抑制内侧眶额叶皮层Drd2阳性神经元活性对偏头痛模型小鼠痛觉过敏及焦虑样行为的改善作用

Inhibition of Drd2 positive neuronal activity in medial orbital frontal cortex ameliorates hyperalgesia and anxiety-like behaviors in mice with migraine

摘要

背景 偏头痛是一种发病率极高的神经血管性疾病。既往研究表明，偏头痛患者内侧眶额叶皮层(medial orbitofrontal cortex，MO)及多巴胺2型受体(dopamine D2 receptor，Drd2)在疼痛感知与情绪调节中发挥重要作用，但MO脑区的Drd2阳性神经元在偏头痛发生发展中的具体作用及调控机制仍有待明确。 目的 探讨MO脑区Drd2阳性神经元在偏头痛相关痛觉过敏及焦虑样行为中的调控作用，并初步探索其内在机制。 方法 腹腔注射硝酸甘油(nitroglycerin，NTG，10 mg/kg)或0.9%氯化钠水溶液构建小鼠急性偏头痛模型和对照组模型；利用Von Frey纤维丝测定小鼠足底及眶周的机械痛阈，借助旷场实验评估两组小鼠的焦虑样行为；通过在体光纤钙成像技术实时记录注射NTG前后MO脑区Drd2阳性神经元的钙活性动态变化；运用化学遗传学手段调控模型组小鼠的神经元活性，分为激活组、抑制组和空白对照组，检测3组小鼠的足底和眶周机械痛阈和焦虑样行为。 结果 腹腔注射NTG后2 h，小鼠足底(P＜0.05)及眶周(P＜0.01)机械痛阈降低，同时旷场中心区域停留时间减少(P＜0.05)。光纤钙成像结果显示，注射NTG后MO脑区Drd2阳性神经元钙活性呈持续下降趋势：钙信号在注射后30 ~ 40 min较基线水平降低(P＜0.01)，至90 ~ 100 min时降至最低值(P＜0.001)。化学遗传学手段抑制MO脑区Drd2阳性神经元活性后，小鼠的足底(P＜0.01)及眶周机械痛阈(P＜0.001)升高，且其在旷场中心区域的停留时间延长(P＜0.05)；而特异性激活该类神经元则未对上述两种病理表型产生影响(P＞0.05)。 结论 MO脑区Drd2阳性神经元活性的降低参与介导了偏头痛相关的痛觉过敏及焦虑样行为的发生发展；特异性抑制该类神经元的活性可有效缓解上述病理表型。这提示MO脑区Drd2阳性神经元或可成为偏头痛治疗的潜在干预靶点。

Abstract

Background Migraine is a highly prevalent neurovascular disorder. Previous studies have demonstrated that the dopamine system in the medial orbitofrontal cortex (MO) exhibits functional abnormalities in migraine patients. As a critical component of the mesolimbic dopamine system, the dopamine D2 receptor (Drd2) within the MO plays an important role in pain perception and emotional modulation. Nevertheless, the specific role and regulatory mechanism of Drd2-positive neurons in the MO in the pathogenesis and progression of migraine remain to be clarified. Objective This study aimed to investigate the regulatory role of Drd2 positive neurons in the MO in migraine-related hyperalgesia and anxiety-like behaviors, as well as to preliminarily explore the underlying mechanisms. Methods The study employed intraperitoneal injection of nitroglycerin (NTG, 10 mg/kg) or normal saline to establish acute migraine model mice and control group mice, respectively. The mechanical pain thresholds of the plantar region and peri-orbital area were measured using Von Frey filaments. Anxiety-like behavior in both groups was assessed using the open field test. In vivo fiber photometry calcium imaging was utilized to real-time record the dynamic changes in calcium activity of Drd2 positive neurons in the MO before and after NTG injection. Chemogenetic approaches were applied to modulate neuronal activity in the model mice, which were further divided into an activation group, an inhibition group, and a control group. The mechanical pain thresholds (plantar and peri-orbital) and anxiety-like behavior were subsequently examined and compared among these three groups. Results Two hours after intraperitoneal NTG injection, the mechanical pain thresholds of the plantar region (P＜0.05) and peri-orbital area (P＜0.01) in mice were significantly decreased. Concurrently, the time spent in the central zone of the open field was reduced (P＜0.05). Fiber photometry results revealed a sustained decreasing trend in the calcium activity of Drd2 positive neurons in the MO cortex following NTG injection. The calcium signals significantly decreased compared to the baseline level at 30-40 minutes post-injection (P＜0.01) and reached their lowest point at 90-100 minutes (P＜0.001). Following chemogenetic inhibition of Drd2 positive neuron activity in the MO cortex, the mechanical pain thresholds of the plantar region (P＜0.01) and peri-orbital area (P＜0.001) in mice were significantly increased. Furthermore, the time spent in the central zone of the open field was significantly prolonged (P＜0.05). In contrast, specific activation of these neurons did not produce a significant effect on the aforementioned two pathological phenotypes (P＞0.05). Conclusion The decreased activity of Drd2 positive neurons in the MO is involved in mediating the pathogenesis and progression of migraine-related hyperalgesia and anxiety-like behaviors; specific inhibition of the activity of these neurons can effectively alleviate the aforementioned pathological phenotypes.

