CHEK1在胃癌进展中的作用及机制研究

Role and mechanisms of CHEK1 in gastric cancer progression

摘要

背景 胃癌是全球高发且预后不良的恶性肿瘤，亟需研究新型分子标志物和治疗靶点。CHEK1作为细胞周期调控关键基因，其在胃癌中的作用尚未完全阐明。 目的 系统解析CHEK1在胃癌中的表达特征、预后价值及其通过细胞周期与免疫微环境调控促进肿瘤进展的机制。 方法 基于TCGA与GEO转录组数据开展泛癌及胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)肿瘤-正常差异表达分析；采用Kaplan-Meier生存曲线评估CHEK1表达与生存预后的关系；基于ssGSEA计算24类免疫细胞浸润得分分析CHEK1表达与不同类型免疫细胞浸润水平的相关性；在TCGA-STAD队列构建CHEK1共表达网络并进行GO/KEGG功能富集分析。体外在AGS细胞中构建CHEK1敲低与过表达模型，分别通过CCK-8检测细胞增殖活力、流式细胞术检测细胞凋亡，并以Western blot检测凋亡相关蛋白变化，用于功能与机制验证。 结果 CHEK1在STAD等12种肿瘤中高表达(P＜0.05)，胃癌肿瘤组织较配对癌旁组织升高，且高表达与患者较好总生存与进展后生存相关(P＜0.05)。共表达与功能富集分析提示，CHEK1相关基因富集于细胞周期等通路，并与多种DNA损伤修复相关基因表达呈显著相关性(P＜0.05)。免疫浸润分析表明，CHEK1高表达与Th2细胞浸润得分正相关，与CD8⁺ T细胞和树突细胞浸润得分负相关(P均＜0.01)。体外敲低CHEK1可抑制AGS细胞增殖(降低42%，P＜0.01)，提高凋亡率(39.28% vs 7.86%，P＜0.001)，并上调γH2AX表达(P＜0.05)；而CHEK1过表达可降低cleaved PARP和caspase-3水平(P＜0.001)，抑制细胞凋亡。 结论 CHEK1在胃癌中通过“细胞周期调控-免疫微环境重塑”双重机制促进肿瘤进展，其高表达提示预后相对较好。

Abstract

Background Gastric cancer is a common malignancy worldwide with poor prognosis, and there is an urgent need to find novel molecular biomarkers and therapeutic targets. Checkpoint kinase 1 (CHEK1), a key regulator of the cell cycle, has not been fully characterized in gastric cancer. Objective To systematically characterize the expression pattern, prognostic value, and mechanistic role of CHEK1 in gastric cancer, with a focus on cell-cycle regulation and remodeling of the tumor immune microenvironment. Methods Pan-cancer and paired stomach adenocarcinoma (STAD) tumor-normal analyses using TCGA and GEO datasets were performed to evaluate CHEK1 expression and its associations with overall survival and immune cell infiltration. SsGSEA was applied to calculate infiltration scores of 24 immune cell types and to analyze the correlations between CHEK1 expression and the infiltration levels of different immune cell subsets. Co-expression network construction and functional enrichment analyses were conducted to identify CHEK1-related signaling pathways. In vitro, CHEK1 knockdown and overexpression models were established in AGS cells. Cell proliferative activity was assessed by CCK-8 assay. Apoptosis was measured by flow cytometry, and apoptosis-related proteins alterations were examined by western blotting, thereby providing functional and mechanistic validation. Results CHEK1 was overexpressed in STAD and 11 other cancer types (P＜0.05). In STAD, CHEK1 expression was significantly higher in tumor tissues than in paired adjacent normal tissues, and high CHEK1 expression was associated with more favorable overall survival and post-progression survival (P＜0.05). Co-expression and functional enrichment analyses indicated that CHEK1-associated genes were enriched in cell cycle-related pathways and were significantly correlated with multiple DNA damage repair-related genes (P＜0.05). Immune infiltration analysis showed that CHEK1 expression was positively correlated with the Th2 cell infiltration score and negatively correlated with the infiltration scores of CD8⁺ T cells and dendritic cells (all P＜0.01). In vitro, CHEK1 knockdown inhibited AGS cell proliferation (reduced by 42%, P＜0.01), increased apoptosis (39.28% vs 7.86%, P＜0.001), and upregulated γH2AX (P＜0.05), whereas CHEK1 overexpression decreased cleaved PARP and caspase-3 levels (P＜0.001), thereby suppressing apoptosis. Conclusion CHEK1 promotes gastric cancer progression through a dual mechanism involving cell-cycle dysregulation and remodeling of the immunosuppressive tumor microenvironment. High CHEK1 expression predicts better prognosis and supports CHEK1 as a promising prognostic biomarker and therapeutic target, particularly in the context of combination strategies with immune checkpoint inhibitors.

Graphical abstract

关键词

检查点激酶1(CHEK1) / 胃肿瘤 / 腺癌 / 生物信息学 / 肿瘤微环境 / 细胞周期

Key words

CHEK1 / gastric adenocarcinoma / bioinformatics / immune microenvironment / cell cycle

胃癌在全球范围内发病率和死亡率均居前列，严重威胁患者生命健康^[1]。尽管现有手术、化疗和靶向治疗等手段能延长患者生存期，但晚期胃癌患者的预后仍然较差，且现有治疗方法面临耐药性、严重不良反应等挑战^[2-3]，精准治疗是重要的发展方向。HER2、VEGF等分子标志物与胃癌的发生和发展密切相关^[4-5]。然而，由于肿瘤异质性、检测标准不统一、耐药性问题以及受益患者群体受限等因素，这些标志物在临床应用中仍面临不同程度的局限性，临床上迫切需要探索新的分子标志物和治疗靶点，以改善胃癌患者的预后。

