外源性IL-33通过调控活化BV2小胶质细胞逆转其对PC12细胞生长抑制的作用研究

Exogenous IL-33 reverses growth inhibition of PC12 cells by activated BV2 microglia via modulation of microglial activation

摘要

背景 小胶质细胞-神经元相互作用对脊髓损伤后的神经修复至关重要。白细胞介素-33(interleukin-33，IL-33)是来自白细胞介素-1家族的多功能细胞因子，其在脊髓损伤后调节小胶质细胞-神经元相互作用中起关键作用。 目的 探究活化BV2细胞对PC12细胞生长的调控作用。 方法 使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK8)检测不同浓度脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)干预BV2细胞后BV2细胞活化个数及BV2细胞存活率，筛选影响其活化的最适浓度。利用免疫荧光染色检测BV2细胞突起长度及分支变化情况。将普通培养基培养的BV2细胞与含LPS培养基培养的BV2细胞分别与PC12细胞共培养，利用免疫荧光染色检测PC12细胞突起长度及分支变化情况。利用实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)，白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)基因相对表达量；使用10 ng/mL IL-33干预活化的BV2细胞，并将其与PC12细胞共培养，利用免疫荧光染色检测PC12细胞突起长度及分支变化情况。 结果 CCK8结果显示，当LPS浓度＜1 μg/mL时，细胞呈明显活化形态的个数较少，当LPS浓度＞1 μg/mL时，细胞存活率出现下降，所以1 μg/mL为影响BV2细胞活化的最适浓度。光学显微镜观察及免疫荧光染色实验结果显示，相比于静息态BV2细胞，活化BV2细胞突起变短，胞体近端分支变多，形态呈现阿米巴样结构。RT-qPCR结果显示，促炎因子IL-6，TNF-α表达水平上调(P＜0.01)，而抗炎因子IL-4，IL-10的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。光学显微镜观察及免疫荧光染色结果显示，与活化BV2细胞共培养后，PC12细胞突起变短，分支变少；IL-33的干预减轻了这一现象。 结论 IL-33可以调控活化BV2细胞，减少其对PC12细胞生长的抑制作用。

Abstract

Background The interplay between microglia and neurons orchestrates neurorestorative processes after spinal cord injury. Interleukin-33 (IL-33), a member of the IL-1 superfamily, serves as a key mediator in fine-tuning microglia-neuron crosstalk during the pathogenesis of spinal cord injury. Here, we sought to elucidate how activated BV2 microglial cells regulate the proliferation and viability of PC12 cells. Objective To investigate the regulatory effect of activated BV2 cells on the growth of PC12 cells. Methods Cell viability and the number of activated BV2 microglial cells following treatment with varying concentrations of lipopolysaccharide (LPS) were quantified using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to determine the optimal concentration for inducing activation. Morphological alterations, specifically process length and branching complexity, were evaluated via immunofluorescence staining. BV2 cells cultured in standard medium (control) or LPS-supplemented medium (LPS group) were subsequently co-cultured with PC12 cells, and neurite length and branching of PC12 cells were analyzed using immunofluorescence. Relative mRNA expression levels of the pro-inflammatory cytokines interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α), alongside the anti-inflammatory cytokines interleukin-4 (IL-4) and interleukin-10 (IL-10), were measured by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). To assess the modulatory effect of IL-33, activated BV2 cells were treated with 10 ng/mL IL-33 prior to co-culture with PC12 cells, followed by immunofluorescence analysis to evaluate changes in PC12 neurite length and branching complexity. Results CCK-8 assay results demonstrated that treatment with LPS at concentrations below 1 μg/mL induced minimal morphological activation, whereas concentrations above 1 μg/mL significantly reduced cell viability; thus, 1 μg/mL was identified as the optimal concentration for activating BV2 cells. Light microscopy and immunofluorescence analyses revealed that, compared with resting microglia, activated BV2 cells exhibited shortened processes, increased proximal branching, and an amoeboid morphology. RT-qPCR analysis showed that the mRNA expression levels of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α were significantly upregulated (P＜0.01), while the changes in the anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 were not statistically significant (P＞0.05). Furthermore, co-culture with activated BV2 cells resulted in markedly shortened neurites and reduced branching in PC12 cells, an effect that was notably attenuated by IL-33 intervention. Conclusion IL-33 can regulate activated BV2 cells and reduce their inhibitory effect on PC12 cell growth.

