到193.2 nm，并且两种纳米粒子的粒径分布均匀。

2.2 纳米粒子的Zeta电位与红外光谱

两种纳米粒子的Zeta电位见图2A，MPDA纳米粒子的Zeta电位为-20.77±1.23 mV，由于EGCG的负载，MPDA@EGCG纳米粒子的Zeta电位缩小至-24.34±1.01 mV。并对两种纳米粒子进行了傅里叶红外光谱检测，结果见图2B，MPDA@EGCG在1 036 cm^-1处吸收带的改变可归因于EGCG分子中的O-H弯曲，1 350 cm^-1处的吸收峰变化是由于C=O拉伸，1 604 cm^-1左右吸收峰的变化则是由于C-C的芳香弯曲，除此之外，3 355 cm^-1处新出现的吸收峰则是由于EGCG的加入所带来大量羟基的O-H拉伸。以上吸收峰的出现表明MPDA@EGCG中EGCG的成功加载。通过对上清液中未包封EGCG浓度的测定，计算所制备MPDA@EGCG纳米粒子的平均载药量为21.65%。

2.3 水凝胶的大体形态与微观形态

水凝胶在405 nm光源照射后可在30 s内迅速地由液态转为凝胶态见图3A。水凝胶的微观结构见图3B，CF、MPDA-CF与MPDA@EGCG-CF水凝胶均呈现多孔结构，这有利于营养物质的运输与细胞的生长，并且MPDA纳米粒子和MPDA@EGCG纳米粒子在MPDA-CF、MPDA@EGCG-CF水凝胶中均匀分布。

2.4 水凝胶的流变学检测结果

3种水凝胶的流变学检测结果见图4A，3种水凝胶的储能模量G’均大于损耗模量G’’，表明水凝胶的成功形成，并且纳米粒子的加入没有影响水凝胶的形成。对MPDA@EGCG-CF水凝胶进行了体外缓释检测，结果见图4B，该复合水凝胶初期释放速度快，第1天的释放量可达(22.25 ± 2.89)%，之后逐渐降低，第7天时的累计释放量为(75.04 ± 3.74)%，可以实现注射初期迅速释放并在之后逐渐缓释的效果。

2.5 水凝胶的安全性检测

检测MPDA@EGCG-CF水凝胶的使用浓度见图5A。在培养24 h后，可见含1 mg/mL、2 mg/mL及3 mg/mL MPDA@EGCG的MPDA@EGCG-CF水凝胶组细胞活力未受显著影响，而4 mg/mL MPDA@EGCG-CF水凝胶组细胞活力相比3 mg/mL下降(P＜0.05)，故选择3 mg/mL的浓度作为后续使用。使用浓度为3 mg/mL的MPDA@EGCG-CF和MPDA-CF水凝胶及CF水凝胶对MC3T3-E1细胞进行7 d培养，并对细胞活力进行检测，细胞在1、3、7 d时的活力均良好(图5B)。培养7 d后的细胞活/死染色，各组均只出现了极少的红色荧光，表明仅有极少数细胞死亡，再次表明各组细胞存活良好。之后对水凝胶进行了溶血测试，CF、MPDA-CF及MPDA@EGCG-CF水凝胶的溶血率均低于5%，表明水凝胶具备良好的血液相容性，见图5C。以上结果表明，水凝胶的安全性良好。

2.6 水凝胶的体外成骨诱导作用检测

2.6.1 碱性磷酸酶染色及茜素红染色

碱性磷酸酶染色结果见图6A，MPDA@EGCG-CF和MPDA-CF组碱性磷酸酶染色深度显著强于Ctrl组，并且以MPDA@EGCG-CF组染色深度最强；定量分析结果见图6B，MPDA@EGCG-CF水凝胶组和MPDA-CF水凝胶组的碱性磷酸酶活性高于Ctrl组(P＜0.05)，MPDA@EGCG-CF水凝胶组碱性磷酸酶活性高于MPDA-CF水凝胶组(P＜0.05)。茜素红染色结果见图6A，CF水凝胶组、MPDA-CF水凝胶组和MPDA@EGCG-CF水凝胶组矿化结节形成依次增加；定量分析结果见图6B，MPDA@EGCG-CF水凝胶组和MPDA-CF水凝胶组矿化结节面积高于Ctrl组(P＜0.05)，MPDA@EGCG-CF水凝胶组矿化结节面积高于MPDA-CF水凝胶组(P＜0.05)，表明MPDA@EGCG-CF水凝胶能够促进细胞外的钙沉积。

2.6.2 Western blot检测结果

与Ctrl组比较，MPDA-CF水凝胶组和MPDA@EGCG-CF水凝胶组COL1A1、RUNX2、ALP和OCN的蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)；与MPDA-CF水凝胶组比较，MPDA@EGCG-CF水凝胶组COL1A1、RUNX2、ALP和OCN蛋白表达水平升高(P＜0.05)。该结果进一步表明了MPDA@EGCG-CF水凝胶对成骨细胞的成骨分化起促进作用。见图7、表1。