Graphical abstract

关键词

偏头痛 / 内侧眶额叶皮层 / 痛觉过敏 / 焦虑样行为 / 多巴胺2型受体

Key words

migraine / medial orbitofrontal cortex / hyperalgesia / anxiety-like behaviors / dopamine d2 receptor

偏头痛是一种常见的神经血管性脑疾病，全球患病率约15%^[1]。其临床特征为反复发作性的中重度搏动性头痛，常伴有恶心、呕吐、畏光、畏声等症状，且常与焦虑、抑郁等负性情绪共病，严重影响患者生活质量^[2-3]。偏头痛的病理生理学机制尚不完全清楚，目前普遍认为其发生涉及多脑区、多递质系统的异常活动，包括疼痛感知、处理与情绪调控等相关脑区的结构或功能异常^[4-5]。

中脑多巴胺(dopamine，DA)系统作为中枢神经系统重要的神经调节系统，在疼痛信号整合与情绪调控中发挥关键作用^[6]。研究显示，急性疼痛可激活中脑DA系统，而长期慢性疼痛则导致DA系统功能耗竭，进而加剧疼痛感知及相关伤害性情绪^[7]。此外，多巴胺受体介导的信号通路是DA系统发挥镇痛作用的重要途径，其中多巴胺2型受体(dopamine D2 receptor，Drd2)作为中枢神经系统关键G蛋白偶联受体，广泛参与疼痛调制、情绪调节等生理病理过程，提示Drd2相关通路可能参与偏头痛的神经生物学机制^[8]。内侧眶额叶皮层(medial orbitofrontal cortex，MO)是中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)多巴胺能投射的重要靶区，参与情绪调节、奖赏及高级认知过程。前期研究发现，慢性偏头痛伴药物过度使用患者的MO脑区多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)代谢减少，提示其DA系统功能异常可能与偏头痛发病相关^[9]。

