白细胞来源趋化因子2在脓毒症相关肝损伤中的作用及机制研究

Role and mechanism of LECT2 in sepsis-associated liver injury

摘要

背景 白细胞来源趋化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2)由肝细胞产生并介导炎症过程，可能在脓毒症肝损伤中发挥核心作用。 目的 通过细胞与动物实验探讨LECT2在脓毒症相关肝损伤中的作用及机制，评估LECT2敲除的保护潜力。 方法 使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激THLE-2细胞在体外模拟脓毒症肝细胞损伤，将THLE-2细胞随机分为4组：未处理组(Control)、LECT2外源性补充组(LECT2)、LPS刺激组(LPS)和LPS刺激同时LECT2外源性补充组(LPS+LECT2)。评估LECT2对细胞活性、凋亡、死亡及上清液丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平的影响。使用盲肠结扎穿刺法(cecal ligation and puncture，CLP)构建小鼠脓毒症模型。将小鼠按随机数字表法分为6组(每组n=6)：野生型(wild-type，WT)小鼠、LECT2基因敲除(LECT2 knockout，LECT2 KO)小鼠、野生型小鼠尾静脉注射腺相关病毒8(adeno-associated virus serotype 8，AAV8)对照载体(WT+AAV8-vehicle)、野生型小鼠尾静脉注射AAV8包装全长LECT2质粒(WT+AAV8-LECT2 overexpression)、野生型小鼠尾静脉注射100 μL PBS (WT+PBS)和野生型小鼠尾静脉注射100μL rLECT2(WT+rLECT2)。对6组小鼠分别构建脓毒症模型以及与之对照的假手术模型。HE染色检测各组小鼠肝组织病理情况，检测白介素-1β(interleukin 1 beta，IL-1β)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等炎症因子的表达情况，检测各组血清ALT和AST水平。 结果 体外细胞实验：与LPS组比较，LPS+LECT2组细胞活性进一步降低(P＜0.01)，细胞损伤加重；细胞培养上清液中ALT浓度进一步升高(P＜0.05)。动物实验：脓毒症后肝脏和血清LECT2表达均较假手术组降低(P均＜0.01)；LECT2 KO组肝脏损伤病理评分比WT组低(P＜0.01)；LECT2 KO组炎症因子IL-1β比WT组低(P＜0.05)；LECT2 KO组TNF-α比WT组低(P＜0.001)；LECT2 KO组血清ALT比WT组低(P＜0.01)；LECT2 KO组血清AST比WT组低(P＜0.01)。 结论 LECT2敲除可保护脓毒症相关肝损伤，抑制炎症因子产生并改善肝组织病理和功能。

Abstract

Background Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 (LECT2), secreted by hepatocytes, participates in the regulation of inflammatory responses and may play a pivotal role in sepsis-associated liver injury. Objective To investigate the function and molecular mechanisms of LECT2 in sepsis-associated liver injury and to evaluate the protective effects of LECT2 gene knockout. Methods An in vitro model of septic hepatocellular injury was established by stimulating THLE-2 cells with lipopolysaccharide (LPS). Cells were randomly assigned to four groups: untreated control (Control), exogenous LECT2 supplementation (LECT2), LPS stimulation (LPS), and LPS with exogenous LECT2 (LPS+LECT2). The effects of LECT2 on cell viability, apoptosis, cell death, and levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in supernatants were assessed. In vivo, a murine sepsis model was generated using cecal ligation and puncture (CLP). Mice were randomly divided into six groups (n=6 per group): wild-type (WT) mice, LECT2 knockout (LECT2 KO) mice, WT mice receiving tail vein injection of AAV8 control vector (WT+AAV8-vehicle), WT mice injected with AAV8 carrying full-length LECT2 plasmid (WT+AAV8-LECT2 overexpression), WT mice injected with 100 μL PBS as vehicle control (WT+PBS), and WT mice injected with 100 μL recombinant LECT2 protein (WT+rLECT2). CLP-induced sepsis models and corresponding sham operations were performed in all groups. Liver histopathological changes were evaluated by H&E staining, expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-1β (IL-1β), IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured, and serum concentrations of ALT and AST were determined. Results In vitro, compared with the LPS group, the LPS+LECT2 group showed further reduced THLE-2 cell viability (P＜0.01), aggravated cellular injury, and a further increase in ALT concentration in the culture supernatant (P＜0.05). In vivo, hepatic and serum LECT2 expression in sepsis model groups was markedly downregulated compared to sham groups (both P＜0.01). The liver histopathological injury score in the LECT2 KO group was lower than in the WT group (P＜0.01). Hepatic expression of IL-1β and TNF-α in the LECT2 KO group was lower than in the WT group (P＜0.05 and P＜0.001, respectively). Serum levels of ALT and AST in the LECT2 KO group were also significantly lower than in the WT group (both P＜0.01). Conclusion LECT2 gene knockout attenuates sepsis-associated liver injury, suppresses inflammatory cytokine release, and improves liver histopathological structure and function.