脊髓损伤是影响神经系统十分常见和严重的疾病之一，通常会导致不可逆的感觉和运动功能障碍^[1-2]，并造成沉重的社会经济负担^[3]。脊髓损伤后复杂的病理生理过程促进慢性神经炎症反应，严重影响神经功能恢复^[4]。小胶质细胞作为中枢神经系统中的主要常驻免疫细胞，积极调控神经炎症反应。在中枢神经系统中，小胶质细胞持续地监视周围的微环境，积极参与神经元通讯，调节神经元功能和命运，维持神经系统平衡^[5-6]。脊髓损伤后，神经炎症触发小胶质细胞逐渐活化，细胞形态呈阿米巴状，并增强吞噬活性^[7]。小胶质细胞的过度活化促进促炎细胞因子的释放，进而加剧神经元损伤，阻碍脊髓功能的恢复^[8]。因此，调控脊髓损伤后活化小胶质细胞与神经元的交互，将有助于改善神经元的修复与再生。白细胞介素-33(interleukin-33，IL-33)是白细胞介素-1家族成员，研究表明，利用重组IL-33治疗可减少挫伤小鼠脊髓中的组织损失、脱髓鞘和星形胶质细胞增生，从而改善功能恢复。IL-33治疗可能为急性挫伤性脊髓损伤患者提供一种新的治疗策略^[9]。然而，IL-33是否通过调控活化小胶质细胞与神经元之间的相互作用发挥神经保护作用，目前尚不清楚。本研究使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导BV2细胞活化的炎症模型模拟脊髓损伤，并将其与PC12细胞进行共培养，通过使用IL-33干预活化的BV2细胞，观察其对PC12细胞生长的影响，旨在初步探讨IL-33是否通过调控小胶质细胞-神经元相互作用发挥神经保护效应。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与耗材

高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)，青-链霉素双抗液(美国Gibco公司)，T25细胞培养瓶(美国Corning公司)，50 mL离心管(无菌)(美国Corning公司)，15 mL离心管(无菌)(美国Corning公司)，All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR(南京诺唯赞生物科技公司)，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技公司)，BV2小鼠小胶质细胞系(武汉尚恩生物技术有限公司)，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)(武汉尚恩生物技术有限公司)，BV2细胞完全培养基(武汉尚恩生物技术有限公司)，高分化PC12细胞完全培养基(武汉尚恩生物技术有限公司)，磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)(美国Gibco公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)不含酚红(美国Gibco公司)，Recombinant Human IL-33 Protein (His-tag)(武汉赛维尔公司)，4%多聚甲醛组织固定液(白鲨生物)，Anti-Iba1抗体(美国Abcam公司)，75%乙醇(山东利尔康医疗科技股份有限公司)，山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 488)(美国Abcam公司)，山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor® 594)(美国Abcam公司)，山羊抗大鼠IgG H&L (Alexa Fluor®647)(美国Abcam公司)，FreeZol Reagent试剂盒(南京诺唯赞生物科技公司)，Anti-MAP2抗体(美国Abcam公司)，抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)(武汉赛维尔公司)。

1.2 细胞培养

BV2细胞和PC12细胞购自武汉尚恩生物技术有限公司，使用含10% FBS的高糖DMEM和1%青霉素-链霉素组成的标准培养基，并保持在37℃、5% CO₂和95%湿度下培养，每3 d更换1次培养基。一旦细胞生长达到80% ~ 90%，用0.25%胰蛋白酶消化2 min，并用含有FBS的完全培养基终止消化。以1∶2的比例进行传代培养，用于后续实验。

1.3 CCK8实验检测不同浓度脂多糖干预后BV2细胞活化个数及BV2细胞存活率

将细胞在培养箱中培养24 h以使其贴壁生长。分别按照0、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL的浓度梯度加入LPS干预6 h。CCK8染色时，每孔加入10 μL CCK8指示剂，交叉混合，在培养箱中孵育1 h。孵育后，通过BioTek Synergy H4测量450 nm处的OD值，细胞活性与OD值正相关。

