双膦酸盐相关性颌骨坏死大鼠模型的建立及双膦酸盐对种植体周骨愈合影响的初步研究

Establishment of a rat model of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw and a preliminary investigation on the effect of bisphosphonates on peri-implant bone healing

摘要

背景 双膦酸盐引发的双膦酸盐相关性颌骨坏死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw，BRONJ)是临床上无法忽视的严重不良反应，既往建立的BRONJ动物模型在给药途径和剂量上未能准确地模拟临床实际用药环境。 目的 模拟临床用药环境建立BRONJ大鼠模型，并探究双膦酸盐对种植体植入后骨结合和骨愈合的影响。 方法 将40只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组，模型组通过模拟临床恶性肿瘤患者的等效用药剂量，尾静脉注射唑来膦酸钠联合地塞米松，对照组给予等量生理盐水，给药4周后拔除双侧上颌第一磨牙诱导BRONJ。拔牙4周后随机选取各组大鼠拔牙窝样本进行建模评估，剩余大鼠同期进行种植体植入，于种植4周后取材评估。通过Micro-CT检测拔牙窝及种植体周骨密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁数量(trabeculae number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabeculae thickness，Tb.Th)以及骨小梁分离度(trabeculae separation，Tb.Sp)等骨愈合指标；通过HE/Masson染色检测拔牙窝及种植体周骨细胞、炎症细胞、结缔组织和胶原纤维的增生和分布；通过免疫组织化学染色检测种植体周骨组织相关蛋白碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、I型胶原蛋白(type I collagen，COL-1)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和Runt相关转录因子2(recombinant runt related transcription factor 2，Runx2)表达。 结果 大体观察和Micro-CT检查发现，模型组拔牙窝及种植体周出现创口不愈、坏死骨暴露、骨愈合指标(BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th)下降(P＜0.01)，对照组拔牙窝及种植体周骨愈合良好；HE/Masson染色结果显示模型组拔牙窝及种植体周可见骨组织坏死、炎症细胞浸润，骨细胞胞核溶解，结构不清。对照组愈合良好，可见较多结缔组织及胶原纤维增生；免疫组织化学结果显示模型组成骨相关基因(ALP、COL-1、BMP-2、OPN)表达下调(P＜0.05)。 结论 建立了模拟临床用药环境的BRONJ大鼠模型，并初步验证了双膦酸盐对种植体周骨结合与骨愈合可能存在的抑制作用。

Abstract

Background Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw(BRONJ) caused by bisphosphonates is a serious adverse reaction that cannot be ignored in clinical practice. The previously established BRONJ animal models have not accurately simulated the actual clinical drug administration environment in terms of administration route and dosage. Objective To establish a BRONJ rat model that simulates the clinical drug administration environment and to explore the effect of bisphosphonates on osseointegration and bone healing after implant placement. Methods Forty male SD rats were randomly divided into a control group and a model group. The model group was treated with zoledronic acid sodium combined with dexamethasone via tail vein injection to simulate the equivalent drug dosage used in clinical malignant tumor patients. The control group was given the same volume of normal saline. After 4 weeks of administration, the first maxillary molars on both sides were extracted to induce BRONJ. Four weeks after tooth extraction, samples from the extraction sockets of each group were randomly taken for modeling and evaluation. The remaining rats underwent implant placement at the same time, and samples were collected 4 weeks after implantation for evaluation. Micro-CT was used to detect the osseointegration and bone healing indicators (BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Sp, Tb.Th) of the extraction sockets and peri-implant bone. HE/Masson staining was used to detect the proliferation and distribution of bone cells, inflammatory cells, connective tissue, and collagen fibers in the extraction sockets and peri-implant bone. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of peri-implant bone tissue-related proteins (ALP, COL-1, BMP-2, OPN, OCN, Runx2). Results Gross observation and Micro-CT examination revealed that the extraction sockets and peri-implant bone in the model group showed non-healing wounds, exposed necrotic bone, and decreased bone healing indicators (BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th), while the control group showed good bone healing (P＜0.0001). HE/Masson staining showed that the extraction sockets and peri-implant bone in the model group had bone tissue necrosis, inflammatory cell infiltration, and dissolved bone cell nuclei with unclear structure. The control group showed good healing with abundant connective tissue and collagen fiber proliferation. Immunohistochemical staining showed that the expression of osteogenesis-related genes (ALP, COL-1, BMP-2, OPN) in the model group was downregulated (P＜0.05). Conclusion This study established a BRONJ rat model that simulates the clinical drug administration environment and preliminarily verified the possible inhibitory effect of bisphosphonates on osseointegration and bone healing around implants.