CHEK1是细胞周期调控和DNA损伤修复关键基因^[6]，在多种癌症中呈现异常表达，并与肿瘤的发生和发展密切相关^[7]。在乳腺癌中，CHEK1的高表达通常与不良预后相关，而在结直肠癌中则表现出相反的趋势^[8-9]，而CHEK1在胃癌中的具体作用机制及其与免疫微环境的关联尚未完全阐明。

本研究结合公共数据库分析与细胞实验，系统评估CHEK1在胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)中的表达特征及其与患者预后、相关通路和免疫浸润的关系，并通过体外功能实验验证CHEK1对胃癌细胞增殖、凋亡及DNA损伤反应的影响，旨在为CHEK1作为潜在生物标志物与治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA；https://portal.gdc.cancer.gov)数据库下载经STAR软件比对后的33种肿瘤及配对正常组织的RNA测序数据(采用转录本每千碱基每百万比对读数格式，transcripts per million，TPM)，统一进行log2(TPM+1)转换，并单独提取胃腺癌(TCGA-STAD)队列用于后续肿瘤-癌旁比较^[10-11]。

1.2 差异表达分析

采用R包ggplot2(版本3.4.4)、stats(版本4.2.1)及car(版本3.1-0)进行。对于33种癌症中肿瘤组织与正常组织的非配对差异比较，使用Wilcoxon秩和检验；在TCGA-STAD队列中，肿瘤与对应正常组织(癌旁组织)之间的配对样本差异采用配对t检验；对总体胃腺癌与正常组织非配对比较，使用Welch t检验。对于正常样本量过少或不满足统计前提假设的肿瘤类型，不进行相应统计检验，仅做描述性展示(样本量、表达范围等)。

为增强结果的稳健性，进一步使用TNMplot在线平台(https://tnmplot.com/analysis)，基于基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)获取独立胃癌数据集^[12]，对CHEK1在肿瘤与正常组织中的表达差异进行了外部验证。验证流程与TCGA数据分析一致，结果用于支持TCGA来源的差异表达结论。所有统计检验均为双侧检验，显著性水平设定为P值＜0.05。

1.3 总生存期预后分析

基于TCGA-STAD中的RNAseq数据TPM格式表达数据及其配套临床信息开展总生存期(overall survival，OS)分析。预后相关数据来源于Liu等^[13]的研究。本次分析纳入标准包括：(1)具有完备的RNA测序TPM表达数据；(2)具有明确的随访时间及生存结局信息。排除标准包括：样本重复、关键临床资料(年龄、性别、肿瘤分期)缺失，以及随访时间为0的样本。

使用R软件中的survival包进行比例风险假设检验及生存回归模型拟合；利用survminer包中surv_cutpoint函数确定最佳表达分组截断值，将患者分为CHEK1高/低表达组。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，并通过Cox回归比较两组OS差异；相关结果进一步使用survminer包和ggplot2包进行可视化展示。

借助在线生存数据分析工具Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/index.php p=home)对CHEK1表达水平与 STAD患者OS的关系进行外部验证^[14]，并进一步评估其与疾病首次进展生存期(first progression，FP)及进展后生存期(post-progression survival，PPS)之间的关联。

1.4 共表达及功能富集分析

基于TCGA-STAD项目的TPM格式表达数据及其对应的临床信息开展CHEK1相关基因的共表达分析。筛选具有完整临床随访信息的肿瘤样本，剔除正常组织、缺失关键临床资料的样本及重复样本。以CHEK1表达水平作为特征变量，与全基因组表达谱进行Spearman秩相关分析，计算相关系数(r)及P值。根据|r|排序，筛选共表达最显著的前20个基因，并使用R包ggplot2包(版本3.4.4)绘制共表达热图，展示其共表达趋势及相关强度。进一步采用“基因本体(gene ontology，GO)”和“京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)”进行功能富集分析，以探究共表达基因的潜在生物学功能和涉及的信号通路^[15-16]。基于clusterProfiler等R包^[17]，分别对与CHEK1表达相关性具有统计学差异的基因开展GO与KEGG通路富集分析。富集结果的P值采用Benjamini-Hochberg方法进行多重校正，并使用ggplot2包对最终分析结果进行可视化。

1.5 免疫微环境相关分析

基于TCGA-STAD转录组数据计算各免疫细胞亚群的浸润得分，以评估CHEK1表达与肿瘤免疫微环境的关系。利用基因集变异分析(gene set variation analysis，GSVA)R包(1.46.0版)中的单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)算法^[18]。采用Immunity杂志中Bindea等发表的24种免疫细胞标志基因集^[19]，包括树突状细胞(dendritic cell，DC)、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC，pDC)、CD8⁺ T细胞、辅助性T细胞(Th1、Th2、Th17)、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等，计算每个样本中对应免疫细胞亚群的浸润得分。

对CHEK1表达与免疫细胞浸润得分矩阵进行相关性分析，并使用ggplot2包绘制棒棒糖图(lollipop plot)进行可视化。根据CHEK1表达量的中位数，将STAD患者分为高/低表达组，采用stats包和car包对两组免疫细胞浸润得分差异进行比较。对于近似正态分布且方差齐性的变量，采用Welch t检验；对分布偏态或方差不齐的变量，采用Wilcoxon秩和检验；同时采用Spearman秩相关分析，计算CHEK1与各免疫细胞浸润得分之间的相关系数及其P值。通过ggplot2包绘制箱线图，展示多种免疫细胞浸润得分与CHEK1表达的相关性。

1.6 细胞系、质粒构建、主要试剂及仪器(下文可以根据这个小标题的顺序进行罗列)