1.4 免疫荧光染色检测BV2细胞及PC12细胞突起长度及分支变化情况

实验分组：BV2细胞活化实验染色将细胞分为对照组和活化组；BV2细胞与PC12细胞共培养实验染色将细胞分为BV2-PC12组、活化BV2-PC12组、IL-33+活化BV2-PC12组。将细胞爬片用纯水冲洗3遍，将其浸泡在75%乙醇中静置10 min。用镊子夹起细胞爬片，在酒精灯上加热蒸发，将烧干的盖玻片放在六孔板中，冷却后滴加细胞悬液(约1×10⁴个细胞)，等待细胞贴壁后，更换培养基并继续培养1 d。去除培养基，加入PBS清洗5 min，4%多聚甲醛固定细胞15 min。PBS清洗3遍(每遍5 min)，使用后加入配好的封闭液(含10%正常山羊血清、0.5% Triton X-100)，室温封闭1 h。封闭后加入稀释好的一抗稀释液(Iba1，1∶500；Map2，1∶500)，4℃冰箱孵育过夜。孵育完成后用PBS清洗3遍，加入稀释好的荧光二抗(1∶1 000)，室温避光孵育1 h。PBS清洗3遍。吸干水分，小心取出爬片，置于载玻片上。在爬片上滴加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，避光孵育15 min。固定盖玻片，荧光显微镜观察，分析结果。

1.5 RT-qPCR实验检测IL-6，TNF-α，IL-4，IL-10基因相对表达量

RNA提取：将细胞培养板取出，吸取培养基弃置，PBS清洗，加入FreeZol Reagent试剂，吹打混匀将细胞裂解，室温静置5 min。收集样本裂解液于无菌无酶EP管中。后续操作除离心外全程在冰盒上操作。在每500 μL FreeZol Reagent混合液中加入150 μL的稀释缓冲液，振荡混匀，室温静置5 min。12 000 g室温离心15 min，可看到有杂质沉淀。吸取约500 μL上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。12 000 g室温离心10 min，沉淀即为RNA。加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，上下左右颠倒振荡，8 000 g室温离心3 min，弃上清。重复1次。放置20 min使乙醇挥发，用30 μL无菌无酶水溶解提取的RNA，于液氮中保存。

逆转录：根据试剂盒HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR说明书操作。合成cDNA：1 μg RNA、1 μL Enzyme Mix、4 μL 5 × All-in-one qRT SuperMix，无菌无酶水定容至20 μL。PCR仪中反应程序：50℃ 15 min，85℃ 5 min。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测：根据试剂盒Universal SYBR qPCR Master Mix说明书操作。配置反应体系：0.2 μL cDNA、0.8 μL正反引物、9 μL无菌无酶水和10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，总体积为20 μL。使用CFX96 TM Real-Time系统运行反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃延伸15 s，共40个循环。数据采用2^-ΔΔCt法计算分析目的基因mRNA的表达水平。实验中所用引物序列见表1。

1.6 统计学分析

所有数据均采用GraphPad Prism 9.0软件来进行统计分析。两组间数据采用独立样本t检验进行分析比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1 μg/mL为LPS诱导BV2细胞活化的最适浓度

LPS是革兰阴性细菌细胞壁中的一种内毒素，被广泛用于炎症反应的诱导。适量浓度的LPS刺激下可诱导BV2细胞活化，但其最适浓度尚不清楚。将不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL)的LPS与BV2细胞共孵育6 h，结果发现，当LPS浓度＜1 μg/mL时，细胞形态没有明显改变(图1A)。当浓度提高到1 ~ 10 μg/mL时，随着LPS浓度的增高，BV2细胞开始从具有伸长的细胞突起的分枝形式转化为具突起短缩、胞体增大的吞噬形式(图1A)，活化的细胞数量也逐渐增多(图1B)。进行CCK-8实验以确定LPS是否影响BV2细胞活力。在不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL)LPS存在下孵育细胞，发现低于1 μg/mL的浓度对细胞活力没有明显影响，而高于5 μg/mL时，细胞活力出现下降(图1B)。因此，本研究选用1 μg/mL作为诱导BV2细胞活化的最适浓度，并用于后续实验。