Graphical abstract

关键词

白细胞来源趋化因子2 / 脓毒症 / 肝损伤 / 炎症反应 / 肝功能

Key words

leukocyte cell-derived chemotaxin 2 / sepsis / liver injury / inflammatory response / liver function

脓毒症是感染诱导的宿主免疫功能障碍，可进展为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)并导致死亡^[1-3]。在脓毒症相关器官损伤中，肝脏受累常见且可在早期出现急性肝功能障碍，与危重患者死亡风险相关^[4-9]。目前尚缺乏针对脓毒症相关肝损伤的特异性治疗，亟需阐明其关键致病机制以开发靶向干预策略。

脓毒症相关肝损伤(sepsis-associated liver injury，SALI)以肝细胞功能不全和过度炎症反应为特征^[10-11]，其中中性粒细胞与巨噬细胞的募集和活化被认为是炎症放大与器官损伤的重要驱动因素^[12-15]。因此，调控免疫细胞迁移与活化的趋化因子通路可能参与SALI发生发展。白细胞来源趋化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2)可介导中性粒细胞迁移并参与炎症免疫调节^[16-18]。在毒素或自身免疫性急性肝损伤模型中LECT2水平上调，且敲除LECT2可减轻肝损伤^[19-20]。然而，脓毒症患者及动物模型中LECT2血浆水平降低，并与炎症严重程度及不良预后相关，其在SALI中的作用方向仍不明确^[21-22]。本研究结合体外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激THLE-2细胞模型与盲肠结扎穿刺法(cecal ligation and puncture，CLP)诱导的脓毒症小鼠模型，比较野生型、LECT2敲除、LECT2过表达及外源补充条件下的肝损伤表型，以明确LECT2在SALI中的作用并评估LECT2敲除的潜在保护效应，为后续开发LECT2拮抗策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及动物

人肝永生化细胞(THLE-2)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，使用THLE-2细胞专用培养基，将细胞置于5% CO₂、37℃的饱和湿度细胞培养箱中培养，每2 ~ 3 d进行传代。雄性野生型C57BL/6J小鼠，6 ~ 8周龄，体重为18 ~ 22 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。LECT2基因敲除C57BL/6J小鼠由宁波大学的陈炯教授团队友情提供。所有小鼠在解放军总医院第四医学中心动物实验室恒温(25±3℃)、恒湿(50%±5%)条件下适应性饲养1周，实验前禁食12 h，禁水4 h。本研究经解放军总医院实验动物伦理委员会批准(伦理号2021KY033-KS001)。

1.2 实验试剂及设备

腺相关病毒8(adeno-associated virus serotype 8，AAV8)包装全长LECT2质粒及其对照载体购自汉恒生物科技(上海)有限公司，小鼠重组LECT2蛋白(rLECT2)由南京金斯瑞生物科技有限公司设计并合成。LPS(Sigma-Aldrich)，CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，多功能酶标仪(Thermo Scientific)，4%多聚甲醛(武汉塞维尔生物科技有限公司)，0.1% Triton X-100免疫染色通透液(Biosharp)，Cell Meter TUNEL凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；北京索莱宝科技有限公司)，Pannoramic Scan扫描仪(3DHISTECH)，Calcein-AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，荧光显微镜(Olympus)，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)测定试剂盒和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)测定试剂盒(武汉恩玑生命科技有限公司)，LECT2检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)，TRIzol试剂(Invitrogen)，HiScript IV RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，CFX Opus 96多通道实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)，苏木精和伊红染色试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司)，Tris-EDTA抗原修复液(北京索莱宝科技有限公司)，10% BSA(Sigma-Aldrich)，LECT2单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)，山羊抗小鼠二抗(Invitrogen)，全自动生化分析仪(TOSHIBA)。

