脂质纳米颗粒封装的线粒体修复大鼠面神经损伤的实验研究

Repair of facial nerve injury with lipid nanoparticles-encapsulated mitochondria in rats

摘要

背景 面神经损伤早期线粒体功能障碍限制其修复进度，优化递送策略以提升线粒体移植疗效是当前研究重点。 目的 构建一种由脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，LNP)封装的工程化线粒体(Mito@LNP)，并评估其在大鼠面神经颊支挤压损伤模型中的修复作用。 方法 采用薄膜水化-挤出法制备LNP，并从人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC)提取线粒体，制备出LNP封装的线粒体(Mito@LNP)。通过PC12细胞进行体外实验，检测LNP封装体系的细胞毒性、摄取效率及其对H₂O₂诱导的氧化损伤的保护能力。建立大鼠面神经颊支挤压损伤模型，在损伤处局部束膜下注射Mito@LNP。利用小动物活体成像示踪线粒体体内分布，并通过胡须运动分析、神经电生理检测及免疫荧光染色，评估其神经修复作用。 结果 成功制备Mito@LNP，线粒体封装效率达89.4%。与游离线粒体相比，LNP能提高PC12细胞对线粒体的摄取效率(P＜0.05)。在氧化应激条件下，相比游离线粒体，Mito@LNP更能有效维持PC12细胞ATP生成(P＜0.001)及线粒体膜电位(P＜0.05)，提升细胞存活率(P＜0.05)。体内示踪表明，Mito@LNP 在神经损伤部位的滞留与富集能力更强(P＜0.05)。接受Mito@LNP治疗的大鼠，其胡须运动功能(P＜0.001)及复合肌肉动作电位(compound muscle action potential，CMAP)恢复情况(P＜0.05)均显著优于游离线粒体治疗组。免疫荧光染色显示，Mito@LNP能上调损伤神经组织中NF200(P＜0.001)和S100β(P＜0.05)的表达。 结论 Mito@LNP 通过提升线粒体递送效率，促进了大鼠面神经挤压伤后的修复及功能重建，疗效优于游离线粒体。

Abstract

Background Since early mitochondrial dysfunction constrains facial nerve regeneration, improving the therapeutic outcomes of mitochondrial transplantation through optimized delivery methods has become a primary research focus. Objective To construct lipid nanoparticles (LNP)-encapsulated engineered mitochondria (Mito@LNP) and evaluate their reparative effects in a rat buccal branch facial nerve crush injury model. Methods LNP was prepared by thin film hydration-extrusion method. Mitochondria were isolated from human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSC) and formulated into Mito@LNP. In vitro, PC12 cells were used to assess cytotoxicity, cellular uptake, and protection against H₂O₂-induced oxidative damage. In vivo, a rat buccal branch facial nerve crush model was established, and Mito@LNP was administered locally via subepineurial injection at the injury site. Small animal in vivo optical imaging system was employed to track mitochondrial distribution. Whisker movement analysis, electrophysiological testing, and immunofluorescence staining were performed to evaluate its neural repair effects. Results Mito@LNP was successfully fabricated, achieving a mitochondrial encapsulation efficiency of 89.4%. Compared with free mitochondria, LNP encapsulation enhanced mitochondrial uptake by PC12 cells (P＜0.05). Under oxidative stress, Mito@LNP more effectively maintained ATP production (P＜0.001) and mitochondrial membrane potential (P＜0.05) in PC12 cells, thereby markedly improving cell viability (P＜0.05). In vivo tracking indicated stronger retention and accumulation of Mito@LNP at the injured nerve (P＜0.05). Rats treated with Mito@LNP showed substantially better recovery of whisker function (P＜0.001) and compound muscle action potential (CMAP) parameters (P＜0.05) than those receiving free mitochondria. Immunofluorescence staining further demonstrated that Mito@LNP significantly upregulated NF200 (P＜0.001) and S100β (P＜0.05) expression in injured nerve tissue. Conclusion Mito@LNP markedly enhances repair and functional recovery after facial nerve crush injury in rats by improving mitochondrial delivery efficiency, and exhibits superior efficacy compared with free mitochondria.