本课题组推测MO脑区Drd2阳性神经元可能通过调控中脑DA系统－疼痛下行通路，参与偏头痛痛觉过敏的病理生理过程。本研究采用腹腔注射硝酸甘油构建偏头痛模型，结合在体光纤钙成像及化学遗传学技术，探讨MO区Drd2阳性神经元的活性变化及其对痛觉过敏和焦虑样行为的作用，为进一步阐明偏头痛的皮层调控机制及寻找新的潜在干预靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究选取8 ~ 10周龄SPF级C57BL/6J野生型雄性小鼠，购自北京斯贝福生物科技有限公司，用于偏头痛模型构建及后续行为学验证。Drd2-Cre工具鼠购自广东金致和生物技术有限公司，其品系编号为B6.FVB (Cg)-Tg (Drd2-Cre) ER44Gsat/Mmucd(Stock Number：032108-UCD)。该品系的构建原理如下：将Cre重组酶编码序列定向插入Drd2基因启动子下游区域，实现Cre重组酶在Drd2阳性神经元中的特异性表达，为后续神经元特异性操作提供工具基础。此外，该品系小鼠与C57BL/6J近交系小鼠连续回交5代以上，以纯化遗传背景，使其核心遗传特征与C57BL/6J高度一致。同时，该Drd2-Cre品系是神经科学领域研究Drd2阳性神经元功能的经典工具鼠，已在多篇关于痛觉调控、精神疾病相关的研究中与C57BL/6J背景小鼠联合使用，其表型稳定性与背景兼容性已被同行验证^[10]。所有实验均按照《实验动物管理条例》进行，并经解放军总医院实验动物管理与使用委员会批准。

1.2 主要试剂配置

硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)溶液：硝酸甘油注射液(北京益民药业，5 mg/mL)以0.9%氯化钠水溶液按照1∶10体积比稀释，制备终浓度为0.5 mg/mL的工作液。该溶液需现配现用，以保证药效稳定性。

氯氮平N - 氧化物(clozapine N-oxide，CNO)溶液：取5 mg CNO粉末(Brain VTA，武汉枢密)，加入100 μL二甲基亚砜充分溶解，制备浓度为50 mg/mL的母液。母液分装后置于-80℃环境下密封保存，防止反复冻融导致试剂降解；使用时取20 μL母液，加入4 980 μL 0.9%氯化钠水溶液稀释，制备终浓度为0.2 mg/mL的工作液，该工作液需现配现用。

1.3 偏头痛小鼠模型的建立

选取16只8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠，采用随机数字表法分为两组：偏头痛模型组(n=8)与正常对照组(n=8)。模型组小鼠通过腹腔注射NTG溶液(10 mg/kg，基于小鼠体质量计算)；对照组小鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠水溶液，以排除注射操作及溶剂本身对实验结果的干扰。

1.4 Von Frey实验检测痛觉过敏

使用校准的Von-Frey纤维丝(美国North Coast 公司，NC12775-99)分别检测小鼠足底及眶周皮肤(内眦区域)的机械痛阈，具体流程如下：检测前3天，将小鼠置于检测者手掌和避光的塑料盒子中进行环境适应，每天适应1次，手掌适应每次5 min，盒子适应每次30 min，以减少应激反应对检测结果的干扰。检测时，实验设置3个关键时间节点进行机械痛阈测定，分别为给药前30 min(基线期)、给药后30 min及给药后2 h(图1A)。将一系列不同重量的纤维丝由小到大垂直施加在目标部位，让纤维丝弯曲并至少持续3 s。纤维丝刺激的顺序根据“up-down”方法决定，足底痛阈从0.16 g纤维丝开始，眶周痛阈从0.02 g开始。眶周刺激时如果小鼠在3 s内出现头部后退、甩头或者用前爪理毛，则为阳性反应；足底刺激的阳性反应表现为后爪撤退、后爪张开或舔舐爪子。如果小鼠未出现阳性反应，则施加更大一级重量的纤维丝，如果出现阳性反应则施加小一级的纤维丝，直到完成系列刺激。最后，对测量得到的结果使用https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app提供的在线算法拟合得出50%的机械痛阈。