2.2 活化BV2细胞表现出胞体增大、突起短缩的阿米巴样形态特征

本研究使用光学显微镜和Iba1的免疫荧光染色(图2A)观察1 μg/mL浓度的LPS刺激条件下BV2细胞的形态学变化。正常培养条件下的BV2细胞呈圆形或椭圆形，其形态规则，边界清晰，具有细长、分支状的突起，形成高度分枝的网状结构。在1 μg/mL浓度的LPS刺激6 h后，BV2细胞形态变得不规则，呈现典型的“阿米巴样”结构；突起变短(图2B)，细胞边缘出现伪足，表明其具有迁移和吞噬能力。为了评估其分支复杂性，采用Sholl分析统计显示(图2C)，相对于静息BV2细胞，活化BV2细胞突起较短，分叉较多，形态发生改变，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 活化BV2细胞表现出促炎特性

BV2细胞在经历LPS活化6 h后，通过RT-qPCR检测多项炎症因子的表达情况，结果发现，与对照组相比，活化BV2细胞表现出促炎特性，关键的促炎细胞因子(IL-6和TNF-α)的表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.001)，而典型的抗炎/免疫调节性细胞因子(IL-4和IL-10)表达则无统计学差异(P＞0.05)，见图3。

2.4 活化BV2细胞可抑制PC12细胞生长

为在体外模拟小胶质细胞与神经元之间的相互作用，将LPS活化6 h的BV2细胞及静息态BV2细胞分别与PC12细胞进行共培养，BV2细胞与PC12细胞接种比例为1∶1。光学显微镜观察显示，与活化BV2细胞共培养的PC12细胞突起缩短(P＜0.01)。进一步通过免疫荧光染色结合Sholl分析进行定量评估，结果显示，相较于与静息BV2细胞共培养的PC12细胞，与活化BV2细胞共培养的PC12细胞不仅轴突总长度减少(P＜0.05)，其树突样突起的数量亦降低(P＜0.05)。见图4。上述结果表明，活化的BV2细胞对PC12细胞的神经突生长和分化具有抑制作用。

2.5 IL-33可缓解活化BV2细胞对PC12细胞生长分化的抑制作用

在LPS活化6h的BV2小胶质细胞中加入重组IL-33预处理，与PC12细胞进行共培养。光学显微镜观察显示，与未添加IL-33的活化BV2共培养组相比，IL-33干预组的PC12细胞神经突延长。进一步通过免疫荧光染色结合Sholl分析定量评估发现，IL-33处理增加了PC12细胞的突起数量与轴突总长度(P＜0.05)，并提高了Sholl交叉点总数(P＜0.01)。见图5。综上，IL-33能有效缓解活化BV2细胞对PC12细胞神经突生长及分化的抑制作用，提示其在神经炎症环境中具有潜在的神经保护功能。

3 讨论

脊髓损伤是一种高发病率、高致残率且带来沉重社会经济负担的神经系统疾病。小胶质细胞作为中枢神经系统中主要的免疫效应细胞，其活化反应在脊髓损伤后的神经再生过程中发挥关键作用^[10]。在急性期，小胶质细胞迅速活化并转变为阿米巴样吞噬表型，一方面清除细胞碎片以维持微环境稳态，另一方面释放促炎细胞因子，加剧继发性组织损伤^[11]。在生理状态下，小胶质细胞与神经元构成动态相互作用网络，共同维持突触结构、神经元兴奋性及环路功能的稳态。脊髓损伤引发突触重塑、突触传递效能改变及神经元兴奋性异常等一系列病理适应性变化。然而，小胶质细胞如何通过与神经元的相互作用调控这些过程，目前仍不清楚。

研究表明，小胶质细胞持续监测中枢神经系统环境，对各种刺激敏感地响应，并同步改变其形态学特征，例如胞体面积、分支数量和长度^[12]。这突出了小胶质细胞的形态多样性。小胶质细胞通常以两种不同状态存在：(1)“静息”，其特征在于高度分枝的形态和有限的吞噬和迁移活性；(2)“活化”，其特征在于变形虫形状、高运动性、具有吞噬和增殖能力^[13]。小胶质细胞在健康大脑中非常活跃，超出其直接免疫应答模式，在突触可塑性、神经营养支持、髓鞘重塑和维持神经系统稳态中发挥重要作用^[14]。长期以来，形态学变化被视为小胶质细胞“激活”的关键标志，反映了其伴随功能改变的形态-生理学转变。小胶质细胞在感染、创伤或病理过程期间会发生形态和功能的转变，并迁移到病变部位，发挥其吞噬能力以清除碎片或消除病原体，并采用变形虫形态。形态测定参数，如球形度、体积、细胞体面积、突起数量、突起长度、终点数量、节点数量或小胶质细胞突起面积已广泛用于小胶质细胞形态的评估^[15]。