1.3 细胞实验分组及模型建立

根据既往文献使用1 μg/mL LPS刺激THLE-2细胞24 h以在体外模拟脓毒症环境^[23]，根据前期预实验结果选取50 ng/mL LECT2与THLE-2细胞共培养24 h进行LECT2外源性补充，将细胞随机分为以下4组(n=3，表示3次独立生物学重复；每次重复中各组设置≥3个复孔用于检测)：(1)未处理组(Control)；(2)LECT2外源性补充组(LECT2)；(3)LPS刺激组(LPS)；(4)LPS刺激同时LECT2外源性补充组(LPS+LECT2)。在随机分组的基础上分别对各组进行相应的干预处理。

1.4 CCK-8检测细胞活性

将细胞置于96孔板中培养至70% ~ 90%融合，对4组细胞(Control、LECT2、LPS、LPS+LECT2)分别进行24 h刺激。使用CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒，根据制造商的说明书向96孔板每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育1 h后使用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.5 TUNEL检测细胞凋亡

将细胞置于24孔板中盖玻片上爬片生长至70% ~ 90%融合，对4组细胞(Control、LECT2、LPS、LPS+LECT2)分别进行24 h刺激。使用4%多聚甲醛在室温下固定15 min，用0.1% Triton X-100免疫染色通透液在冰上透化5 min。使用Cell Meter TUNEL凋亡检测试剂盒，根据制造商的说明书每片盖玻片滴加100 μL TUNEL反应混合物并在37℃下孵育1 h，用DAPI对细胞核进行复染。封片后使用Pannoramic Scan扫描仪扫描图像后进行观察。

1.6 Calcein-AM/PI检测细胞死亡

将细胞置于96孔板中培养至70% ~ 90%融合，对4组细胞(Control、LECT2、LPS、LPS+LECT2)分别进行24 h刺激。使用Calcein-AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒，根据制造商的说明书向96孔板每孔加入100 μL Calcein-AM/PI检测工作液，在培养箱中孵育30 min后使用荧光显微镜观察活细胞和死细胞。

1.7 动物实验分组及模型建立方法

将小鼠按随机数字表法分为6组(每组n=6)：(1)野生型(wild-type，WT)小鼠；(2)LECT2基因敲除(LECT2 knockout，LECT2 KO)小鼠；(3)野生型小鼠尾静脉注射AAV8对照载体(WT+AAV8-vehicle)；(4)野生型小鼠尾静脉注射AAV8包装全长LECT2质粒(WT+AAV8-LECT2 overexpression)；(5)野生型小鼠尾静脉注射100 μL PBS (WT+PBS)；(6)野生型小鼠尾静脉注射100μL rLECT2(WT+ rLECT2)。其中，WT+AAV8-vehicle组和WT+AAV8-LECT2 overexpression组小鼠于建模前3周经尾静脉注射100 μL相应病毒，病毒滴度为1×10¹² vg/mL。对上述6组小鼠分别构建脓毒症模型以及与之对照的假手术模型。小鼠脓毒症模型的构建使用盲肠结扎穿刺法^[24]。将小鼠用小动物麻醉机完全麻醉后，对小鼠腹部进行脱毛，于腹正中做1 cm切口，暴露盲肠并结扎盲肠端1/2(50%)，结扎后使用21G针头在结扎部位贯穿盲肠。挤出少量粪便后将盲肠放回小鼠体内，缝合腹部切口。假手术模型(Sham)行剖腹手术，暴露盲肠，不行盲肠结扎和穿刺，其余步骤与CLP相同。WT+PBS和WT+rLECT2组小鼠在CLP或假手术处理后立即经尾静脉注射相应溶液。CLP或假手术处理后24 h各组小鼠均正常饲养。