1.5 灌流取脑和切片制备

各组小鼠经腹腔注射1.25% Avertin溶液(剂量 0.2 mL/10 g 体质量)进行深度麻醉，随后将小鼠仰卧固定，常规消毒胸部及腹部皮肤。剪开胸腔暴露心脏，左心室插入灌流针，剪右心房为流出道，先以5 ~ 10 mL/min灌常温0.9%氯化钠水溶液20 mL，后继续灌注4℃ 0.9%氯化钠水溶液20 mL至体表白净、肝脏颜色变浅，再换4%多聚甲醛(para-formaldehyde，PFA)以2 ~ 3 mL/min灌15 ~ 20 mL至脑组织变硬。灌流结束后，迅速剪头置冰浴，剥颅骨后轻柔分离脑组织，放入4% PFA。脑组织经4% PFA固定24 h后，依次浸入15%和30%的蔗糖溶液，直至脑组织完全沉底。随后，将脑组织包埋于OCT包埋剂(货号4583，美国樱花公司)中，于-20℃冷冻至少30 min，再使用冰冻切片机(型号CM1950，德国徕卡生物系统公司)制备厚度为30 μm的冠状切片。切片经磷酸盐缓冲液收集后，于4℃保存备用。

1.6 病毒构建和包装

化学遗传学病毒和钙成像病毒均购自武汉Brain VTA公司(表1)。

1.7 脑立体定向注射及光纤埋置

将-80℃冰箱保存的病毒取出放在冰上融化，置于4℃冰箱暂存。小鼠腹腔注射1.25% Avertin溶液(0.02 mL/g)麻醉，剃除头部毛发，碘伏消毒后固定于定位仪，调节耳杆与门齿杆使颅顶水平。参考脑图谱确定目标脑区坐标，因双侧MO上方邻近上矢状窦，垂直注射易损伤血管导致出血，为减少手术损伤，本研究采用倾斜注射方式(倾斜角度14°)，最终确定注射坐标为：前后径(anteroposterior dimension，AP)+2.46 mm，左右径(mediolateral dimension，ML)±0.85 mm，背腹径(DV)-2.57 mm(均以bregma为原点)。颅骨钻在目标位置钻孔后，微量注射器吸取病毒，缓慢插入钻孔至DV坐标深度，以30 nL/min速度注射200 nL，注射完毕后留针10 min再缓慢拔针，缝合皮肤。光纤记录实验中，在病毒留针完毕后沿相同路径植入光纤(直径200 µm，数值孔径0.37，Inper，中国杭州)，深度为-2.37 mm。术中和术后将小鼠置于37℃复温毯上复苏。

1.8 脑组织病毒荧光成像

组织切片采用匈牙利布达佩斯3DHISTECH公司的Pannoramic MIDI扫描仪进行扫描拍摄，并通过该扫描仪配套的Slide Viewer软件对原始图像进行读取与导出。

1.9 光纤钙成像记录

采用光纤记录系统(ThinkerTech，南京，中国)同步监测内侧眶额叶皮层脑区Drd2阳性神经元的GCaMP6s钙信号。实验前，将小鼠头部预埋的光纤套管与光纤跳线(Newdoon，中国)精准对接，通过光纤耦合器连接至多通道在体荧光成像系统，确保信号传输稳定。该系统配备405 nm、470 nm激发光通道，其中405 nm 通道(20 μW)采集的信号用作背景校正信号，GCaMP6s钙信号通过470 nm 通道(30 μW)采集。

信号记录设定2个关键时间节点：偏头痛模型构建前2 d(基线期)与NTG注射当天(模型期)。记录流程如下：基线期将小鼠置于定制行为箱中，适应环境30 min以排除应激反应对信号的干扰；0 min时对小鼠进行腹腔注射操作，随后采集10 min基线信号(F₀)；接下来对小鼠腹腔注射0.9%氯化钠水溶液并持续采集100 min信号。模型期操作流程同上，与基线期完全一致，仅将腹腔注射的试剂由0.9%氯化钠水溶液替换为终浓度0.5 mg/mL的NTG溶液，以构建偏头痛模型并同步记录模型状态下的神经信号变化。所有记录过程中，小鼠可在行为箱内自由活动。信号预处理阶段，以405 nm通道采集的背景信号对470 nm通道的总荧光信号进行校正，校正后的值作为 GCaMP6s的有效基线信号(F₀)。通过计算荧光信号变化率(ΔF/F₀ = (F - F₀)/F₀)的平均值，量化MO脑区的Drd2阳性神经元群体的整体激活水平。