细胞系培养条件：人胃癌细胞系AGS购自普诺赛(武汉)公司。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的RPMI-1640培养基中培养，并置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱(Jiemei Electronics，CI191C)中维持生长。每2天更换培养基。当细胞生长至对数生长期且融合度约达80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化并按常规进行传代。传代后的细胞用于后续转染、药物处理及功能实验。

质粒构建：CHEK1过表达质粒pcDNA3.1(+)与阴性对照质粒pLKO.1-scramble shRNA均由Thermo Fisher Scientific构建；用于CHEK1敲低的小干扰RNA(siRNA)及短发夹RNA(shRNA)由商业公司合成。细胞转染使用阳离子脂质体试剂(Lipofectamine™ 3000)。

主要试剂：RPMI-1640培养基(SH30027.01，HyClone)；胎牛血清(FBS，SH30396.02，HyClone)；青霉素-链霉素混合液(SV30010，HyClone)；TRIzol总RNA提取试剂(Invitrogen)；反转录试剂盒(Promega)；SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)；CCK-8细胞计数试剂盒(Dojindo)；CHEK1靶向shRNA慢病毒载体pLKO.1-TRC-puro-CHEK1及其阴性对照(scramble)载体(载体骨架及靶序列见构建方案)；pcDNA3.1(+)过表达载体及pcDNA3.1(+)-CHEK1重组质粒(由含有CHEK1全长编码序列的Insert片段无缝克隆至pcDNA3.1(+)载体)；Lipofectamine™ 3000转染试剂(Invitrogen)；嘌呤毒素(Puromycin)选择用抗生素(Sigma)；无菌PBS缓冲液等。

(1)实验所使用的主要抗体：CHEK1、磷酸化H2AX(γH2AX)、裂解PARP(cleaved PARP)、裂解型caspase-3(cleaved caspase-3)以及内参GAPDH的单克隆抗体。均购自国际主流抗体供应商。实时荧光定量PCR试剂盒、反转录试剂及BCA蛋白定量试剂盒均按厂家说明书使用。

(2)实验仪器：Ⅱ级生物安全柜、CO₂培养箱(Jiemei Electronics，CI191C)、倒置显微镜(OLYMPUS)、酶标仪(Bio-Rad，用于检测450 nm波长处OD值)、细胞凋亡检测试剂盒(赛默飞)、实时荧光定量PCR仪(Genesy 96T，西安天隆)、流式细胞仪(BD FACSCanto Ⅱ)、电泳仪(Bio-Rad PowerPac Basic)、稳压DNA电泳仪(EPS300，天能)、凝胶成像系统(JS-780D，培清科技)。

1.7 CHEK1过表达与敲低模型构建

将处于对数生长期的AGS细胞接种至培养皿中，待细胞融合度达到50% ~ 70%后，采用感染复数(multiplicity of infection，MOI)为20的慢病毒载体进行转导。病毒载体分别携带CHEK1靶向shRNA或阴性对照shRNA。感染24 h后，换用新鲜培养基，并加入嘌呤霉素进行筛选，获得CHEK1稳定敲低细胞株(shCHEK1)及相应的阴性对照组(shNC)。

为了构建CHEK1过表达模型，使用pcDNA3.1(+)-CHEK1质粒进行转染。将对数生长期的AGS细胞接种于6孔板中，待细胞融合度约60%时，使用Lipofectaminet^TM 3000转染试剂转染pcDNA3.1(+)-CHEK1质粒或空载体对照质粒，构建CHEK1过表达组(OE-CHEK1)和转染对照组(pcDNA3.1-NC)。

过表达体系在转染后48 ~ 72 h收集细胞；敲低体系在嘌呤霉素筛选获得稳定株后收集细胞，用于后续RT-PCR、Western blot和凋亡检测。每组实验均设3个重复孔，并独立行3次实验。后续实验除序列筛选实验外，各功能实验分组保持一致：敲低体系为“空白对照组+shNC组+shCHEK1组”；过表达体系为“空白对照组+pcDNA3.1-NC组+ OE-CHEK1组”。

1.8 RT-PCR检测CHEK1mRNA表达量

从各组AGS细胞中使用Invitrogen公司的TRIzol试剂提取总RNA，并以随机六聚体引物和逆转录酶Ⅱ型(Promega)合成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)以及特异性引物针对CHEK1和GAPDH进行扩增反应。在ABI PRISM 7300 RT-PCR平台上进行RT-PCR扩增。GAPDH mRNA作为内参，用于数据归一化。

分别设置空白组、转染对照组(pcDNA3.1-NC)、敲低对照组(shNC)、CHEK1敲低组(shCHEK)和CHEK1过表达组(OE-CHEK1)。通过比较敲低体系和过表达体系的Ct值，采用2^-ΔΔCt法计算CHEK1相对表达量，以评估敲低转导和过表达转染的效率。

1.9 CCK-8检测细胞活力变化

采用CCK-8法检测不同处理组AGS细胞的增殖活力变化。将对数生长期的AGS细胞按5×10³/孔的密度接种于96孔板中，分为CHEK1过表达组(OE-CHEK1)、过表达对照组(pcDNA3.1-NC)、CHEK1敲低组(shCHEK1)及敲低对照组(shNC)，每组设5个复孔。细胞在37℃、5% CO₂的培养箱中孵育24 h，使其充分贴壁。

在0、24、48、72 h和96 h时间点，每孔加入10 μL CCK-8试剂，轻轻振荡混匀后，继续在37℃、5% CO₂培养箱中孵育2 h。孵育结束后，使用酶标仪在450 nm波长处测量各孔的吸光度(OD)值，并扣除无细胞空白孔OD值进行背景校正。以各时间点校正后的OD值反映细胞活力，绘制各组细胞增殖曲线，并比较不同处理组之间细胞增殖能力的差异。所有实验独立重复3次。以保证结果的可靠性和重复性。

