胃癌在全球范围内发病率和死亡率均居前列，严重威胁患者生命健康[1]。尽管现有手术、化疗和靶向治疗等手段能延长患者生存期，但晚期胃癌患者的预后仍然较差，且现有治疗方法面临耐药性、严重不良反应等挑战[2-3]，精准治疗是重要的发展方向。HER2、VEGF等分子标志物与胃癌的发生和发展密切相关[4-5]。然而，由于肿瘤异质性、检测标准不统一、耐药性问题以及受益患者群体受限等因素，这些标志物在临床应用中仍面临不同程度的局限性，临床上迫切需要探索新的分子标志物和治疗靶点，以改善胃癌患者的预后。
CHEK1是细胞周期调控和DNA损伤修复关键基因[6]，在多种癌症中呈现异常表达，并与肿瘤的发生和发展密切相关[7]。在乳腺癌中，CHEK1的高表达通常与不良预后相关，而在结直肠癌中则表现出相反的趋势[8-9]，而CHEK1在胃癌中的具体作用机制及其与免疫微环境的关联尚未完全阐明。
本研究结合公共数据库分析与细胞实验，系统评估CHEK1在胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)中的表达特征及其与患者预后、相关通路和免疫浸润的关系，并通过体外功能实验验证CHEK1对胃癌细胞增殖、凋亡及DNA损伤反应的影响，旨在为CHEK1作为潜在生物标志物与治疗靶点提供依据。
1 材料与方法
1.1 数据来源
从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA；
https://portal.gdc.cancer.gov)数据库下载经STAR软件比对后的33种肿瘤及配对正常组织的RNA测序数据(采用转录本每千碱基每百万比对读数格式，transcripts per million，TPM)，统一进行log2(TPM+1)转换，并单独提取胃腺癌(TCGA-STAD)队列用于后续肿瘤-癌旁比较
[10-11]。
1.2 差异表达分析
采用R包ggplot2(版本3.4.4)、stats(版本4.2.1)及car(版本3.1-0)进行。对于33种癌症中肿瘤组织与正常组织的非配对差异比较，使用Wilcoxon秩和检验；在TCGA-STAD队列中，肿瘤与对应正常组织(癌旁组织)之间的配对样本差异采用配对t检验；对总体胃腺癌与正常组织非配对比较，使用Welch t检验。对于正常样本量过少或不满足统计前提假设的肿瘤类型，不进行相应统计检验，仅做描述性展示(样本量、表达范围等)。
为增强结果的稳健性，进一步使用TNMplot在线平台(
https://tnmplot.com/analysis)，基于基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)获取独立胃癌数据集
[12]，对CHEK1在肿瘤与正常组织中的表达差异进行了外部验证。验证流程与TCGA数据分析一致，结果用于支持TCGA来源的差异表达结论。所有统计检验均为双侧检验，显著性水平设定为
P值＜0.05。
1.3 总生存期预后分析
基于TCGA-STAD中的RNAseq数据TPM格式表达数据及其配套临床信息开展总生存期(overall survival，OS)分析。预后相关数据来源于Liu等[13]的研究。本次分析纳入标准包括：(1)具有完备的RNA测序TPM表达数据；(2)具有明确的随访时间及生存结局信息。排除标准包括：样本重复、关键临床资料(年龄、性别、肿瘤分期)缺失，以及随访时间为0的样本。
使用R软件中的survival包进行比例风险假设检验及生存回归模型拟合；利用survminer包中surv_cutpoint函数确定最佳表达分组截断值，将患者分为CHEK1高/低表达组。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，并通过Cox回归比较两组OS差异；相关结果进一步使用survminer包和ggplot2包进行可视化展示。
借助在线生存数据分析工具Kaplan-Meier Plotter(
https://kmplot.com/analysis/index.php p=home)对CHEK1表达水平与 STAD患者OS的关系进行外部验证