Graphical abstract

关键词

面神经 / 线粒体 / 脂质纳米颗粒 / 神经再生 / 大鼠

Key words

facial nerve / mitochondrial / lipid nanoparticles / nerve regeneration / rats

面神经损伤是导致临床面瘫的主要原因，常表现为口角歪斜、闭眼不全及面部表情活动受限，给患者带来极大心理与社会负担。目前主要修复手段包括药物、康复治疗及显微外科手术。但即便完成神经修复或吻合，术后恢复往往周期漫长、效果有限，部分患者还可能遗留联动或面部肌肉挛缩等后遗症^[1]。轴突的远端再生与再髓鞘化是高度耗能的生物学过程^[2]，而损伤后的局部氧化应激会加剧线粒体功能障碍，导致ATP供应不足并可能引发细胞凋亡，成为制约神经结构重建与功能恢复的关键^[3-5]。因此，在损伤早期改善局部能量代谢、减轻线粒体相关的继发性损伤，为面神经损伤修复提供了新的思路。线粒体移植是一种以生物能量补充为核心的新兴策略，通过向受损组织递送外源性活性线粒体，为细胞存活与再生提供代谢支持^[6-7]。然而，该技术进一步应用仍面临诸多关键挑战。游离线粒体在体内环境中稳定性有限^[8]，难以保证活性线粒体及时进入胞内。此外，线粒体表面同细胞膜一样天然带负电，跨越细胞膜屏障效率低下，导致细胞摄取不足。并且在损伤区域滞留时间短，难以形成持续有效的局部暴露^[9]。

脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle，LNP)具有良好的生物相容性与膜融合能力，其表面电荷、粒径等关键参数可以通过配方设计进行调控，从而改善体内分布特征、提高细胞摄取效率^[10-11]。近年来，LNP在核酸药物及疫苗递送中的应用已具备安全性和可行性基础，显示出良好的生物活性物质保护能力和较高的体内递送效率^[12-13]。基于上述特点，LNP可考虑作为线粒体递送的一种载体选择。本研究构建了负载人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC)来源线粒体的LNP递送体系，并在PC12细胞模型与大鼠面神经挤压伤模型中对其递送特性及神经修复潜力进行评价，旨在为线粒体移植用于面神经损伤治疗的临床转化研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

hUCMSC(Shownin，产品号RC02003)；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系高分化PC12细胞(iCell，产品号iCell-r024)；hUCMSC完全培养基(Shownin，产品号RP02010)；RPMI 1640培养基(Gbico，产品号C11875500BT)；胎牛血清(Excell，产品号FSD500)；细胞消化液 (YangGuangBio，产品号C228155)；(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵[(2,3-Dioleyl-propyl)-trimethylamine，DOTAP](AVT，产品号O02002)；二硬脂酰磷脂酰胆碱(1,2-Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)(AVT，产品号S01005)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-MPEG2000)(AVT，产品号F01008)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-异硫氰酸酯荧光素(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[(polyethylene glycol)-2000)]-fluorescein isothiocyanate，DSPE-PEG2000-FITC) (AVT，产品号F05002)；Hoechst 33342活细胞染色液(Beyotime，产品号C1029)；CCK-8试剂盒(Beyotime，产品号0037)；线粒体提取试剂盒(Thermo，产品号89874)；BCA法蛋白定量试剂盒(YangGuangBio，产品号C190501)；ATP检测试剂盒(Beyotime，产品号S0027)；Mitotracker Red CMXRos(Beyotime，产品号C1035)；4%多聚甲醛固定液(Beyotime，产品号P0099)；冷冻切片包埋剂(SAKURA，产品号4583)；冰冻切片机(Leica，产品号CM1950)；封闭山羊血清(Solarbio，产品号SL038)；5%BSA封闭液(Solarbio，产品号SW3015)；甘氨酸(Solarbio，产品号G8200)；DAPI染色液(Beyotime，产品号C1006)；抗TOM20抗体(Proteintech，产品号66777-1-Ig)；抗β-actin抗体(Proteintech，产品号66009-1-Ig)；抗S100β抗体 (Abcam，产品号AB52642)；抗NF200抗体(Sigma-Aldrich，产品号N0142)；Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(Abcam，产品号AB150117)；Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG(Invitrogen，产品号A-11012)。