1.10 Western blot检测CHEK1及相关蛋白表达水平

转染48 ~ 72 h后收集各组细胞，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行细胞裂解，并在冰上孵育30 min。随后，离心收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行10% ~ 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。

转膜后，使用5%脱脂奶粉封闭膜1 h后，然后将膜在4℃孵育一抗抗体过夜(CHEK1、γH2AX、cleaved PARP、cleaved caspase-3及GAPDH)。第二天，用TBST洗涤膜后，加入稀释后的二抗(稀释比例为1∶5 000)，在室温下孵育1 h。再次洗涤膜后，使用TBST缓冲液清洗膜10 min，重复3次，显色后于成像系统上获取条带图像。

利用图像分析软件，计算目的条带与GAPDH条带的相对灰度值，从而评估蛋白的相对表达水平。

1.11 流式细胞术检测细胞凋亡情况

采用Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染试剂盒检测细胞凋亡。转染48 h后，收集细胞并用PBS清洗。随后使用不含EDTA的胰蛋白酶轻柔消化细胞，离心收集后并重悬于结合缓冲液中。按照试剂盒说明书，依次加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育10 ~ 15 min后立即上机检测。

利用流式细胞仪采集至少1×10⁴个细胞事件，并使用FlowJo等软件进行分析。根据荧光信号区分早期凋亡细胞(Annexin V⁺/PI⁻)和晚期凋亡细胞(Annexin V⁺/PI⁺)，并计算总凋亡率(早期凋亡率与晚期凋亡率之和)。

1.12 统计学处理

所有统计分析均使用R(4.2.1版)或GraphPad Prism等统计软件中进行。体外实验所得的计量资料以均值±标准差(x̄±s)表示，两组间比较选择使用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。相关分析采用Spearman秩相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。所有细胞学实验均至少独立重复3次，以保证实验结果的可靠性和可重复性。

2 结果

2.1 CHEK1在肿瘤中的潜在作用

本研究通过引用人类CHEK1的mRNA(NM_001114121.2)和蛋白质(XP_011540862.1)序列，分析了CHEK1在肿瘤发生和进展中的潜在作用。通过分析TCGA中的数据，评估CHEK1在多种癌症类型的表达谱。结果表明，CHEK1在多个癌症类型中的表达均高于正常组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)，特别是在膀胱尿道上皮癌、乳腺浸润性癌、胆管癌、结肠腺癌、食管癌、头颈鳞癌、肝细胞癌、肺腺癌、直肠腺癌、肺鳞癌、胃腺癌和子宫内膜癌中表达水平较高。见图1A。

CHEK1的mRNA表达水平在胃癌组织中高于正常胃黏膜组织(图1B、图1C)，差异有统计学意义(P＜0.05)。同样，利用GEO数据库进行的差异表达分析验证了这一结果，进一步表明胃癌组织中CHEK1 mRNA表达水平较正常胃黏膜组织升高，且差异有统计学意义(P＜0.001)(图1D)。

2.2 CHEK1与生存期的关系

在胃癌患者中，CHEK1高表达组的OS和PPS均明显长于低表达患者(P＜0.05)，而对于复发前生存期，CHEK1的高表达与低表达组之间并未观察到统计学差异(P＞0.05)。TCGA-STAD队列中，观察到CHEK1高表达组(n=243)的OS长于低表达组(n=127)(HR=0.69，95% CI：0.49 ~ 0.96，图2A)。在Kaplan-Meier Plotter数据库中，根据CHEK1的表达水平(cut value=203)将患者分为高表达组和低表达组。结果显示高表达组(n=375)的OS长于低表达组(n=499)(HR=0.74，95% CI：0.62 ~ 0.88)；高表达组(n=263)的PPS亦长于低表达组(n=235)(HR=0.64，95% CI：0.51 ~ 0.80)，差异均具有统计学意义(图2B、图2D)。而对于FP，高表达组(n=319)与低表达组(n=321)之间并未观察到统计学差异(HR=0.86，95% CI：0.70 ~ 1.05，图2C)。

上述结果表明，CHEK1的表达水平可能作为胃癌患者预后风险的潜在预测指标。具体而言，高表达的CHEK1可能预示着胃癌患者具有较好的预后，尤其是在疾病进展后的生存期。

2.3 CHEK1共表达及功能富集分析

基于TCGA-STAD RNA测序数据及相应的临床数据，本研究开展了CHEK1相关基因的共表达及功能富集分析。首先，筛选具完整临床随访信息的肿瘤样本(剔除正常组织及资料缺失样本)。对基因表达值进行转换后，以CHEK1为主变量，通过Spearman秩相关分析全基因组表达谱进行分析。根据r值排序，筛选出前20个核心共表达基因，见图3A。其次，利用基因本体富集GO分析对这些共表达基因进行功能注释，结果显示，这些基因主要与细胞分裂周期中的姐妹染色单体分离过程相关。第三，KEGG通路富集分析，进一步揭示相关共表达基因主要集中在细胞周期相关通路，以及细胞的成熟与分裂、衰老等生物学过程，见图3B、图3C。