[14]，并进一步评估其与疾病首次进展生存期(first progression，FP)及进展后生存期(post-progression survival，PPS)之间的关联。
1.4 共表达及功能富集分析
基于TCGA-STAD项目的TPM格式表达数据及其对应的临床信息开展CHEK1相关基因的共表达分析。筛选具有完整临床随访信息的肿瘤样本，剔除正常组织、缺失关键临床资料的样本及重复样本。以CHEK1表达水平作为特征变量，与全基因组表达谱进行Spearman秩相关分析，计算相关系数(r)及P值。根据|r|排序，筛选共表达最显著的前20个基因，并使用R包ggplot2包(版本3.4.4)绘制共表达热图，展示其共表达趋势及相关强度。进一步采用“基因本体(gene ontology，GO)”和“京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)”进行功能富集分析，以探究共表达基因的潜在生物学功能和涉及的信号通路[15-16]。基于clusterProfiler等R包[17]，分别对与CHEK1表达相关性具有统计学差异的基因开展GO与KEGG通路富集分析。富集结果的P值采用Benjamini-Hochberg方法进行多重校正，并使用ggplot2包对最终分析结果进行可视化。
1.5 免疫微环境相关分析
基于TCGA-STAD转录组数据计算各免疫细胞亚群的浸润得分，以评估CHEK1表达与肿瘤免疫微环境的关系。利用基因集变异分析(gene set variation analysis，GSVA)R包(1.46.0版)中的单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)算法[18]。采用Immunity杂志中Bindea等发表的24种免疫细胞标志基因集[19]，包括树突状细胞(dendritic cell，DC)、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC，pDC)、CD8⁺ T细胞、辅助性T细胞(Th1、Th2、Th17)、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等，计算每个样本中对应免疫细胞亚群的浸润得分。
对CHEK1表达与免疫细胞浸润得分矩阵进行相关性分析，并使用ggplot2包绘制棒棒糖图(lollipop plot)进行可视化。根据CHEK1表达量的中位数，将STAD患者分为高/低表达组，采用stats包和car包对两组免疫细胞浸润得分差异进行比较。对于近似正态分布且方差齐性的变量，采用Welch t检验；对分布偏态或方差不齐的变量，采用Wilcoxon秩和检验；同时采用Spearman秩相关分析，计算CHEK1与各免疫细胞浸润得分之间的相关系数及其P值。通过ggplot2包绘制箱线图，展示多种免疫细胞浸润得分与CHEK1表达的相关性。
1.6 细胞系、质粒构建、主要试剂及仪器(下文可以根据这个小标题的顺序进行罗列)
细胞系培养条件：人胃癌细胞系AGS购自普诺赛(武汉)公司。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的RPMI-1640培养基中培养，并置于37℃、5% CO2的恒温培养箱(Jiemei Electronics，CI191C)中维持生长。每2天更换培养基。当细胞生长至对数生长期且融合度约达80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化并按常规进行传代。传代后的细胞用于后续转染、药物处理及功能实验。
质粒构建：CHEK1过表达质粒pcDNA3.1(+)与阴性对照质粒pLKO.1-scramble shRNA均由Thermo Fisher Scientific构建；用于CHEK1敲低的小干扰RNA(siRNA)及短发夹RNA(shRNA)由商业公司合成。细胞转染使用阳离子脂质体试剂(Lipofectamine™ 3000)。