双膦酸盐类药物在临床上广泛应用于骨质疏松、高钙血症以及骨髓瘤等疾病的治疗，但其引发的颌骨坏死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw，BRONJ)已经成为了一个无法忽视的严重不良反应^[1]。目前，BRONJ的发病机制尚未完全阐明^[2]，骨重塑抑制假说被认为是该疾病发展的主导因素，静脉注射双膦酸盐治疗和牙槽外科手术是该疾病的显著危险因素^[3]。临床上针对于该疾病多采用对症治疗，且治疗效果不佳，严重影响了患者的身心健康和生活质量^[4]。因此，建立能够模拟临床的动物模型对于疾病机制和防治的研究至关重要。

动物模型是研究疾病发病机制和治疗手段的不可或缺的体内实验平台，然而，当前尚未形成统一的BRONJ动物模型的建模方法和标准。啮齿动物因其成本较低、易于操作和饲养，成为了建立BRONJ动物模型的首选，有学者系统总结了历年来众多BRONJ啮齿动物模型的建立方法，其中十分常用的是全身给药联合危险因素诱导(拔牙)^[5]。然而在这些方法中，药物的种类和剂量、给药时间和途径以及拔牙时间和部位的选择均存在着较大的差异。更多的学者采用腹腔给药的方式代替临床静脉给药以提高给药精确度^[6-11]；还有学者采用远超临床用药剂量的唑来膦酸(约0.2 mg/kg)以期增加模型的骨坏死率^[12-15]。然而，这些建模方法并不能准确地模拟临床用药环境。临床上，多发性骨髓瘤及骨转移癌等恶性肿瘤患者为BRONJ的高危人群，其长期接受静脉注射唑来膦酸联合地塞米松等糖皮质激素药物治疗，颌骨坏死风险显著增高^[4]。因此，本研究模拟临床恶性肿瘤患者的用药环境，通过静脉注射给药结合临床用药剂量以及激素联合用药，建立BRONJ的大鼠模型。此外，许多临床病例已经报道了双膦酸盐对种植体骨结合失败以及颌骨坏死的风险^[3,16-18]。有学者报道接受静脉注射双膦酸盐治疗的患者种植牙失败率超过15%^[19]。因此本研究在建立BRONJ模型的基础上进一步分析双膦酸盐对种植体植入后骨结合和骨愈合的影响，旨在为双膦酸盐与种植体研究领域提供一定的实验参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究涉及的所有动物实验均经中国科学院理化技术研究所动物实验伦理委员会批准(批准文号：IACUC-IPC-2502-003)。选用40只8 ~ 12周龄、体质量约250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF级)，购于北京斯贝福生物技术有限公司，所有大鼠以5只/笼的密度饲养于独立通风供气笼具中，可自由饮食，在实验前均常规适应性喂养1周。

1.2 主要试剂与仪器

Ti合金微种植体(Ti-6Al-4V，长度3.5 mm，直径2 mm，浙江广慈医疗器械有限公司，中国)，唑来膦酸钠、地塞米松(北京阳光英锐生物科技有限公司，中国)，氯胺酮、异氟烷、生理盐水、4%多聚甲醛、乙二胺四乙酸二钠EDTA(Gibco公司，美国)，HE染色试剂盒、马松三色染色试剂盒(Solarbio公司，中国)，大鼠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗体、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)抗体、骨钙素(osteocalcin，OCN)抗体、I型胶原蛋白(type I collagen，COL-1)抗体、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)抗体、Runt相关转录因子2(recombinant runt related transcription factor 2，Runx2)抗体、GAPDH抗体(Proteintech，美国)，Micro CT机(平生医疗科技有限公司VNC-102，中国)，倒置显微镜(Olympus BX53，日本)。