1.10 化学遗传学调控

选取Drd2-Cre雄性小鼠随机分为3组：激活组、抑制组和对照组，每组8只。通过立体定向注射技术，分别在3组小鼠MO脑区注射AAV2/8-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry、AAV2/8-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry和AAV2/8-EF1a-DIO-mCherry病毒。所有病毒均含双loxP位点(DIO元件)，可与Drd2-Cre小鼠的Cre重组酶特异性结合实现对Drd2神经元的精准调控，注射完成后，将小鼠常规饲养3周，待病毒充分表达后开展后续实验。在测试当天，首先对3组小鼠的足底和眶周进行Von Frey测试，记录机械痛阈数据，作为基线值。基线测试后30 min，对所有小鼠腹腔注射0.5 mg/mL的NTG溶液构建偏头痛模型。注射NTG后15 min，对3组小鼠腹腔注射0.1 mg/mL的CNO溶液，给药剂量为2 mg/kg，通过CNO与hM3D (Gq)/hM4D (Gi)受体结合，分别激活或抑制Drd2阳性神经元。并在腹腔注射NTG后2 h再次进行Von Frey实验，记录模型期机械痛阈数据，用于后续组间差异分析。

1.11 旷场实验检测焦虑样行为

旷场实验(型号 XR-XZ301，上海欣软信息科技有限公司)用于检测小鼠的焦虑样行为。实验装置尺寸为30 cm×30 cm×30 cm，箱内光照强度为30勒克斯(lx)。于NTG注射后4 h，分别对对照组和模型组小鼠进行旷场测试：将小鼠置于旷场中央区域，朝向同一象限，使其自由探索10 min。实验主要观测指标为小鼠在中央区域停留的绝对时长及进入中心区域的次数；同时记录小鼠的平均运动速度，以此评估其运动能力。

1.12 统计学分析

采用 GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。实验图表采用GraphPad Prism 9.0软件进行初步绘制，后续通过Adobe Illustrator 2024软件进行版式优化与标准化处理。本研究所有实验数据均以\overline{x} ± s表示。多组间重复测量数据采用双因素重复测量方差分析，组间两两比较采用事后检验(Bonferroni校正)；3组及以上独立数据比较采用单因素方差分析；两组间数据比较采用双尾独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹腔注射硝酸甘油诱导小鼠产生痛觉过敏

基线期时，模型组与对照组小鼠的足底及眶周机械痛阈水平无显著差异(图1B，P＞0.05)，确保两组基线状态一致。给药后30 min，模型组小鼠足底痛阈呈现下降趋势，但与对照组相比未达到统计学差异(图1B，P＞0.05)；而眶周痛阈已较对照组降低(图1C，P＜0.05)。给药后2 h，模型组小鼠的痛觉过敏表现进一步加剧，足底与眶周机械痛阈均下降，且组间差异具有统计学意义(足底：图1B，P＜0.01；眶周：图1C，P＜0.05)。两组小鼠组内不同时间点的痛阈变化分析结果显示，对照组在3次测量中，足底及眶周机械痛阈始终维持稳定状态，未出现显著波动(图1D、1E，P＞0.05)；而模型组小鼠呈现典型的痛阈动态变化：足底痛阈在给药后30 min开始下降(图1F，P＜0.05)，给药后2 h降至更低水平(图1F，P＜0.01)；眶周痛阈在给药后30 min即出现下降(图1G，P＜0.01)，并于给药后2 h持续维持该下降水平(图1G，P＜0.01)。综上，通过腹腔注射NTG成功诱导小鼠产生了痛觉过敏。

2.2 腹腔注射硝酸甘油后小鼠产生焦虑样情绪

鉴于临床上偏头痛患者常伴随焦虑等负性情绪，本研究通过旷场实验检测2组小鼠的焦虑样行为。结果显示，与对照组相比，注射NTG的模型组小鼠在旷场中心区域的停留时间减少(图2A，P＜0.05)；而2组小鼠进入中心区域的次数及平均运动速度差异无统计学意义(图2B、图2C，P＞0.05)，排除了运动能力差异对实验结果的干扰。