2.4 CHEK1与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的相关性

CHEK1的高表达与免疫抑制性肿瘤微环境相关。为探讨CHEK1与免疫细胞浸润之间的关系，我们采用了ssGSEA算法对CHEK1表达和免疫浸润矩阵数据进行相关性分析。在24种癌症中，发现CHEK1的表达与免疫细胞浸润之间存在相关性，具有统计学意义(P＜0.05，图4A、图4D)。CHEK1表达与Th细胞浸润，尤其是Th2细胞、激活的树突状细胞(activated dendritic cell，aDC)正相关(P＜0.05)，而与其他类型免疫细胞[如pDC、肥大细胞、NK细胞、B细胞、滤泡型Th细胞(follicular helper T cell，TFH)、未成熟树突状细胞(immature dendritic cell，iDC)、CD8⁺ 细胞、效应记忆T细胞(effector memory T cell，Tem)、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、Th17细胞、细胞毒细胞]浸润之间则存在负相关(P＜0.05)。进一步聚焦于肿瘤细胞杀伤过程中的关键的免疫细胞CD8⁺ T细胞和DC细胞，分析结果显示，CHEK1的高表达与CD8⁺ 细胞及DC细胞呈明显的负相关性(图4B、图4C)。这一发现表明，CHEK1的高表达可能与免疫抑制性肿瘤微环境的形成有关，并会影响抗肿瘤免疫反应，进而影响免疫治疗效果。

2.5 构建敲低CHEK1胃癌细胞系

通过RT-PCR和Western blot法检测转染敲降载体病毒及过表达质粒的胃癌细胞中CHEK1的表达效率。以正常培养的胃癌细胞及转染空载体病毒、空载体质粒的胃癌细胞为对照，选择转染效率最高的细胞作为转染组。RT-PCR结果显示，转染组CHEK1 mRNA表达水平低于对照组，具有统计学差异(P＜0.001)(图5A、图5B)；Western blot结果也表明，转染组CHEK1蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学差异(P＜0.001)。这些结果表明，已成功建立稳定敲降CHEK1的细胞系。

2.6 CHEK1促进胃癌细胞系增殖并抑制凋亡

为进一步探讨CHEK1在胃癌细胞凋亡中的作用，我们利用流式细胞仪检测细胞凋亡。将处于对数生长期的AGS细胞分为CHEK1敲低组、CHEK1敲低对照组、CHEK1过表达组、CHEK1过表达对照组。采用Annexin V-FITC/PI双染法，通过流式细胞仪检测CHEK1对胃癌细胞凋亡的影响。实验结果显示，CHEK1敲低组的凋亡率为(39.28±3.40)%，CHEK1敲低对照组为(7.86±1.36)%，差异有统计学意义(P＜0.001)；CHEK1过表达组的凋亡率为(3.89±0.34)%，CHEK1过表达对照组为(9.09±0.82)%，差异也有统计学意义(P＜0.001)。上述结果提示，CHEK1的高表达可能通过调节细胞有丝分裂进程抑制胃癌细胞的凋亡(图6)。

2.7 CCK-8检测细胞活性

采用CCK-8实验检测CHEK1对胃癌细胞增殖的影响。结果表明，培养24 h后，各组间增殖能力差异无统计学意义(P＞0.90)；在48、72、96 h时，CHEK1敲低组的增殖能力低于对照组，CHEK1过表达组的增殖能力高于对照组，差异亦有统计学意义(P＜0.001)(图5C、图5D)。结果提示，CHEK1的表达水平与胃癌细胞的增殖能力呈正相关。

2.8 CHEK1参与细胞的DNA损伤修复通路

Western blot分析(图7)揭示了CHEK1的表达水平与相关蛋白的表达情况。在CHEK1过表达组中，γH2AX、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3条带在对照组中更为明显，量化分析结果差异有统计学意义，表明CHEK1过表达促进了DNA损伤修复并抑制了细胞凋亡。在CHEK1敲低组中，γH2AX、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表达水平较敲低对照组升高，差异具有统计学意义(P＜0.001)，表明CHEK1敲低导致DNA损伤修复受阻并且促进了细胞凋亡。这进一步表明，CHEK1可能通过调控细胞的DNA损伤修复机制来维持细胞的生存，并且可能在肿瘤细胞的耐药性和细胞存活中发挥重要作用。

3 讨论

CHEK1是细胞周期检查点及DNA损伤修复通路中的关键调控因子，其异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关^[20-21]。本研究通过泛癌分析及多数据库验证发现，CHEK1在包括胃癌在内的多种肿瘤中表达上调，并在胃腺癌组织中较正常组织显著升高^[22]；生存分析结果进一步显示，CHEK1高表达与胃癌患者更长的OS和PPS相关，而对FP的影响未见显著差异；结合功能富集及免疫相关分析结果，提示CHEK1可能通过参与细胞周期调控并影响免疫微环境，在胃癌发生与进展过程中发挥作用。进一步的体外功能实验结果显示，干预CHEK1表达可显著影响胃癌细胞的增殖活性和凋亡水平，CCK-8、凋亡分析及Western blot结果相互印证，从细胞学层面对上述生物信息学推断提供了支持^[23]。

在CHEK1与胃腺癌的预后相关分析中，CHEK1的高表达与胃癌患者较长的OS及PPS相关联，这一现象不同于乳腺癌等其他癌种^[7,24-25]。同时，也有相关研究通过多数据库系统分析CHEK1在多种实体瘤中的表达，得出类似的结论：在胃癌(以及结直肠癌)中，降低的CHEK1 mRNA表达是一个不良预后因素，即CHEK1表达低的患者生存更差^[9]。对此现象的解释，通过参考Mateusz K的研究结果，我们认为胃癌细胞对ATR-CHEK1通路表现出一种称为“分子脆弱性(molecular vulnerability)”的高度依赖，但其具体机制及其与肿瘤异质性、免疫状态之间的关系，尚未完全阐明^[23]。为明确CHEK1与胃癌预后之间的特殊关系，将分别从肿瘤细胞内在细胞周期/DDR机制和免疫微环境两方面展开，探讨其与预后表型不一致的可能原因。