主要试剂：RPMI-1640培养基(SH30027.01，HyClone)；胎牛血清(FBS，SH30396.02，HyClone)；青霉素-链霉素混合液(SV30010，HyClone)；TRIzol总RNA提取试剂(Invitrogen)；反转录试剂盒(Promega)；SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)；CCK-8细胞计数试剂盒(Dojindo)；CHEK1靶向shRNA慢病毒载体pLKO.1-TRC-puro-CHEK1及其阴性对照(scramble)载体(载体骨架及靶序列见构建方案)；pcDNA3.1(+)过表达载体及pcDNA3.1(+)-CHEK1重组质粒(由含有CHEK1全长编码序列的Insert片段无缝克隆至pcDNA3.1(+)载体)；Lipofectamine™ 3000转染试剂(Invitrogen)；嘌呤毒素(Puromycin)选择用抗生素(Sigma)；无菌PBS缓冲液等。
(1)实验所使用的主要抗体：CHEK1、磷酸化H2AX(γH2AX)、裂解PARP(cleaved PARP)、裂解型caspase-3(cleaved caspase-3)以及内参GAPDH的单克隆抗体。均购自国际主流抗体供应商。实时荧光定量PCR试剂盒、反转录试剂及BCA蛋白定量试剂盒均按厂家说明书使用。
(2)实验仪器：Ⅱ级生物安全柜、CO₂培养箱(Jiemei Electronics，CI191C)、倒置显微镜(OLYMPUS)、酶标仪(Bio-Rad，用于检测450 nm波长处OD值)、细胞凋亡检测试剂盒(赛默飞)、实时荧光定量PCR仪(Genesy 96T，西安天隆)、流式细胞仪(BD FACSCanto Ⅱ)、电泳仪(Bio-Rad PowerPac Basic)、稳压DNA电泳仪(EPS300，天能)、凝胶成像系统(JS-780D，培清科技)。
1.7 CHEK1过表达与敲低模型构建
将处于对数生长期的AGS细胞接种至培养皿中，待细胞融合度达到50% ~ 70%后，采用感染复数(multiplicity of infection，MOI)为20的慢病毒载体进行转导。病毒载体分别携带CHEK1靶向shRNA或阴性对照shRNA。感染24 h后，换用新鲜培养基，并加入嘌呤霉素进行筛选，获得CHEK1稳定敲低细胞株(shCHEK1)及相应的阴性对照组(shNC)。
为了构建CHEK1过表达模型，使用pcDNA3.1(+)-CHEK1质粒进行转染。将对数生长期的AGS细胞接种于6孔板中，待细胞融合度约60%时，使用LipofectaminetTM 3000转染试剂转染pcDNA3.1(+)-CHEK1质粒或空载体对照质粒，构建CHEK1过表达组(OE-CHEK1)和转染对照组(pcDNA3.1-NC)。
过表达体系在转染后48 ~ 72 h收集细胞；敲低体系在嘌呤霉素筛选获得稳定株后收集细胞，用于后续RT-PCR、Western blot和凋亡检测。每组实验均设3个重复孔，并独立行3次实验。后续实验除序列筛选实验外，各功能实验分组保持一致：敲低体系为“空白对照组+shNC组+shCHEK1组”；过表达体系为“空白对照组+pcDNA3.1-NC组+ OE-CHEK1组”。
1.8 RT-PCR检测CHEK1mRNA表达量
从各组AGS细胞中使用Invitrogen公司的TRIzol试剂提取总RNA，并以随机六聚体引物和逆转录酶Ⅱ型(Promega)合成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)以及特异性引物针对CHEK1和GAPDH进行扩增反应。在ABI PRISM 7300 RT-PCR平台上进行RT-PCR扩增。GAPDH mRNA作为内参，用于数据归一化。
分别设置空白组、转染对照组(pcDNA3.1-NC)、敲低对照组(shNC)、CHEK1敲低组(shCHEK)和CHEK1过表达组(OE-CHEK1)。通过比较敲低体系和过表达体系的Ct值，采用2^-ΔΔCt法计算CHEK1相对表达量，以评估敲低转导和过表达转染的效率。
1.9 CCK-8检测细胞活力变化