2.3 偏头痛模型小鼠中MO脑区的Drd2阳性神经元活性下降

为了探究偏头痛模型小鼠MO脑区Drd2阳性神经元是否参与了偏头痛相关调控过程，本研究使用Drd2-Cre小鼠，通过立体定向注射技术将含双loxP位点(DIO元件)的钙成像病毒导入MO脑区。注射病毒等实验流程见图3A。病毒表达后对脑组织切片进行荧光成像验证，确认病毒在MO脑区定位准确且实现有效表达(图3B)。结果显示，与基线期相比，注射NTG后MO脑区Drd2阳性神经元的钙信号呈持续下降趋势(图3C)：在给药后30 ~ 40 min，钙信号强度与基线期相比出现统计学差异(图3D，P＜0.01)；至给药后90 ~ 100 min，钙信号降至最低水平，差异具有统计学意义(图3D，P＜0.001)，提示偏头痛模型状态下MO脑区Drd2阳性神经元活性下降。

2.4 化学遗传学抑制MO脑区Drd2阳性神经元后可以缓解痛觉过敏行为

为明确MO脑区Drd2阳性神经元活性变化与偏头痛伤害性感受的调控关系，本研究进一步通过化学遗传调控技术对该类神经元进行特异性调控。实验分组及流程见图4A。脑组织切片荧光成像验证了病毒注射位置准确且表达充分(图4B)。

机械痛阈检测结果显示，3组小鼠的基线痛阈差异无统计学意义(图4C、图4D，P＞0.05)。与空载对照组相比，化学遗传抑制组小鼠的足底机械痛阈升高，痛觉敏感性减弱(图4E，抑制组：P＜0.01)；而化学遗传激活组小鼠的足底痛阈与对照组差异无统计学意义(图4E，激活组：P＞0.05)。眶周机械痛阈变化趋势与足底一致：抑制组眶周痛阈较对照组升高(图4F，P＜0.001)，激活组与对照组差异无统计学意义(图4F，P＞0.05)。

2.5 化学遗传学抑制MO脑区Drd2阳性神经元后可以缓解焦虑样行为

为进一步验证调控该类神经元的作用，本研究对以上3组小鼠进行旷场实验，旷场轨迹见图5A。与空载对照组相比，化学遗传抑制组小鼠在中心区域出现的时间增加，而激活组则无显著变化(抑制组：P＜0.05；激活组：P＞0.05)。而3组小鼠的中心区域进入次数和平均运动速度均未发现差异(图5B、图5C，P＞0.05)。这个结果提示化学遗传学抑制该类神经元不仅可以改善注射NTG溶液带来的痛觉过敏，还可以改善小鼠的焦虑样情绪。

2.6 MO脑区Drd2阳性神经元的下游核团探索

为进一步深化MO脑区Drd2阳性神经元对偏头痛样痛觉过敏和焦虑样行为的功能调控作用，本研究利用Drd2-Cre小鼠和顺行示踪病毒对该类神经元可能发挥作用的下游核团进行探索(图6A)，对小鼠脑组织进行冠状面切片成像发现，注射位点准确且病毒有效表达(图6B)。在小鼠的前扣带皮层、基底外侧杏仁核、屏状核等脑区发现投射纤维。这些脑区作为疼痛、情绪调控和认知调控的关键脑区，提示MO脑区Drd2阳性神经元可能通过作用于以上脑区参与痛觉敏化和焦虑样行为的调控过程。

3 讨论

本研究通过腹腔注射硝酸甘油成功构建小鼠偏头痛模型，表现为足底和眶周机械痛阈下降及焦虑样行为的出现，提示该模型能够有效模拟偏头痛的痛觉过敏及情绪异常状态。在此基础上，采用在体光纤钙成像技术首次观察到MO脑区Drd2阳性神经元在偏头痛过程中的活性变化，发现其钙信号在NTG注射100 min内呈持续下降趋势。进一步的化学遗传学实验证明，抑制该类神经元可改善硝酸甘油注射诱导的痛觉过敏和焦虑样行为，而激活该类神经元未产生明显影响，提示MO脑区Drd2阳性神经元在偏头痛的中枢调控中发挥重要作用。