1.3 BRONJ大鼠模型的建立

40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组及模型组，每组20只。称取药物溶解于无菌生理盐水并按照给药比例进行稀释。模型组基于临床恶性肿瘤患者用药剂量的等效换算[4 mg/(kg·月)]，通过尾静脉注射给药的方式给予唑来膦酸钠(0.066 mg/kg，3次/周)和地塞米松(5 mg/kg，每周1次)；对照组则尾静脉注射等量的生理盐水。给药4周后，在氯胺酮(90 mg/kg)、异氟烷的麻醉与镇静作用下拔除双侧上颌第一磨牙(图1)，拔牙后持续给药。拔牙后第4周，对照组及模型组随机各取5只大鼠进行上颌骨拔牙窝取材分析，剩余大鼠则同期进行种植体植入。

1.4 BRONJ大鼠种植体植入

根据大鼠上颌骨尺寸，定制了长度3.5 mm、直径2 mm的Ti-6Al-4V钛合金微种植体。种植手术时，使用直径2 mm的机头穿透颌骨骨髓腔，同时在术区喷洒生理盐水进行局部降温，减少对骨组织的损伤，最后将Ti合金微种植体旋入孔内。种植后停止给药。种植后第4周，所有大鼠进行上颌骨种植区取材分析。

1.5 BRONJ大鼠模型建立评价

1.5.1 Micro-CT分析拔牙窝骨愈合及指标

拔牙4周后，对照组及模型组随机各取5只大鼠进行上颌骨取材分析，评估拔牙窝骨愈合情况。用过量麻醉药物对大鼠实施安乐死，并在无菌条件下上颌骨组织取材，使用Micro CT断层扫描仪评估拔牙窝骨愈合情况。Micro CT设置的扫描参数为90 kV，0.08 mA，曝光时间为300 ms，以拔牙窝为视野中心，轴向扫描范围9.5 mm。将拔牙窝内新生骨区域选定为感兴趣区域(region of interest，ROI)，利用数据分析软件Image J对各组上颌骨拔牙窝样本的骨密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁数量(trabeculae number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabeculae thickness，Tb.Th)以及骨小梁分离度(trabeculae separation，Tb.Sp)等骨愈合指标进行量化分析。

1.5.2 组织病理学分析拔牙窝骨组织微观结构

取各组拔牙窝骨组织进行组织病理学检查。将大鼠上颌骨用4%多聚甲醛固定48 h，乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium，EDTA)脱钙21 d后，石蜡包埋切片，用HE染色试剂盒以及Masson三色染色试剂盒对5 μm厚的切片进行染色。倒置显微镜对拔牙窝中心的矢状面进行观察和成像。

1.6 BRONJ大鼠种植体植入评价

1.6.1 Micro-CT分析种植体周骨结合及骨愈合指标

种植体植入4周后，对建模评估后剩余的所有大鼠进行上颌骨取材分析，评估种植体与周围骨组织的骨结合和骨愈合情况。用过量麻醉药物对大鼠实施安乐死，并在无菌条件下收集上颌骨组织，使用Micro CT断层扫描仪评估种植体与周围骨组织的骨结合和骨愈合情况。Micro CT设置的扫描参数及条件设定同上，以种植体周为视野中心，轴向扫描范围9.5 mm。将种植体周0.5 mm内的骨区域选定为ROI，利用数据分析软件Image J对各组上颌骨种植体周的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等骨愈合指标进行量化分析。

1.6.2 组织病理学分析种植体周骨组织微观结构

将种植体采用轻度机械拔除的方式从骨组织中小心取出，以便进行脱钙、包埋及切片处理。将样品用4%多聚甲醛固定48 h，并用EDTA脱钙21 d。经过石蜡包埋和切片后，用HE染色试剂盒以及马松三色染色试剂盒对5 μm厚的切片进行染色。使用倒置显微镜对种植体中心的矢状面进行观察和成像。

1.6.3 免疫组织化学分析成骨分化相关蛋白的表达

将样品通过石蜡包埋切片后进行脱蜡、水化，并在微波炉中加热进行抗原修复处理，随后用大鼠COL-1抗体、大鼠Runx2抗体、大鼠OPN抗体、大鼠BMP-2抗体、大鼠OCN抗体、大鼠ALP抗体进行免疫组织化学染色，以检测植体周0.5 mm内的骨区域的成骨相关蛋白的分化情况。使用倒置显微镜对切片进行观察和成像，并利用数据分析软件Image J评估各组相应成骨蛋白分化的阳性染色面积。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 10软件对本实验获取的全部数据进行统计学分析，所有定量结果均以(\overline{x} ± s)的形式表示，每组实验均至少重复3次(n≥3)。两组数据之间的比较采用非配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRONJ大鼠模型的评估