通路分析中，CHEK1相关共表达基因的GO和KEGG富集分析显示，CHEK1共表达基因主要集中于细胞周期和有丝分裂的调控。同时，有研究表明，CHEK1相关基因及其共表达基因网络参与细胞周期检查点(S期、G2/M期)的调控与有丝分裂过程，是维持DNA完整性和基因组稳定性的关键因子。复制应激水平高、基因组不稳定性强的肿瘤高度依赖该通路^[26-27]。基于上述结论，我们提出假设：CHEK1的高表达可以通过强化肿瘤细胞的周期调控以及DNA的复制和修复过程，使其获得更快的增殖速度与耐受DNA损伤的优势，从而促进肿瘤进展。同时，这也为基于CHEK1抑制与DNA损伤的联合治疗策略提供了机制基础。此外，研究表明，CHEK1不仅在单一路径中发挥作用，还可能与其他关键通路(包括p53介导通路)存在复杂交互^[26]。因此，CHEK1与其他癌症信号通路的交互作用也值得进一步研究，以理解其多功能性。对于CHEK1高表达与胃癌患者较长OS和PPS相关的现象，上述单纯的细胞调控和DNA修复机制显然不能解释，我们推测这可能与胃癌肿瘤细胞的特定生物学行为及肿瘤微环境相关。

免疫浸润相关分析发现，CHEK1的高表达与多种效应性免疫细胞的浸润呈负相关，这可能与肿瘤的免疫逃逸相关^[28]。结果显示，CHEK1高表达组的CD8⁺ T细胞和树突状细胞的富集分数低于低表达组，组间差异具有统计学意义，而Th2细胞富集分数高于低表达组，组间差异亦具有统计学意义，这与肿瘤微环境的免疫抑制特征相符^[7]。这一结果表明，CHEK1可能作为一个潜在的免疫逃逸促进因子，通过抑制有效免疫细胞，协助肿瘤逃避免疫监视，从而为肿瘤细胞的生长和进展提供有利条件。同时，这也为肿瘤免疫治疗提供了潜在的靶点。Huang等^[29]进行的一项研究正是通过机制、动物模型、免疫激活、治疗增效多方面印证，证明了CHEK1抑制与免疫检查点抑制剂联合治疗可一定程度上增强肿瘤抑制效果。遗憾的是，由于胃癌肿瘤微环境的复杂性与异质性很高，目前对胃癌免疫微环境与肿瘤分子特征(如基因表达、DNA修复基因等)之间关联的研究仍十分有限^[30]。因此，进一步解析CHEK1高表达与免疫逃逸及患者预后之间的关系，以及在不同胃癌亚型中的具体作用，仍是未来研究的重要方向。

矛盾的是，这一发现与我们基于公共数据库得出的“CHEK1高表达与胃癌患者较长OS和PPS相关”的结果并不完全一致，提示CHEK1在胃癌中可能具有更为复杂且情境依赖的生物学作用。为对生物信息学预测进行初步实验验证，并进一步探索CHEK1在胃癌中的功能，我们开展了细胞学实验。需要指出的是，本研究体外实验主要用于验证CHEK1表达水平对细胞周期、增殖/凋亡的影响，而预后差异可能更多受到队列异质性与治疗情境调制。在CHEK1基因敲低的胃癌细胞中，细胞增殖能力显著下降，凋亡率显著升高，同时DNA损伤标志物γH2AX水平升高，提示CHEK1参与调控DNA损伤应答与细胞凋亡过程，这与免疫浸润分析的推测及既往相关研究结果基本一致^[26,31]。既往研究表明，CHEK1是ATM/ATR下游的重要效应分子，与ATM/ATR共同构成DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)的核心轴，在DNA修复及细胞命运(存活与凋亡)的决策中具有关键作用，并在放疗增敏和降低化疗耐药性方面具有潜在意义^[32-34]。本研究的结果在现有文献基础上提示：CHEK1可能参与上述DDR/ATM–ATR–CHEK1轴的调控过程，有待在后续研究中通过检测ATM/ATR及CHEK1磷酸化状态、通路抑制剂干预等实验进一步加以验证。

综上所述，CHEK1在生物学层面总体表现为促癌因子：其高表达与细胞周期加速、DNA损伤耐受增强以及免疫抑制性肿瘤微环境密切相关。然而，在预后分析中，我们却观察到CHEK1高表达与胃癌患者较长OS和PPS相关，而FP无统计学差异，这一“促癌表型”与“更长生存”的矛盾现象，提示CHEK1在胃癌中可能具有高度情境依赖的双重作用机制。我们认为，至少存在以下几种并行且可能相互交织的解释：(1)“分子脆弱性”假说认为，胃癌细胞在高复制应激和显著基因组不稳定背景下，对ATR–CHEK1轴形成高度依赖，高CHEK1表达一方面支持肿瘤细胞存活，另一方面也使其对DDR/CHK1抑制策略更为敏感，从而在接受系统治疗的患者中转化为更可控的疾病过程和更长的随访生存^[26,33,35]。(2)“基因组稳定性/稳态”假说认为，在高度异质的胃癌中，部分亚型在高CHEK1表达背景下通过维持相对可控的DNA修复和细胞周期检查点，避免了灾难性基因组崩溃和极端恶性克隆的快速扩张，使肿瘤进展节律相对“平缓”，从而并不显著缩短FP，却在长期随访中体现在OS和PPS的获益^[36-38]。(3)从肿瘤微环境视角看，CHEK1高表达虽然与CD8⁺ T细胞和树突状细胞浸润减少、Th2细胞上升等免疫抑制特征相关，但DDR/CHK1轴同时参与调控肿瘤干性、免疫检查点表达及对免疫治疗的敏感性^[39-40]，在某些治疗情境下，高CHEK1表达人群可能更有机会从DNA损伤增强剂与免疫检查点抑制剂的联合治疗中获益^[41]。(4)胃癌本身显著的分子和临床异质性，以及不同队列间在分期构成、治疗方案、随访时间及统计cut-off设定上的差异，也可能放大或掩盖CHEK1与结局之间的真实关联，造成“生物学促癌而统计上OS/PPS较好、FP无差异”的表面矛盾。需要强调的是，上述解释目前仍属于基于本研究结果与既往文献的综合推断，尚缺乏直接的机制证据支持，未来有必要结合多中心临床队列、分型分层分析以及功能与免疫学实验进一步加以验证。