多巴胺系统在疼痛调制中的功能已得到广泛证实^[11]。急性疼痛可增强多巴胺释放，而慢性疼痛则可能导致DA系统耗竭、神经敏感性升高，从而加重疼痛体验^[7]。Drd2受体作为DA的重要下游介质，在疼痛调节中发挥关键作用^[12]。Hagelberg等^[13]研究发现，中脑DA系统的伏膈核脑区DA通过结合Drd2受体发挥镇痛作用。在偏头痛领域，既往认为DA系统和偏头痛患者的临床恶心呕吐症状有关，然而最近越来越多的分子生物学研究发现DA受体可能参与调节痛觉过敏。一项有关中医药的研究通过网络药理学分析，获得了白芷川芎药中28种生物活性化合物抗偏头痛作用相关的50个枢纽靶点，Drd2等G蛋白偶联受体信号通路参与了该治疗过程^[14]；此外，Zhang等^[15]研究表明，激活Drd2可抑制中枢致敏、改善慢性偏头痛动物模型的痛觉超敏状态。多巴胺Drd2通过PI3K信号通路调节含有GluA1的AMPA受体的转运和中枢致敏参与了大鼠慢性偏头痛的发病机制^[15]。该团队研究进一步发现GluA2内吞与活性氧生成形成正反馈环路，是慢性偏头痛的关键机制；D2R激活可阻断该环路，通过抑制GluA2内吞、减轻线粒体钙超载及氧化应激，缓解慢性偏头痛^[8]。然而，既往有关Drd2和偏头痛的分子研究多聚焦在脑干等区域，皮层尤其是和疼痛密切相关的中脑边缘系统相关的皮层环路研究相对较少，本课题组结合既往研究^[9]，选取MO脑区对Drd2受体阳性的神经元进行深入探索。

本研究发现偏头痛模型中MO脑区Drd2阳性神经元活性下降，而选择性抑制该类神经元可有效缓解痛觉过敏及焦虑样行为，提示该脑区可能在偏头痛的疼痛与情绪共病机制中发挥枢纽作用，从细胞群体水平进一步支持了MO区参与偏头痛相关异常行为的可能性。MO区作为眶额叶皮层的重要亚区，主要负责处理行为控制^[16]、认知功能(决策、学习和记忆等)^[17]和情绪调节^[18]等过程。OFC及其亚区在慢性疼痛和慢性偏头痛过程中具有潜在的重要作用，但这些证据主要来源于宏观影像学或电生理信号层面，对具体神经元类型在偏头痛中的功能尚未明确。例如，Shirvalkar等^[19]针对难治性慢性疼痛患者开展的植入式电生理研究中，在OFC部位记录到的局部场电位能够预测患者的慢性疼痛程度，提示该区域在疼痛体验的编码过程中具有重要调控作用。在偏头痛研究中，多项影像学分析揭示了该脑区的结构和功能异常，进一步支持了OFC脑区的功能异常可能参与偏头痛的病理机制^[20-21]。结合MO脑区在情绪调控中的作用，利用旷场实验检测了小鼠的焦虑样行为，焦虑样行为在慢性偏头痛模型中研究较为广泛，且该合并症状被认为可能参与偏头痛的慢性化进程^[22]。但临床数据显示，发作性偏头痛患者亦常合并焦虑症状^[23]。且有研究表明，这两种疼痛状态所诱导的焦虑样行为，其内在调控机制存在差异^[24]。结合本研究，提示MO脑区可能通过Drd2阳性神经元调控NTG注射诱导的痛觉过敏和焦虑共病症状。