拔牙后第4周，即给药后第8周，对照组及模型组大鼠进行上颌骨拔牙区大体观察，模型组大鼠出现拔牙创口不愈合、骨坏死暴露情况，对照组大鼠拔牙创愈合良好。见图1。

上颌骨拔牙4周后Micro-CT观察，对照组拔牙窝愈合良好，创口愈合无红肿；实验组拔牙窝呈凹坑状敞开，底部及侧壁死骨形成，骨愈合较差。利用数据分析软件Image J对各组上颌骨拔牙窝样本的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度以及骨小梁分离度进行分析，结果显示，对照组骨愈合指标均优于模型组。见图2。

HE染色结果显示：对照组牙槽骨组织可见骨髓腔数量较丰富，形状不规则，分布均匀，骨细胞胞核结构清晰，嵌于骨陷窝内；偶见细微残留牙根，牙根与牙槽骨之间的牙周膜为致密结缔组织，成纤维细胞及胶原纤维数量丰富，排列紧密、不规则，未见明显的炎性细胞浸润等异常；模型组牙槽骨组织可见小范围骨细胞坏死，骨细胞胞核溶解，结构不清，坏死牙槽骨内形成不规则的空腔，空腔内可见大量坏死细胞碎片及无结构的嗜酸性物质，少量粒细胞及巨噬细胞散在浸润，伴极少量多核巨细胞浸润；牙槽骨表面可见少量上皮细胞增生。见图3。

Masson三色染色结果显示：主要由I型胶原组成的类骨质被染成蓝色，而暗红色则代表矿化骨。对照组拔牙窝新生骨组织较多，呈现骨小梁结构。而模型组拔牙窝的骨形成相对较弱。见图3。结果表明，对照组拔牙窝骨愈合优于模型组。

综上，BRONJ大鼠模型建立成功。

2.2 BRONJ大鼠模型的种植评估

种植后第4周，所有大鼠进行上颌骨种植区取材分析。在大体观察下，模型组大鼠出现种植体周黏膜组织愈合不良、骨组织暴露等情况，而对照组大鼠恢复良好。见图4。

Micro-CT观察显示，对照组种植体周骨组织愈合良好，骨小梁厚度均匀、适中，新生骨矿化程度较高。模型组种植体周空虚，周围骨小梁结构稀疏、断裂、连接性差，新生骨量少且矿化程度低，骨愈合较差。利用数据分析软件Image J对各组种植体周的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp进行分析，结果显示，对照组种植体周骨愈合优于模型组。见图5。

HE染色结果显示：对照组种植体周骨组织中可见多量纤维结缔组织增生以及少量新生血管，伴有少量粒细胞与淋巴细胞浸润，周围可见少量骨组织坏死。其余部分骨髓腔数量较丰富，形状不规则，分布均匀，骨细胞胞核结构清晰，嵌于骨陷窝内；模型组种植体周可见少量纤维结缔组织增生以及少量新生血管，周围可见较多坏死的骨组织碎片，胞核溶解，结构不清。坏死骨内伴有较多粒细胞与淋巴细胞浸润；周围可见少量坏死的细胞碎片，偶见多核巨细胞及巨噬细胞散在浸润。见图6。

Masson三色染色结果显示：主要由I型胶原组成的类骨质被染成蓝色，而暗红色则代表矿化骨。对照组种植体周新生骨组织较多，呈现骨小梁结构。而模型组种植体周的骨形成较差。见图6。结果表明，对照组的种植体周骨愈合优于模型组。

免疫组织化学分析结果显示：与模型组相比，对照组多数成骨相关蛋白的阳性表达面积有所增大，以ALP、COL-1、BMP-2以及OPN较为明显，而OCN阳性染色面积无明显差异。利用数据分析软件Image J对各组种植体周各成骨相关蛋白的阳性表达面积进行量化分析，结果显示，对照组除OCN外，其余蛋白阳性表达面积均优于模型组。