1.8 酶联免疫吸附试验检测ALT、AST和LECT2浓度

对于4组细胞(Control、LECT2、LPS、LPS+LECT2)分别收集细胞培养上清液，以1 000 r/min离心20 min收集上清液，使用ALT测定试剂盒和AST测定试剂盒和多功能酶标仪检测细胞培养上清液中ALT和AST浓度。摘眼球取血法收集野生型小鼠Sham组和CLP模型组诱导脓毒症后24 h的血液，血液样品以2 000 r/min离心10 min，收集血清，使用LECT2检测试剂盒和多功能酶标仪检测小鼠血清中LECT2浓度。

1.9 定量逆转录聚合酶链反应检测目的基因相对mRNA表达水平

使用TRIzol试剂提取来自小鼠肝组织的总RNA，使用HiScript Ⅳ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)制备cDNA。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix和CFX Opus 96多通道实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应。以GAPDH mRNA水平作为内参，使用2^-ΔΔCT分析方法分别计算目标基因LECT2、IL-1β、IL-6和TNF-α的相对mRNA表达水平。具体内容：检测野生型小鼠Sham组和CLP诱导脓毒症后24 h的小鼠肝组织中LECT2的表达水平；检测Sham组、野生型小鼠、LECT2 KO组小鼠、WT+AAV8-LECT2 overexpression组小鼠和WT+rLECT2组小鼠CLP诱导脓毒症后24 h的小鼠肝组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。

1.10 HE染色检测小鼠肝脏病理变化

将野生型、LECT2 KO、WT+AAV8-vehicle、WT+AAV8-LECT2 overexpression、WT+PBS和WT+rLECT2组小鼠Sham和CLP诱导脓毒症后，24 h得到的新鲜肝组织分别置于4%多聚甲醛中固定24 h，然后包埋于石蜡中。将石蜡组织块切为5 μm石蜡切片，脱蜡复水后使用苏木精和伊红染色试剂盒对切片进行HE染色，使用Pannoramic Scan扫描仪扫描图像后进行组织学检查，同时每张切片在高倍视野下(40×)随机选取5个不同视野，由2名研究人员根据Suzuki肝损伤评分进行盲评，即分别对肝窦淤血、肝细胞胞浆空泡样变和肝实质坏死这3项指标进行评分，每项0 ~ 4分，3项相加得到累积分(0 ~ 12分)^[25]。为提高可重复性，评分细则如下：肝窦淤血与肝细胞胞浆空泡样变按程度分为0=无、1=最轻、2=轻、3=中、4=重；肝实质坏死按范围分为0=无，1=偶见坏死细胞，≤30%为2，30% ~ 60%为3，≥60%为4。

1.11 免疫荧光染色检测小鼠肝脏LECT2蛋白分布

对于野生型小鼠Sham组和CLP诱导脓毒症后24 h得到的肝组织，如上所述制备组织石蜡切片，使用Tris-EDTA抗原修复液进行抗原修复后使用10% BSA封闭切片，在4℃下与小鼠LECT2单克隆抗体孵育过夜。从4℃取出切片后于室温在黑暗中平衡、洗涤后与山羊抗小鼠二抗孵育1 h，洗涤后用DAPI对细胞核进行染色并密封切片。使用Pannoramic Scan扫描仪扫描图像后进行观察。

1.12 血清ALT和AST水平检测

如上所述收集野生型小鼠Sham组和野生型小鼠、LECT2 KO组小鼠、WT+AAV8-LECT2 overexpression组小鼠和WT+rLECT2组小鼠CLP诱导脓毒症后24 h血清，使用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST水平，并以WT Sham组均值归一化为1，计算各组ALT和AST相对水平用于统计分析和作图。