采用CCK-8法检测不同处理组AGS细胞的增殖活力变化。将对数生长期的AGS细胞按5×103/孔的密度接种于96孔板中，分为CHEK1过表达组(OE-CHEK1)、过表达对照组(pcDNA3.1-NC)、CHEK1敲低组(shCHEK1)及敲低对照组(shNC)，每组设5个复孔。细胞在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24 h，使其充分贴壁。
在0、24、48、72 h和96 h时间点，每孔加入10 μL CCK-8试剂，轻轻振荡混匀后，继续在37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h。孵育结束后，使用酶标仪在450 nm波长处测量各孔的吸光度(OD)值，并扣除无细胞空白孔OD值进行背景校正。以各时间点校正后的OD值反映细胞活力，绘制各组细胞增殖曲线，并比较不同处理组之间细胞增殖能力的差异。所有实验独立重复3次。以保证结果的可靠性和重复性。
1.10 Western blot检测CHEK1及相关蛋白表达水平
转染48 ~ 72 h后收集各组细胞，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行细胞裂解，并在冰上孵育30 min。随后，离心收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行10% ~ 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。
转膜后，使用5%脱脂奶粉封闭膜1 h后，然后将膜在4℃孵育一抗抗体过夜(CHEK1、γH2AX、cleaved PARP、cleaved caspase-3及GAPDH)。第二天，用TBST洗涤膜后，加入稀释后的二抗(稀释比例为1∶5 000)，在室温下孵育1 h。再次洗涤膜后，使用TBST缓冲液清洗膜10 min，重复3次，显色后于成像系统上获取条带图像。
利用图像分析软件，计算目的条带与GAPDH条带的相对灰度值，从而评估蛋白的相对表达水平。
1.11 流式细胞术检测细胞凋亡情况
采用Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染试剂盒检测细胞凋亡。转染48 h后，收集细胞并用PBS清洗。随后使用不含EDTA的胰蛋白酶轻柔消化细胞，离心收集后并重悬于结合缓冲液中。按照试剂盒说明书，依次加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育10 ~ 15 min后立即上机检测。
利用流式细胞仪采集至少1×104个细胞事件，并使用FlowJo等软件进行分析。根据荧光信号区分早期凋亡细胞(Annexin V⁺/PI⁻)和晚期凋亡细胞(Annexin V⁺/PI⁺)，并计算总凋亡率(早期凋亡率与晚期凋亡率之和)。
1.12 统计学处理
所有统计分析均使用R(4.2.1版)或GraphPad Prism等统计软件中进行。体外实验所得的计量资料以均值±标准差(x̄±s)表示，两组间比较选择使用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。相关分析采用Spearman秩相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。所有细胞学实验均至少独立重复3次，以保证实验结果的可靠性和可重复性。
2 结果
2.1 CHEK1在肿瘤中的潜在作用
本研究通过引用人类CHEK1的mRNA(NM_001114121.2)和蛋白质(XP_011540862.1)序列，分析了CHEK1在肿瘤发生和进展中的潜在作用。通过分析TCGA中的数据，评估CHEK1在多种癌症类型的表达谱。结果表明，CHEK1在多个癌症类型中的表达均高于正常组织，差异具有统计学意义(
P＜0.05)，特别是在膀胱尿道上皮癌、乳腺浸润性癌、胆管癌、结肠腺癌、食管癌、头颈鳞癌、肝细胞癌、肺腺癌、直肠腺癌、肺鳞癌、胃腺癌和子宫内膜癌中表达水平较高。见
图1A。
CHEK1的mRNA表达水平在胃癌组织中高于正常胃黏膜组织(
图1B、
图1C)，差异有统计学意义(
P＜0.05)。同样，利用GEO数据库进行的差异表达分析验证了这一结果，进一步表明胃癌组织中CHEK1 mRNA表达水平较正常胃黏膜组织升高，且差异有统计学意义(