总体而言，BRONJ大鼠模型对种植体植入后的骨结合和骨愈合有抑制作用。见图7。

3 讨论

双膦酸盐在临床上广泛应用于骨质疏松症、高钙血症和骨髓瘤等骨代谢性疾病，其作用机制是通过抑制破骨细胞的活性并诱导其凋亡，从而达到抑制骨吸收的效果^[20]。然而随着药物使用的增加，不良反应也随之出现。BRONJ是一种罕见而严重的不良反应，自2003年首次报道以来^[21]，此类病例的数量仍在不断增加。临床表现为接受双膦酸盐治疗的患者出现骨坏死暴露及创口不愈，严重者可导致感染及皮肤瘘道。影像学可观察到骨质破坏和坏死骨分离^[22]。上下颌骨，特别是牙周和牙槽骨表面，具有较高的骨重塑率，口腔外科手术或牙周疾病可以增加局部骨重塑，而双膦酸盐几乎全部积聚在骨重塑活跃的部位^[23]。种植体植入后的3个月内，骨结合形成阶段，由于手术中钻头导致的骨损伤以及植入时对骨的压力，骨组织会出现部分吸收。在此期间，骨吸收与骨形成同步进行，种植体周围的骨组织经历了高效的骨重塑^[24]。双膦酸盐通过抑制破骨细胞介导的骨吸收，可能会干扰骨重塑。通过动物实验发现，双膦酸盐显著抑制了包括大鼠、小鼠和母羊等动物的种植体骨结合^[25-28]；然而也有学者将双膦酸盐应用于种植体表面涂层，增强了种植体的骨结合和骨修复，避免了全身不良反应^[29]。这两种用药方法的区别在于后者通过局部给药可以极大程度上降低药物剂量和全身血药浓度。因此，药物浓度的选择对于全身不良反应的控制有着重要意义。当前，尚未形成统一的BRONJ动物模型的建模方法和标准，许多学者通过远超临床用药剂量诱导颌骨坏死的方法并不能准确地模拟临床用药环境。本研究通过模拟临床恶性肿瘤患者的用药环境，成功建立了BRONJ大鼠模型，并进一步探讨了双膦酸盐对种植体周骨结合与骨愈合的影响。

人类使用的相当于恶性肿瘤水平的唑来膦酸钠静注剂量为4 mg/(kg·月)，有学者指出，啮齿动物具有更快的骨骼代谢速率与血药浓度峰值^[30]，根据体表面积换算法Mosteller公式[HED(mg/kg)=动物剂量(mg/kg)×(动物Km/人类Km)，HED人体等效剂量，人类Km≈36，大鼠Km≈6]计算得出：基于临床恶性肿瘤患者用药剂量的等效换算后，大鼠恶性肿瘤水平的唑来膦酸钠静注剂量约为单次0.066 mg/kg^[5]。考虑到大鼠20 d相当于人类一年的寿命，本研究选择每周给大鼠注射3次以模拟人类每月注射一次的情况。此外，临床上多发性骨髓瘤以及其他恶性肿瘤患者需要长期接受大剂量糖皮质激素(如地塞米松)的治疗，且绝大多数BRONJ患者在用药后存在口腔外科(如拔牙、种植牙)治疗史。临床研究表明，接受静脉注射双膦酸盐(尤其是唑来膦酸钠)联合糖皮质激素治疗的恶性肿瘤患者，其BRONJ的发生率显著增高^[4,22]。地塞米松可通过抑制骨髓基质干细胞向成骨细胞分化、促进骨细胞凋亡、抑制血管生成等多重途径，与双膦酸盐产生协同作用，加剧颌骨坏死的风险^[5]。因此，本研究采用唑来膦酸钠联合地塞米松治疗的用药方案，以更真实地模拟临床高危患者的用药环境，提高模型的稳定性与可重复性。本研究选择通过尾静脉注射唑来膦酸钠(0.066 mg/kg，3次/周)配合地塞米松(5 mg/kg，1次/周)，并在用药后拔除双侧上颌第一磨牙的方法建立BRONJ大鼠模型。既往学者的研究表明，颌骨手术后4周为骨重塑较为稳定的时期，此时骨组织与种植体的结合以及Micro-CT参数能够准确地反映药物对早期骨愈合的影响。因此本研究将术后4周设定为主要观察时间点^[5]。