1.13 统计学分析

使用SPSS 27.0进行统计学分析，GraphPad Prism 9.0进行图形绘制。实验数据以至少3次独立生物学重复的结果进行统计。符合正态分布且方差齐的数据以均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Tukey事后检验。不符合正态分布或方差不齐的数据采用非参数检验。Suzuki肝损伤病理评分为有序评分资料，以每只小鼠5个视野评分的平均值作为该动物最终评分纳入统计分析，并采用Kruskal-Wallis秩和检验进行多组比较，组间两两比较采用Dunn's multiple comparisons test。以P＜0.05为差异具有统计学意义

2 结果

2.1 THLE-2细胞活性、凋亡及死亡变化

CCK-8测定细胞活性变化时，LECT2单独处理即可降低THLE-2细胞活性(Control vs LECT2：1.00±0.05 vs 0.81±0.01，P＜0.001)，LPS可显著降低细胞活性(Control vs LPS：1.00±0.05 vs 0.43±0.02，P＜0.001)，而LPS+LECT2可进一步使细胞活性下降(Control vs LPS+LECT2：1.00±0.05 vs 0.26±0.01，P＜0.001；LPS vs LPS+LECT2：0.43±0.02 vs 0.26±0.01，P＜0.01)。TUNEL染色和Calcein-AM/PI染色一致提示：LPS可诱导THLE-2细胞凋亡和死亡，LPS联合LECT2后进一步加重THLE-2细胞的凋亡和死亡。见图1。

2.2 THLE-2细胞培养上清液中ALT和AST浓度变化

细胞培养上清液中ALT和AST水平在LECT2、LPS及LPS+LECT2组均高于Control组。ALT的浓度在LPS刺激基础上联合LECT2时进一步升高(LPS vs LPS+LECT2：7.34±0.27 U/L vs 8.47±0.23 U/L，P＜0.05)。而LPS+LECT2组细胞培养上清液中AST的浓度与LPS组相比结果无统计学差异(LPS vs LPS+LECT2：7.51±0.18 vs 7.82±0.21 U/L)。见图2。

2.3 脓毒症小鼠血清及肝脏LECT2表达变化

野生型小鼠CLP诱导脓毒症后24 h血清中LECT2水平低于Sham组(13.99±1.81 ng/mL vs 28.81±2.45 ng/mL，P＜0.01)，肝脏LECT2表达同步下调(16.6%±1.4% vs 101.2%±15.9%，P＜0.001)，并在免疫荧光染色中表现为肝组织LECT2信号减少(图3)。

2.4 AAV8介导的肝脏LECT2过表达验证

WT+AAV8-vehicle和WT+AAV8-LECT2 overexpression组小鼠在实验前3周经尾静脉注射相应病毒，为验证AAV8介导的肝脏转导效率，3周后取小鼠肝脏做冷冻切片可在荧光显微镜(Olympus)下观察到肝组织中存在明显的绿色荧光信号，提示AAV8在肝脏转导有效(图4)。

2.5 各组小鼠肝组织病理变化

Sham条件下各组肝组织形态基本正常。CLP诱导脓毒症24 h后，各组均出现不同程度肝损伤(肝板紊乱、充血和出血、坏死及炎细胞浸润)。与WT对照组比较，LECT2过表达(AAV8-LECT2)或外源rLECT2处理表现为更广泛的坏死和出血及更显著的炎症浸润，LECT2 KO组整体损伤相对减轻(图5A)。图5B中肝损伤定量病理评分结果与形态学观察一致，WT、WT+AAV8-vehicle及WT+PBS组评分相近，AAV8-LECT2 overexpression组与rLECT2组评分最高，而LECT2 KO组评分最低。病理评分进一步提示，LECT2 KO显著减轻肝损伤(WT vs LECT2 KO：4.80±0.29 vs 2.80±0.39，P＜0.01)，而AAV8介导LECT2过表达或rLECT2外源性补充均可加重肝损伤(WT vs WT+AAV8-LECT2 overexpression：4.80±0.29 vs 7.10±0.38，P＜0.001；WT vs WT+rLECT2：4.80 ± 0.29 vs 7.30±0.37，P＜0.001)。