尽管本研究取得了一定成果，但仍存在局限性。由于CHEK1在胃癌中的表达及免疫微环境极为复杂，其免疫浸润情况、细胞组成、空间结构、分子间相互作用网络等均呈现出高度异质性，有待进一步完善肿瘤细胞—免疫细胞共培养、关键免疫相关通路/因子检测等层面的直接证据来支撑CHEK1影响免疫微环境的具体机制^[42]，CHEK1表达与免疫微环境的关联尚未得到充分验证，缺乏直接的实验数据支持。后续可借助共培养体系、动物模型及多组学联合分析技术，全面探讨CHEK1在胃癌复杂生态系统中的作用网络。这为基于CHEK1靶点的创新治疗策略的开发奠定了更为坚实的理论基础和实践指导。期待能够推动胃癌精准医疗的发展进程，从而改善患者的预后及生存质量。细胞实验方面，本研究仅选用了单一的代表性胃癌细胞系AGS，不同胃癌细胞亚型在基因表达和生物学行为上存在异质性，未来需拓展至更多细胞系及原代细胞培养模型，验证结果的一致性和普遍性。此外，本研究进行的生物信息学分析依赖于公共数据库，可能存在潜在混杂因素影响结果的普适性，且本项研究缺乏来自临床样本的实证验证，如组织芯片或患者随访数据，限制了结果证据的完整性。后续研究应整合多中心及多队列的临床数据，纳入更为全面的患者临床特征和治疗信息，以深入探讨CHEK1与胃癌预后及治疗反应之间的关系。

总之，本研究采用生物信息学分析与细胞实验相结合的方法，对CHEK1在胃癌中的表达模式及其潜在机制进行了系统评估，发现其上调与肿瘤增殖、凋亡抑制及免疫抑制微环境密切相关，阐明了CHEK1在胃癌中通过“细胞周期调控与免疫微环境重塑”双重机制促进肿瘤进展的作用。这些发现为CHEK1作为诊断、治疗和预后生物标志物的潜力提供了重要的理论依据，并为未来靶向治疗的开发和个体化免疫治疗的优化奠定了基础。需要强调的是，本研究观察到的“促癌相关生物学表型”与“统计学上更长OS/PPS”之间存在表面矛盾，提示CHEK1在胃癌中的预后意义可能具有治疗情境与队列异质性依赖，仍需进一步分层与机制研究验证。后续研究应专注于临床样本的验证，以及对CHEK1与免疫微环境之间相互作用的深入探讨。

参考文献

[1] Qin NP， Fan YY， Yang T，et al. The burden of Gastric Cancer and possible risk factors from 1990 to 2021，and projections until 2035： findings from the Global Burden of Disease Study 2021［J］. Biomark Res，2025，13（1）：5.

[2] Mamun TI， Younus S， Rahman MH. Gastric cancer-Epidemiology，modifiable and non-modifiable risk factors，challenges and opportunities： An updated review［J］. Cancer Treat Res Commun，2024，41：100845.

[3] 许永虎，徐大志. 21世纪以来胃癌治疗进展及未来展望［J］. 中国癌症杂志，2024，34（3）：239-249.

[4] Sun Y， Puspanathan P， Lim T，et al. Advances and challenges in gastric cancer testing： the role of biomarkers［J］. Cancer Biol Med，2025，22（3）：212-230.

[5] Kanayama K， Hirokawa YS. Molecular biomarkers in gastric cancer［M］//Biomarkers in Cancer Detection and Monitoring of Therapeutics. Amsterdam：Elsevier，2024：105-119.

[6] Patil M， Pabla N， Dong Z. Checkpoint kinase 1 in DNA damage response and cell cycle regulation［J］. Cell Mol Life Sci，2013，70（21）：4009-4021.

[7] Zhou J， Wu ZY， Aili D，et al. Exploration of the carcinogenetic and immune role of CHK1 in human cancer［J］. J Cancer，2024，15（18）：5927-5941.

[8] Wu M， Pang JS， Sun Q，et al. The clinical significance of CHEK1 in breast cancer： a high-throughput data analysis and immunohistochemical study［J］. Int J Clin Exp Pathol，2019，12（1）：1-20.

[9] Fadaka AO， Bakare OO， Sibuyi NRS，et al. Gene expression alterations and molecular analysis of CHEK1 in solid tumors［J］. Cancers，2020，12（3）：662.

[10] Tomczak K， Czerwińska P， Wiznerowicz M. The Cancer Genome Atlas （TCGA）： an immeasurable source of knowledge［J］. Contemp Oncol （Pozn），2015，19（1A）：A68-A77.

[11] Love MI， Huber W， Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2［J］. Genome Biol，2014，15（12）：550.

[12] Tang ZF， Kang BX， Li CW，et al. GEPIA2： an enhanced web server for large-scale expression profiling and interactive analysis［J］. Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W556-W560.

[13] Liu JF， Lichtenberg T， Hoadley KA，et al. An integrated TCGA pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics［J］. Cell，2018，173（2）：400-416.

[14] Posta M， Győrffy B. Pathway-level mutational signatures predict breast cancer outcomes and reveal therapeutic targets［J］. Br J Pharmacol，2025，182（23）：5734-5747.