越来越多的证据表明，小胶质细胞具有促进脊髓损伤后组织修复的潜力。一项结合CSF1R抑制剂与单细胞RNA测序的研究揭示，小胶质细胞的耗竭可完全阻断损伤部位的神经再生，而将新生儿来源或经肽酶受体预处理的小胶质细胞移植至成年损伤脊髓，可促进轴突生长与组织修复^[16]。小胶质细胞募集到病变核心被认为是脊髓损伤恢复过程中的关键事件。另有研究发现，抑制主要由小胶质细胞产生的可溶性TNF-α可防止严重脊髓损伤后适应不良的结构可塑性和自主神经失调^[17]。这些证据都表明脊髓损伤后小胶质细胞与神经元之间的交互作用模式可能会影响脊髓损伤的修复。然而，其调控神经元命运的具体分子与细胞机制仍未阐明。

IL-33是IL-1细胞因子家族的关键成员，在多种炎症性和神经退行性疾病中发挥重要调控作用。其生物学效应主要通过与跨膜受体肿瘤发生抑制蛋白2(suppression of tumorigenicity 2，ST2)及辅助受体IL-1受体辅助蛋白结合而介导，进而激活下游NF-κB和MAPK信号通路^[18]。作为警报蛋白，IL-33可以在组织损伤后从细胞核中释放并参与免疫应答^[19]。IL-33在脊髓和脑中的广泛表达表明其在CNS中具有特异性功能。值得注意的是，IL-33在调节神经胶质细胞对神经损伤或炎症刺激的响应中发挥关键作用，可影响炎性分子的释放与微环境稳态。然而，关于IL-33在中枢神经系统中的作用，现有研究仍存在差异。在实验性自身免疫性脑脊髓炎和蛛网膜下腔出血中显示了不一致的结果，即IL-33蛋白在神经元细胞和星形胶质细胞中表达，但在小胶质细胞中不表达^[20]。在多发性硬化患者中，IL-33则广泛分布于多种中枢神经系统驻留细胞，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及小胶质细胞^[21]。据报道，重组IL-33的全身给药在脑缺血的动物模型中具有神经保护作用^[13]。特异性靶向可溶性ST2以消除其对IL-33/ST2信号通路的抑制，已被认为是治疗缺血性卒中的潜在策略^[22]。然而，IL-33的神经保护功能是否通过调控小胶质细胞-神经元交互发挥作用尚不明确。

多项研究证实LPS激活的BV2细胞对PC12细胞的生长产生有害作用，例如LPS激活的BV2小胶质细胞触发TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，诱导IL-1β的释放，参与PC12细胞损伤^[23]。另外，LPS刺激BV2细胞的条件培养基也可以通过激活caspase-3促进分化的PC12细胞的凋亡^[24]。在本研究中，使用LPS激活BV2细胞作为小胶质细胞活化模型。通过CCK8试验筛选出诱导BV2细胞活化的最适浓度为1 μg/mL。活化后的BV2细胞具有独特的形态学特征，细胞胞体较大，分支增多，形状呈现阿米巴样结构，并表现为促炎表型。qPCR检测结果显示，促炎相关基因(TNF-α和IL-6)的表达上调，而抗炎标志基因(IL-4和IL-10)变化无统计学差异。将BV2细胞与PC12细胞共培养后，PC12细胞的轴突延伸受到抑制，提示活化的小胶质细胞可能通过分泌促炎因子对神经元产生毒性作用。通过IL-33对活化BV2细胞进行干预，发现其对PC12轴突生长的抑制效应减轻，表明IL-33可部分逆转小胶质细胞介导的神经炎症损伤。

综上所述，IL-33可能是调控小胶质细胞-神经元交互的关键效应因子，通过抑制小胶质细胞的促炎极化，缓解神经炎症对神经元的损害，从而为脊髓损伤后的神经保护提供策略参考。本研究目前仅基于体外细胞模型，尚未在动物体内验证IL-33的作用效果及机制。后续研究将结合脊髓损伤小鼠模型，进一步探究IL-33如何调控小胶质细胞表型转换及其对神经元修复与功能恢复的影响，以期为靶向神经免疫互作的治疗策略提供理论依据。

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