2.6 各组小鼠肝组织炎症因子表达及血清ALT和AST水平

鉴于各组小鼠Sham处理后肝损伤程度相当，CLP诱导脓毒症24 h后WT组、WT+AAV8-vehicle组和WT+PBS组肝损伤程度类似，以下以WT Sham组作为代表，与CLP诱导脓毒症24 h后WT组、LECT2 KO组、WT+AAV8-LECT2 overexpression组及WT+rLECT2组进行比较，其余Sham数据未展示。

图6A可见CLP 24 h后肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α表达均升高，LECT2 KO可部分降低炎症因子表达(以IL-1β与TNF-α更为明显)，而LECT2过表达或外源rLECT2补充进一步增强炎症反应。图6B可见与炎症变化一致，CLP 24 h后血清ALT和AST显著升高。LECT2 KO可降低转氨酶水平，而LECT2过表达或外源rLECT2补充可进一步升高ALT和AST。

3 讨论

脓毒症是一种由感染触发的失控性全身炎症反应，可迅速进展为多器官功能障碍综合征。其中，脓毒症相关肝损伤常表现为肝细胞损伤和坏死、炎症介质过度释放以及肝功能失代偿，不仅加重机体免疫代谢紊乱，还与更高的死亡风险密切相关。尽管近年来脓毒症的早期识别与支持治疗不断优化，但SALI的关键致病环节仍未被充分阐明，临床上亦缺乏明确有效的特异性靶向干预策略^[26-27]。白细胞来源趋化因子2是一种主要由肝细胞分泌的多功能肝激素，参与炎症调控与免疫应答并呈现情境依赖性的双向效应，一方面可放大炎症级联反应，另一方面在特定感染背景下又可能参与宿主防御与免疫稳态维持。然而，LECT2在脓毒症背景下对肝脏局部损伤的直接作用及其机制尚缺乏独立、系统的功能学证据支持，仍需进一步评估与澄清^[21,28-29]。

在研究中发现CLP诱导脓毒症24 h观察到小鼠血清LECT2水平显著下降，且与肝组织LECT2 mRNA及蛋白表达的同步下调相一致。这一现象与既往临床及动物研究的报道基本一致，即脓毒症急性期循环LECT2水平降低，且低水平与疾病严重程度及不良预后呈正相关^[28,30]。然而，必须正确解读这一相关性，LECT2水平的下降并不意味着其缺失是导致病情恶化的原因，而更可能是严重的肝细胞功能衰竭所致的继发性后果。LECT2作为一种主要由肝细胞分泌的肝激素，其血清水平高度依赖于肝脏的合成储备^[30]。在脓毒症打击下，肝细胞经历广泛的炎症应激、缺氧、能量代谢重编程乃至凋亡坏死，直接导致包括LECT2在内的多种肝源性蛋白转录与合成受阻^[31]。因此，LECT2在此时可能表现为一种负性急性期反应蛋白，其水平降低反映了肝实质损伤的严重程度，而非机体的保护性下调^[32]。此外，虽然循环LECT2的减少主要归因于合成受损，但也可能涉及脓毒症高炎症状态下外周组织的分布重塑、血管渗漏或受体介导的消耗增加^[33]。最关键的是，尽管内源性LECT2水平已降低，本研究的功能性干预实验(KO与过表达)有力证实了残存的LECT2仍具有显著的致病性。人为阻断LECT2通路(KO)可进一步减轻肝损伤，而试图纠正这种下降(外源补充)反而加剧了细胞死亡与细胞因子风暴^[34]。这提示LECT2在SALI中扮演着驱动损伤的中心角色，而非因消耗殆尽而导致保护缺失。受限于本研究单一时间节点的检测，未来需结合时序性分析与代谢动力学研究，进一步明确LECT2从合成抑制到清除改变的动态机制。