[15] Gargano MA， Matentzoglu N， Coleman B，et al. The Human Phenotype Ontology in 2024： phenotypes around the world［J］. Nucleic acids research，2024，52（D1）：D1333-D1346.

[16] Kanehisa M， Furumichi M， Sato Y，et al. KEGG for taxonomy-based analysis of pathways and genomes［J］. Nucleic Acids Res，2023，51（D1）：D587-D592.

[17] Yu GC， Wang LG， Han YY，et al. clusterProfiler： an R package for comparing biological themes among gene clusters［J］. OMICS A J Integr Biol，2012，16（5）：284-287.

[18] Hänzelmann S， Castelo R， Guinney J. GSVA gene set variation analysis for microarray and RNA-Seq data［J］. BMC Bioinform，2013，14（1）：7.

[19] Bindea G， Mlecnik B， Tosolini M，et al. Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer［J］. Immunity， 2013，39（4）：782-795.

[20] Muzny DM， Bainbridge MN， Chang K，et al. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer［J］. Nature，2012，487（7407）：330-337.

[21] Õsz Á， Aszódi B， Vajda R，et al. CHEK1 expression and inhibitors in TP53 mutant cancer［J］. Magy Onkol，2019，63（4）：345-352.

[22] Bargiela-Iparraguirre J， Prado-Marchal L， Fernandez-Fuente M，et al. CHK1 expression in Gastric Cancer is modulated by p53 and RB1/E2F1： implications in chemo/radiotherapy response［J］. Sci Rep，2016，6：21519.

[23] Kciuk M， Gruszka R， Aleksandrowicz M，et al. ATR-CHK1 axis inhibitors in gastric cancer treatment［J］. Int J Mol Sci，2025，26（16）：7709.

[24] Wen YP， Hou YY， Yi XQ，et al. EZH2 activates CHK1 signaling to promote ovarian cancer chemoresistance by maintaining the properties of cancer stem cells［J］. Theranostics，2021，11（4）：1795-1813.

[25] Rong C， Liu Y， Xiang F，et al. Integrative bioinformatics analysis and experimental validation identify CHEK1 as an unfavorable prognostic biomarker related to immunosuppressive phenotypes in soft tissue sarcomas［J］. NPJ Precis Oncol，2025，9（1）：268.

[26] Jiang KL， Deng MJ， Du WJ，et al. Functions and inhibitors of CHK1 in cancer therapy［J］. Med Drug Discov，2024，22：100185.

[27] Bartek J， Lukas J. Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer［J］. Cancer Cell，2003，3（5）：421-429.

[28] Lamplugh Z， Fan Y. Vascular microenvironment，tumor immunity and immunotherapy［J］. Front Immunol，2021，12：811485.

[29] Huang R， Wu YJ， Shen FY，et al. Manganese-coordinated nanoparticles loaded with CHK1 inhibitor dually activate cGAS-STING pathway and enhance efficacy of immune checkpoint therapy［J］. Biomaterials，2025，319：123199.

[30] Ma MW， Sun J， Liu Z，et al. The immune microenvironment in gastric cancer： prognostic prediction［J］. Front Oncol，2022，12：836389.

[31] Liu XM， Chen F， Zhang F，et al. Knockdown of Chk1 inhibits proliferation and promotes apoptosis in mouse granulosa cells and its regulation mechanism by miR-15a and miR-16［J］. Vitro Cell Dev Biol Anim，2022，58（7）：579-586.

[32] Luo R， Wu JN， Chen XM，et al. ATR/Chk1 interacting lncRNA modulates DNA damage response to induce breast cancer chemoresistance［J］. Cell Insight，2024，3（5）：100183.

[33] Fernandez A， Artola M， Leon S，et al. Cancer vulnerabilities through targeting the ATR/Chk1 and ATM/Chk2 axes in the context of DNA damage［J］. Cells，2025，14（10）：748.

[34] Huang RX， Zhou PK. DNA damage response signaling pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer［J］. Signal Transduct Target Ther，2020，5（1）：60.

[35] da Costa AABA， Chowdhury D， Shapiro GI，et al. Targeting replication stress in cancer therapy［J］. Nat Rev Drug Discov，2023，22（1）：38-58.

[36] Glaviano A， Singh SK， Lee EHC，et al. Cell cycle dysregulation in cancer［J］. Pharmacol Rev，2025，77（2）：100030.

[37] Nemtsova MV， Kuznetsova EB， Bure IV. Chromosomal instability in gastric cancer： role in tumor development，progression，and therapy［J］. Int J Mol Sci，2023，24（23）：16961.

[38] Xiao HP， He QJ， Hu Y，et al. A novel DNA damage-related gene index for predicting prognosis in gastric cancer［J］. 3 Biotech，2025，15（1）：32.

[39] Hsieh RC， Krishnan S， Wu RC，et al. ATR-mediated CD47 and PD-L1 up-regulation restricts radiotherapy-induced immune priming and abscopal responses in colorectal cancer［J］. Sci Immunol，2022，7（72）：eabl9330.

[40] Chen MQ， Huang L， Zhu MN，et al. Combined CHK1 and PD-L1 blockade as a novel therapeutic strategy against stemness and immunosuppression in ovarian cancer［J］. Cancer Immunol Immunother，2025，74（12）：365.

[41] Carlsen L， El-Deiry WS. Anti-cancer immune responses to DNA damage response inhibitors： Molecular mechanisms and progress toward clinical translation［J］. Front Oncol，2022，12：998388.

[42] Mou P， Ge QH， Sheng R，et al. Research progress on the immune microenvironment and immunotherapy in gastric cancer［J］. Front Immunol，2023，14：1291117.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(82371515)