P＜0.001)(
图1D)。
2.2 CHEK1与生存期的关系
在胃癌患者中，CHEK1高表达组的OS和PPS均明显长于低表达患者(
P＜0.05)，而对于复发前生存期，CHEK1的高表达与低表达组之间并未观察到统计学差异(
P＞0.05)。TCGA-STAD队列中，观察到CHEK1高表达组(n=243)的OS长于低表达组(n=127)(
HR=0.69，95%
CI：0.49 ~ 0.96，
图2A)。在Kaplan-Meier Plotter数据库中，根据CHEK1的表达水平(cut value=203)将患者分为高表达组和低表达组。结果显示高表达组(n=375)的OS长于低表达组(n=499)(
HR=0.74，95%
CI：0.62 ~ 0.88)；高表达组(n=263)的PPS亦长于低表达组(n=235)(
HR=0.64，95%
CI：0.51 ~ 0.80)，差异均具有统计学意义(
图2B、
图2D)。而对于FP，高表达组(n=319)与低表达组(n=321)之间并未观察到统计学差异(
HR=0.86，95%
CI：0.70 ~ 1.05，
图2C)。
上述结果表明，CHEK1的表达水平可能作为胃癌患者预后风险的潜在预测指标。具体而言，高表达的CHEK1可能预示着胃癌患者具有较好的预后，尤其是在疾病进展后的生存期。
2.3 CHEK1共表达及功能富集分析
基于TCGA-STAD RNA测序数据及相应的临床数据，本研究开展了CHEK1相关基因的共表达及功能富集分析。首先，筛选具完整临床随访信息的肿瘤样本(剔除正常组织及资料缺失样本)。对基因表达值进行转换后，以CHEK1为主变量，通过Spearman秩相关分析全基因组表达谱进行分析。根据r值排序，筛选出前20个核心共表达基因，见
图3A。其次，利用基因本体富集GO分析对这些共表达基因进行功能注释，结果显示，这些基因主要与细胞分裂周期中的姐妹染色单体分离过程相关。第三，KEGG通路富集分析，进一步揭示相关共表达基因主要集中在细胞周期相关通路，以及细胞的成熟与分裂、衰老等生物学过程，见
图3B、
图3C。
2.4 CHEK1与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的相关性
CHEK1的高表达与免疫抑制性肿瘤微环境相关。为探讨CHEK1与免疫细胞浸润之间的关系，我们采用了ssGSEA算法对CHEK1表达和免疫浸润矩阵数据进行相关性分析。在24种癌症中，发现CHEK1的表达与免疫细胞浸润之间存在相关性，具有统计学意义(
P＜0.05，
图4A、
图4D)。CHEK1表达与Th细胞浸润，尤其是Th2细胞、激活的树突状细胞(activated dendritic cell，aDC)正相关(
P＜0.05)，而与其他类型免疫细胞[如pDC、肥大细胞、NK细胞、B细胞、滤泡型Th细胞(follicular helper T cell，TFH)、未成熟树突状细胞(immature dendritic cell，iDC)、CD8⁺ 细胞、效应记忆T细胞(effector memory T cell，Tem)、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、Th17细胞、细胞毒细胞]浸润之间则存在负相关(
P＜0.05)。进一步聚焦于肿瘤细胞杀伤过程中的关键的免疫细胞CD8
+ T细胞和DC细胞，分析结果显示，CHEK1的高表达与CD8
+ 细胞及DC细胞呈明显的负相关性(
图4B、
图4C)。这一发现表明，CHEK1的高表达可能与免疫抑制性肿瘤微环境的形成有关，并会影响抗肿瘤免疫反应，进而影响免疫治疗效果。
2.5 构建敲低CHEK1胃癌细胞系
通过RT-PCR和Western blot法检测转染敲降载体病毒及过表达质粒的胃癌细胞中CHEK1的表达效率。以正常培养的胃癌细胞及转染空载体病毒、空载体质粒的胃癌细胞为对照，选择转染效率最高的细胞作为转染组。RT-PCR结果显示，转染组CHEK1 mRNA表达水平低于对照组，具有统计学差异(
P＜0.001)(
图5A、