1.2 细胞培养

hUCMSC培养于hUCMSC专用培养基，PC12细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。所有细胞均置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。待细胞生长至80% ~ 90%汇合度时传代。

1.3 LNP制备与表征

采用薄膜水化法结合微孔挤出法制备LNP及FITC标记的LNP(FITC-LNP)。按DSPC：DOTAP：DSPE-mPEG2000(制备FITC-LNP时以DSPE-PEG2000-FITC替代)摩尔比1∶4∶0.1称取各脂质组分。溶解于混合有机溶剂体系(二氯甲烷20 mL+甲醇10 mL)。将溶液转移至1 L圆底烧瓶，于旋转蒸发仪(50°C，120 rpm)中减压蒸发30 min，至瓶壁形成均匀脂质薄膜。向含脂质薄膜的烧瓶中加入6 mL去离子水，在室温(25±2)℃条件下以120 rpm恒速旋转水化30 min，使脂质膜充分溶胀脱落。将粗分散体系注入脂质体挤出器，使用800 nm聚碳酸酯滤膜进行10次循环挤压，最终获得粒径均一的LNP。制备完成后的样品于4℃避光保存备用。利用小动物活体成像系统对含有FITC-LNP的离心管进行荧光成像，以确认荧光分子的成功负载。采用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)技术检测其粒径分布、多分散指数(polydispersity index，PDI)以及Zeta电位，并通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察其形貌特征。

1.4 CCK-8法检测LNP的细胞毒性

将PC12细胞96接种于孔板中。待细胞贴壁后，加入含有不同浓度LNP(0、5、10、25、50、100 μg/mL)的完全培养基。孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续于培养箱内孵育2 h。酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度，并计算细胞相对存活率。

1.5 线粒体提取及鉴定

hUCMSC培养至第三代时按试剂盒说明书提取线粒体。收集细胞并加入试剂A与C进行冰浴裂解。匀浆液于4°C、700×g离心10 min，收集上清液于12 000×g离心15 min得到线粒体沉淀。所得线粒体经试剂C洗涤重悬后离心，即得到高纯度线粒体，采用BCA法进行蛋白定量。通过TEM观察纯化线粒体的结构，采用ATP检测试剂盒定量分析线粒体的能量合成水平。采用Western blot检测线粒体外膜蛋白TOM20及细胞质标志蛋白β-actin的表达水平，验证提取物纯度。

1.6 Mito@LNP的制备与表征

将上述制备好的LNP悬浮液与新鲜提取的线粒体(按总脂质与线粒体蛋白质量比2∶1)混合。在4℃环境下，利用恒温振荡器以低速(50 rpm)轻柔孵育30 min。随后，通过离心(4℃，12 000×g，10 min)除去未包封的游离LNP，所得沉淀即为Mito@LNP。DLS测定其粒径分布、PDI及Zeta电位。为验证封装过程对线粒体蛋白组分的影响，采用SDS-PAGE蛋白电泳对比Mito@LNP与游离线粒体的蛋白质谱。利用流式细胞术定量评估LNP对线粒体的封装效率。

1.7 细胞摄取实验

提前将细胞爬片置入24孔板内，后将PC12细胞接种于24孔板中。待细胞贴壁后弃去原培养基，加入不同浓度的FITC-LNP(5 μg/mL、10 μg/mL，以完全培养基混匀)，培养箱中孵育2、4 h。孵育结束后，吸除培养液，用PBS轻柔洗涤爬片3遍以清除未摄取的游离颗粒。Hoechst 33342染核后封片，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。利用Mitotracker Red预染线粒体，设立空白对照(Con)、游离线粒体(Mito)、Mito@LNP及双荧光标记的FITC-Mito@LNP四组进行对比实验，通过荧光显微镜观察各组线粒体摄取情况。