本研究通过体内外多维度的功能学操控，建立了LECT2通路活性与SALI严重度之间的因果联系。在相同CLP脓毒症病理背景下，LECT2基因缺失显著缓解肝组织损伤表型，表现为肝窦和微循环灌注障碍改善、坏死范围减小，并伴随关键促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)转录水平及血清ALT/AST同步下降；相反，无论是AAV介导的LECT2过表达，还是重组LECT2的外源补充，均进一步加重肝实质损伤与炎症反应，呈现与KO方向完全相反的表型。结合坏死区域扩大与炎性细胞浸润增强等组织学证据，上述结果支持LECT2在SALI中更可能充当炎症和损伤的放大器。一方面，LECT2可在肝脏免疫细胞层面增强炎症信号与促炎表型如促进巨噬细胞向M1型极化并放大LPS相关信号轴，从而推动细胞因子级联与组织损伤进展^[19,35]。另一方面，LECT2还可能通过影响内皮和肝窦微血管功能而放大微循环紊乱，从而在灌注和炎症正反馈中促使肝损伤恶化^[36]。值得强调的是，尽管脓毒症急性期常伴随肝细胞合成和分泌功能受损及循环LECT2下降，但这并不等同于LECT2缺乏导致保护缺失。相反，本研究的功能性证据提示，在高炎症微环境中，即便内源LECT2整体下调，残存LECT2信号仍足以驱动病理放大，而外源补充更可能加剧炎症瀑布与肝细胞崩解。鉴于脓毒症相关肝损伤的核心病理环节之一即为微循环障碍与炎症失控，目前尚缺乏特异性靶向治疗^[37-38]，本研究的结果整体上不支持在该情境下将LECT2作为替代补充策略；相反，LECT2轴更符合可阻断靶点的定位，其药理学抑制的时序窗口与潜在感染清除风险仍需在后续研究中进一步评估与界定^[28,34,39]。

本研究的体外实验进一步揭示了LECT2致病作用的另一关键维度，非免疫依赖的实质细胞易损伤和直接毒性。在缺乏中性粒细胞或巨噬细胞参与的THLE-2单纯培养体系中，LPS单独刺激仅引发有限的细胞活力下降，而外源性LECT2的加入显著放大了细胞活力丧失并促进凋亡和坏死，且与培养上清ALT/AST快速升高相一致。该结果提示LECT2不仅可作为免疫调节因子，还可能在脓毒症应激背景下直接作用于受损肝实质细胞，增强其对内毒素和炎症刺激的敏感性。值得注意的是，既往研究已显示LPS可直接调控肝细胞LECT2表达，提示其具备形成肝细胞自分泌和旁分泌放大环路的潜在生物学基础^[28,40]。结合既往关于LECT2的免疫学特征，本研究提出LECT2在体内可能通过双重作用机制驱动SALI进展。其一，LECT2可在炎症应激下直接加重肝细胞损伤与死亡；其二，LECT2可能通过趋化并放大先天免疫细胞反应，促进中性粒细胞和巨噬细胞向肝内募集并增强其炎症效应，从而与SALI已知的微循环和炎症正反馈回路耦联，进一步放大肝内细胞因子风暴^[19,36]。尽管本研究在体内已观察到炎症因子谱随LECT2操控而发生一致性改变，但LECT2是否进一步驱动肝内免疫微环境重塑仍需更直接证据。鉴于中性粒细胞胞外杀菌网络与中性粒细胞效应在脓毒症相关器官损伤中呈现双刃剑特征，且SALI的关键环节之一即为微循环障碍与炎症失控，后续研究可在时序维度上整合单细胞测序、流式分群与空间和组织免疫表型学，系统刻画LECT2操控下免疫细胞组成、活化状态与效应分子网络的变化^[13,41]。此外，采用更具细胞类型分辨率的干预策略，将有助于明确LECT2在实质细胞损伤和免疫细胞活化之间的关键连接点及可转化靶窗。

综上，脓毒症后循环及肝组织LECT2下降与疾病状态相关，其下降机制仍需进一步从LECT2的时间动态与分布和清除角度加以解析。更重要的是，本研究的体内功能学干预与体外结果共同提示LECT2在SALI中更偏向促损伤效应，为后续开发LECT2拮抗或通路抑制的靶向干预提供了实验依据。鉴于既往研究提示血浆LECT2与疾病严重度和结局存在关联，未来亦可并行评估其在SALI中的标志物价值与治疗靶点价值，为分层干预与转化研究提供更完整的证据框架。

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