临床上BRONJ的诊断应符合3个标准：(1)有双膦酸盐治疗史或正在接受双膦酸盐治疗；(2)骨暴露，或可通过颌面部瘘管探查到骨，且应至少持续8周；(3)无颌骨放射治疗史或颌骨转移癌病史^[31]。病理学诊断表现为无上皮覆盖的骨暴露，坏死骨和骨空腔数量增加，骨细胞减少以及细胞外骨基质脱矿等^[31]。既往BRONJ动物模型建立的诊断标准均与临床一致^[5,11]。本研究的建模结果显示，模型组大鼠在拔牙后4周出现明显的创口不愈合、坏死骨暴露等典型BRONJ临床表现，而对照组愈合良好。Micro-CT与组织学分析进一步证实，模型组拔牙窝骨愈合指标(BMD、BV/TV、Tb.n、Tb.Th)均显著低于对照组，而Tb.Sp显著高于对照组；HE与Masson染色显示模型组存在明显的骨细胞坏死、空腔形成以及炎性细胞浸润，这些结果均符合BRONJ的病理学特征，因此本研究成功构建了可靠的BRONJ大鼠模型。

在种植体植入阶段，模型组种植体周的黏膜愈合明显受损。Micro-CT显示种植体周骨结合不良，骨组织显著减少；组织学分析进一步揭示了模型组种植体周存在大量的坏死骨组织与炎性细胞浸润，纤维结缔组织生成不足，新生血管稀少。这些结果提示，双膦酸盐不仅影响着骨愈合的过程，还对种植体周围的骨结合产生明显抑制作用。免疫组织化学结果显示，模型组成骨相关基因(ALP、COL-1、BMP-2、OPN)的表达普遍低于对照组，说明双膦酸盐可能通过抑制成骨细胞的分化和功能干扰骨基质的形成与矿化过程，从而阻碍种植体周的骨愈合。OCN在两组间的差异不显著，可能归因于期在成骨早期和晚期表达的特点，或提示双膦酸盐对不同成骨标志物的影响存在时间或通路特异性。已有研究显示，OCN作为晚期成骨标志物则在成骨矿化晚期逐渐升高并趋于稳定^[32]。因此，在术后4周这一中晚期阶段，两组大鼠种植体周骨愈合处于相对成熟稳定的阶段，从而减弱了组间差异。此外，BRONJ的主要病理基础为骨代谢紊乱、血管生成抑制、免疫功能紊乱以及微生物感染^[2]，其对成骨标志物的表达影响相对间接，亦可能使两组大鼠OCN的表达差异不够显著。在未来的研究中应拟增加早期和更长期时间节点，并联合检测OPG、RANKL等骨重塑相关分子，以更为系统地阐明其分子机制。本研究在组织学分析实验中采用轻度机械拔除的方式将种植体从骨组织中取出，此方法虽能清晰观察周围骨组织的形态与细胞学变化，但无法直接评估骨-种植体接触率^[24,26]。后续研究可采用硬组织切片配合甲苯胺蓝或亚甲基蓝染色，以更精确地评价骨结合界面的生物学改变。

近年来的多项研究表明，口腔微生物的生物膜形成及菌群结构失衡加剧了BRONJ的进展，坏死骨中放线菌属的高丰度定植被认为是延迟创口愈合以及骨坏死持续进展的关键因素^[33]。本研究为凸显系统用药对骨重塑及种植体骨结合的直接影响，未行牙周炎等疾病的诱导，并通过统一饲养条件尽量控制口腔菌群差异。在未来的研究中应结合宏基因组测序和炎症因子检测，系统评估骨代谢抑制与口腔微生态紊乱之间的交互作用。

本研究的核心创新点在于通过模拟了临床用药剂量与给药途径建立了更贴近临床的BRONJ模型，并利用该模型探究了双膦酸盐对种植体骨结合及骨愈合的影响。然而，本研究仍存在一定局限性，如样本量有限、观察时间较短、未能深入探究双膦酸盐影响骨愈合的分子机制，也未涉及口腔微生物在BRONJ发生中的作用，这些均为未来的研究提供了方向。

综上所述，本研究成功建立了BRONJ大鼠模型，并证实了双膦酸盐对种植体周骨结合与骨愈合过程的显著抑制。这些发现为探究BRONJ的发病机制及其对口腔种植修复的影响提供了实验依据，也为后续干预策略的开发提供了有益参考。

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