1.8 PC12细胞损伤模型

PC12细胞接种孔板，贴壁后，H₂O₂(200 μmoL)诱导24 h构建氧化应激模型。弃去培养基，分别换用含有PBS、Mito、Mito@LNP、FITC-Mito@LNP的新鲜培养基继续孵育24 h，各治疗组线粒体蛋白浓度保持一致，正常对照组(control，Con)同步更换新鲜培养基继续孵育。给药结束后，向各孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续于培养箱内孵育2 h。酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度，并计算细胞相对存活率。

1.9 化学发光法检测细胞内ATP水平

细胞处理及实验分组同1.8节。收集处理后的细胞，加入裂解液充分裂解并于4℃离心取上清。酶标仪测定各组样品与检测工作液反应后的化学发光强度，根据标准曲线计算ATP含量。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对各样本进行蛋白定量，最终计算单位蛋白的ATP含量，并以相较于对照组的比值进行各组比较。

1.10 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位

利用JC-1荧光探针评价线粒体功能的恢复程度。PC12细胞接种孔板，贴壁后H₂O₂(200 μmoL)处理12 h诱导损伤，弃去培养基后用含有PBS、Mito、Mito@LNP的新鲜培养基继续孵育12 h，正常对照组(Con)同步更换新鲜培养基孵育。各组加药处理完成后的细胞爬片用PBS洗涤，加入JC-1工作液于37°C避光孵育20 min。荧光显微镜观察拍照，ImageJ软件分析各组荧光强度，计算红/绿荧光强度比值。

1.11 实验动物与分组处理

24只6 ~ 8周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分组分为4组：对照组(Sham)、挤压伤组(Crush)、游离线粒体治疗组(Mito)、LNP封装线粒体治疗组(Mito@LNP)，每组6只。大鼠经腹腔注射4%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，固定于手术台上，剃毛、碘伏消毒。沿右侧耳前至下颌缘方向纵行切口，钝性分离皮下组织，显露并暴露面神经颊支。15号持针器扣至第三扣夹持30 s，松开后邻近部位再次夹持30 s。损伤模型构建完毕后用胰岛素针束膜下注射PBS、Mito、Mito@LNP，线粒体用量为80 μg/只。术毕缝合皮肤，术区再次碘伏消毒。动物麻醉苏醒后，按组编号分笼饲养于通风良好、温度恒定(22 ~ 25℃)、12 h光照/黑暗循环条件下的笼箱中，提供自由摄食与饮水。所有动物实验均经北京迈德康纳实验动物伦理委员会批准(批号：MDKN-2024-127)。

1.12 小动物成像示踪线粒体体内分布

hUCMSC线粒体经Mitotracker预染，大鼠面神经损伤后束膜下注射Mito@LNP，Mito和PBS(n=3)。术后48 h大鼠置于小动物活体成像系统中，以观察线粒体荧光信号分布，Living Image软件定量测量信号强度。

1.13 行为学评估

手术后14 d，将大鼠固定于桌面，于清醒状态下进行视频采集，记录其胡须摆动情况。视频采集完成后，选取胡须摆动幅度最大的2帧图像，采用Image J软件对患侧与健侧胡须运动幅度进行定量，并计算患侧/健侧的比值作为功能恢复指标用于后续统计分析。

1.14 面神经电生理检测复合肌肉动作电位

手术后14 d将大鼠麻醉，暴露面神经干及其分支，同时暴露健侧作为自身对照。将刺激电极置于面神经出茎乳孔处的近端神经干，将记录电极插入触须垫肌群，接地电极置于大鼠尾部。从0 mA开始逐渐增加刺激强度，直至激发出波幅不再增加的最大复合肌肉动作电位(compound muscle action potential，CMAP)。记录双侧面神经的CMAP，分析双侧的潜伏期和波幅，以患侧/健侧的比值用于后续统计分析。