3 讨论

随着我国人口老龄化加剧及外伤、骨肿瘤等因素影响，骨缺损已成为制约民众健康的常见骨科难题，开发高效骨再生方案迫在眉睫。骨组织工程技术为突破传统骨修复材料的局限提供了新思路，其中水凝胶因具备良好的生物相容性、可塑形性，且能模拟天然细胞外基质微环境、承载活性成分实现局部缓释，已成为骨缺损修复领域的核心载体材料之一^[15-16]。但单一天然或合成水凝胶存在固有缺陷，即天然壳聚糖水凝胶生物相容性优异却机械性能薄弱，合成F127水凝胶机械可控性强却生物相容性不足^[17-18]。本研究通过壳聚糖与F127构建复合水凝胶基质，有效弥补单一水凝胶的性能短板，为后续承载药物、适配骨缺损微环境奠定基础。

EGCG作为茶叶中的核心活性成分，因兼具促进成骨细胞增殖分化、抑制炎症反应及抗氧化等多重作用，被认为是极具潜力的骨再生调控因子，相关研究已证实其可通过激活成骨相关信号通路(如BMP/Smad、Wnt/β-catenin)提升骨形成效率^[19-21]。值得注意的是，最新研究进一步证实，EGCG还可通过上调Sirt1表达抑制NF-κB介导的慢性炎症来改善骨愈合微环境，并通过调控线粒体自噬增强间充质干细胞向成骨谱系的定向分化，拓展了其在骨修复中的应用前景^[22-23]。但其体内降解快、生物利用度低的问题，导致其在骨缺损局部难以维持有效药物浓度，严重限制了实际应用^[24-25]。为突破这一瓶颈，本研究创新性构建“MPDA@EGCG 纳米粒子-壳聚糖/F127复合水凝胶”体系，通过MPDA优化EGCG的负载与控释，借助复合水凝胶实现药物的局部靶向递送，最终构建起载体改性提升载药效率、药物增效强化成骨活性、材料适配优化修复微环境的协同作用体系。

本研究结果证实，成功制备的MPDA@EGCG-CF复合水凝胶具有良好的物理化学特性与生物安全性：扫描电镜、粒径电位等表征验证了MPDA@EGCG纳米粒子的稳定制备及在水凝胶中的均匀分散；3 mg/mL浓度的复合水凝胶对MC3T3-E1细胞无明显毒性，保障了其体内应用的安全性；体外缓释实验显示，该体系既实现初期药物快速释放以快速调控骨修复微环境，又能实现药物的长期缓释，契合骨缺损修复“长期治疗”的需求。更重要的是，本研究通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及免疫印迹实验，证实MPDA@EGCG-CF水凝胶可显著上调 MC3T3-E1细胞中COL1A1、RUNX2、ALP、OCN等成骨相关蛋白的表达。其中，COL1A1、ALP与OCN是成骨细胞的3种典型标志物，三者不仅参与调控成骨细胞的功能，还在成骨及骨重塑过程中，参与细胞外基质的矿化调控过程^[26-27]。既往研究证实，成骨细胞中COL1A1、ALP与OCN表达的上调与成骨细胞的分化及成熟过程直接相关，并且RUNX2可通过调控COL1A1、OCN和ALP的基因表达，促进成骨细胞的成骨过程^[28-30]。

本研究的核心价值在于提出“纳米载药-复合水凝胶”协同作用的骨修复材料设计思路：选用MPDA作为药物载体负载EGCG，有效改善EGCG稳定性差、生物利用度低的固有缺陷；同时依托兼具高骨亲和性与机械强度的壳聚糖/F127复合水凝胶，实现药物的局部靶向递送。二者结合不仅成功达成骨缺损部位药物的稳定缓释，更借助协同作用放大了EGCG的生物学活性。相较于单一EGCG，该复合水凝胶对MC3T3-E1细胞展现出更强的促增殖与促成骨分化效能。综合上述实验结果，MPDA@EGCG-CF复合水凝胶可在实现负载药物长效缓释的同时，显著增强成骨细胞的成骨分化能力，为骨缺损修复提供了性能优异的新型材料方案。

本研究证实，纳米粒子负载EGCG结合壳聚糖/F127水凝胶的靶向递药策略具有显著优势，可有效提升EGCG的生物利用度与稳定性，为其在骨缺损修复领域的应用拓宽了前景。本研究仍存在一定局限性，目前尚未深入探究该复合水凝胶的溶胀性能、体外降解特性，且其体内骨修复效能与潜在作用机制仍需进一步验证。尽管如此，这一基于复合水凝胶的EGCG骨靶向递送体系，在骨缺损修复的临床转化中仍展现出良好潜力。

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基金资助

国家重点研发计划(2024YFA1108605)