Drd2作为G蛋白偶联受体，通过与DA结合减少下游通路环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)生成，进而降低神经元兴奋性^[25]。MO脑区接受来自中脑腹侧被盖区的DA能神经元投射，是中脑DA系统调控情绪与认知的重要节点^[26]。Moriya等^[27]报道，在急性伤害性刺激状态下，中脑DA能神经元被激活，分泌DA水平增加，提示DA-Drd2通路可能参与疼痛相关的皮层调控过程。在本研究中，在急性硝酸甘油刺激下Drd2阳性神经元的在体钙信号呈持续下降趋势，这可能是由于升高的DA和Drd2结合使cAMP生成减少，导致该类神经元在偏头痛状态下处于低活性水平，这和既往研究结论较为一致^[27]。当进一步通过化学遗传学手段抑制Drd2阳性神经元时，小鼠的痛觉过敏和焦虑样行为均得到改善，该现象也可能源于MO内复杂的神经元微环路调控，例如整合来自多种兴奋性或抑制性输入^[28]。值得注意的是，化学遗传学激活Drd2阳性神经元未能进一步改变偏头痛行为，这一结果可能存在以下潜在原因：首先，MO脑区内的Drd2阳性神经元存在亚型异质性，既包含谷氨酸能兴奋性神经元，也涵盖GABA能中间神经元^[10]。激活该脑区Drd2阳性神经元可能会因为亚型神经元之间的相互作用，导致痛觉调控作用不明显，这也是未来我们进一步研究的方向。其次，本研究采用的单次神经元调控策略可能不足以产生显著的行为干预效应，这可能和递质水平变化的累积效应有关^[29]，目前学界有观点认为疼痛或偏头痛慢性化和包括内侧眶额叶皮层在内的下行疼痛调节通路有关^[30]。后续研究可聚焦于mOFC内参与调控的具体神经元类型，并拓展至慢性偏头痛模型中开展神经元调控实验，以明确其在不同偏头痛病程中的作用机制。此外，也有可能是因为腹腔注射NTG后，小鼠机械痛阈已降至Von Frey纤维丝的检测下限，致使激活Drd2阳性神经元无法捕捉痛阈的进一步变化。

前扣带皮层是急慢性疼痛的关键调控脑区，其作用已在多种疼痛模型中得到验证^[22,31]。既往研究表明，神经病理性疼痛模型中，前扣带皮层与腹侧被盖区间的正反馈环路可介导疼痛慢性化及焦虑样行为的发生^[31]。基底外侧杏仁核在疼痛与情绪调控中的核心作用亦被多项研究证实^[32-33]。此外，屏状核的病理性活动在临床偏头痛患者及神经病理性疼痛小鼠模型中均存在^[34-35]。MO脑区Drd2阳性神经元与这些经典脑区的投射关系，既验证了其在痛觉敏化和负性情绪调控中的作用，也为我们的后续研究提供了新思路。

综上，本研究发现MO脑区Drd2阳性神经元在偏头痛的痛觉过敏及焦虑样行为中发挥重要作用，其活性下降是偏头痛行为异常的重要特征之一，而抑制该类神经元具有一定的改善效果。这一过程可能涉及中脑DA系统的协同参与，并通过下行调控系统发挥作用。本研究为偏头痛发病机制提供了新的神经环路靶点与理论依据，也为后续开发基于皮层多巴胺调节的临床偏头痛靶向干预策略提供了有益参考。

本研究存在以下局限性：首先，选取雄性小鼠构建偏头痛模型，这虽然排除了雌鼠生理周期和性激素对偏头痛发作的影响，但是也忽略了研究对性别差异机制的探索；其次，本研究并未深入验证Drd2下游信号分子(如cAMP、ERK)的表达变化，分子机制层面的证据仍需补充。后续研究可以通过光遗传、化学遗传技术进一步验证MO到下游脑区的偏头痛调控环路，并结合Western blot或免疫荧光技术检测Drd2下游信号分子的表达变化，从而完善分子机制链条。

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基金资助

国家自然科学基金(82171208)