图5B)；Western blot结果也表明，转染组CHEK1蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学差异(
P＜0.001)。这些结果表明，已成功建立稳定敲降CHEK1的细胞系。
2.6 CHEK1促进胃癌细胞系增殖并抑制凋亡
为进一步探讨CHEK1在胃癌细胞凋亡中的作用，我们利用流式细胞仪检测细胞凋亡。将处于对数生长期的AGS细胞分为CHEK1敲低组、CHEK1敲低对照组、CHEK1过表达组、CHEK1过表达对照组。采用Annexin V-FITC/PI双染法，通过流式细胞仪检测CHEK1对胃癌细胞凋亡的影响。实验结果显示，CHEK1敲低组的凋亡率为(39.28±3.40)%，CHEK1敲低对照组为(7.86±1.36)%，差异有统计学意义(
P＜0.001)；CHEK1过表达组的凋亡率为(3.89±0.34)%，CHEK1过表达对照组为(9.09±0.82)%，差异也有统计学意义(
P＜0.001)。上述结果提示，CHEK1的高表达可能通过调节细胞有丝分裂进程抑制胃癌细胞的凋亡(
图6)。
2.7 CCK-8检测细胞活性
采用CCK-8实验检测CHEK1对胃癌细胞增殖的影响。结果表明，培养24 h后，各组间增殖能力差异无统计学意义(
P＞0.90)；在48、72、96 h时，CHEK1敲低组的增殖能力低于对照组，CHEK1过表达组的增殖能力高于对照组，差异亦有统计学意义(
P＜0.001)(
图5C、
图5D)。结果提示，CHEK1的表达水平与胃癌细胞的增殖能力呈正相关。
2.8 CHEK1参与细胞的DNA损伤修复通路
Western blot分析(
图7)揭示了CHEK1的表达水平与相关蛋白的表达情况。在CHEK1过表达组中，γH2AX、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3条带在对照组中更为明显，量化分析结果差异有统计学意义，表明CHEK1过表达促进了DNA损伤修复并抑制了细胞凋亡。在CHEK1敲低组中，γH2AX、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表达水平较敲低对照组升高，差异具有统计学意义(
P＜0.001)，表明CHEK1敲低导致DNA损伤修复受阻并且促进了细胞凋亡。这进一步表明，CHEK1可能通过调控细胞的DNA损伤修复机制来维持细胞的生存，并且可能在肿瘤细胞的耐药性和细胞存活中发挥重要作用。
3 讨论
CHEK1是细胞周期检查点及DNA损伤修复通路中的关键调控因子，其异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关[20-21]。本研究通过泛癌分析及多数据库验证发现，CHEK1在包括胃癌在内的多种肿瘤中表达上调，并在胃腺癌组织中较正常组织显著升高[22]；生存分析结果进一步显示，CHEK1高表达与胃癌患者更长的OS和PPS相关，而对FP的影响未见显著差异；结合功能富集及免疫相关分析结果，提示CHEK1可能通过参与细胞周期调控并影响免疫微环境，在胃癌发生与进展过程中发挥作用。进一步的体外功能实验结果显示，干预CHEK1表达可显著影响胃癌细胞的增殖活性和凋亡水平，CCK-8、凋亡分析及Western blot结果相互印证，从细胞学层面对上述生物信息学推断提供了支持[23]。
在CHEK1与胃腺癌的预后相关分析中，CHEK1的高表达与胃癌患者较长的OS及PPS相关联，这一现象不同于乳腺癌等其他癌种[7,24-25]。同时，也有相关研究通过多数据库系统分析CHEK1在多种实体瘤中的表达，得出类似的结论：在胃癌(以及结直肠癌)中，降低的CHEK1 mRNA表达是一个不良预后因素，即CHEK1表达低的患者生存更差[9]。对此现象的解释，通过参考Mateusz K的研究结果，我们认为胃癌细胞对ATR-CHEK1通路表现出一种称为“分子脆弱性(molecular vulnerability)”的高度依赖，但其具体机制及其与肿瘤异质性、免疫状态之间的关系，尚未完全阐明[23]。为明确CHEK1与胃癌预后之间的特殊关
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