1.15 面神经免疫荧光染色检测NF200、S100β表达情况

术后14 d，大鼠麻醉后取损伤段面神经颊支。组织于4%多聚甲醛中固定24 h，随后依次转入15%和30%蔗糖溶液中进行梯度脱水，直至组织完全沉底。组织用OCT包埋剂包埋，通过冷冻切片机进行横切(切片厚度为10 μm)，切片置于-20°C保存备用。切片取出后于室温下复温，PBS洗去包埋剂。组化笔在组织周围绘制疏水圈，随后在圈内滴加50 μL封闭液(1%BSA+10%封闭山羊血清+0.3 mol/L甘氨酸)，室温封闭2 h。弃去封闭液，加入封闭液稀释好的NF200(1∶300)与S100β(1∶200)一抗混合液，4°C过夜孵育。次日，PBS洗涤后，加入相应的荧光二抗并在室温下继续孵育2 h。随后DAPI染核15 min，PBS洗涤3次后，小心吸干组织周围水分并滴加抗荧光淬灭封片剂。用全景共聚焦扫描仪对样品成像，采用ImageJ软件定量分析各组切片中NF200与S100β的阳性细胞密度。

1.16 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.0软件对实验数据进行分析。计量资料以平均值±标准误的形式呈现。两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析(两两比较采用Tukey检验)。所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复至少3次。

2 结果

2.1 LNP的制备与理化性质表征及细胞摄取验证

为获得稳定且可用于递送的纳米载体，采用薄膜水化法结合微孔挤出技术制备了LNP(图1A)。通过引入荧光标记脂质DSPE-PEG2000-FITC方便后续细胞摄取示踪，荧光成像显示FITC-LNP具有强烈的绿色信号(图1B)。TEM显示，LNP与FITC-LNP均呈规整的球形结构，轮廓清晰，未见明显塌陷或聚集(图1C)。DLS分析表明，LNP与FITC-LNP的平均粒径分别为(539.6±27.6) nm与(513.7±16.1) nm，PDI均＜0.2，显示出优异的单分散性(图1D)。两类LNP表面均带约+40 mV的正电荷(图1E)，有助于其与带负电的线粒体和细胞膜发生静电吸附，实现高效线粒体封装和细胞摄取。CCK-8实验表明，即使在100 μg/mL的高浓度下，两类LNP仍保持极低的细胞毒性(图1F)。细胞摄取实验显示，随着处理浓度及孵育时间的增加，胞内FITC信号强度明显提升，提示FITC-LNP可以被细胞高效摄取(图1G)。以上结果表明，DSPC、DOTAP、DSPE-mPEG2000 3组分合成的脂质体是理想的线粒体封装和摄取载体。

2.2 Mito@LNP的制备与表征

通过差速离心法从hUCMSC中获取了纯化的线粒体(图2A)。TEM显示，提取的线粒体呈现典型的双层膜结构和清晰的线粒体嵴，表明其形态结构保持完整(图2B)。Western blot分析结果进一步证实，线粒体外膜标志蛋白TOM20在提取的线粒体组分中高度富集，而细胞骨架蛋白β-actin含量相对较低，证明所提取的线粒体具有高纯度(图2C)。为了评估分离线粒体的代谢功能，检测了不同质量线粒体的ATP合成能力。结果显示，ATP产量随线粒体浓度的增加呈线性升高(P＜0.001，图2D)。用LNP对纯化的线粒体进行封装。Zeta电位检测显示，Mito表面带负电(-38.67±2.03) mV，而经阳离子LNP包裹后，Mito@LNP和Mito@FITC-LNP的表面电位上升至约+40 mV(P＜0.001)，这有利于其与带负电荷的细胞膜相互作用(图2E)。此外，由于LNP层的覆盖，Mito@LNP的粒径较Mito略有增加(P＜0.05，图2F)。为了验证LNP对负载线粒体的封装效率，利用FITC-LNP与Mitotracker Red标记的线粒体进行共定位分析。流式细胞术结果显示，双阳性信号占比达到89.4%，证实了LNP对线粒体的高效封装(图2G)。最后，SDS-PAGE蛋白电泳结果显示，Mito@LNP与原始线粒体的蛋白图谱高度一致，表明工程化修饰过程并未破坏线粒体的核心蛋白组分(图2H)。以上结果表明，线粒体提取成功且保持结构和功能，LNP封装有效改变了表面电荷并且未破坏线粒体的核心蛋白组成。

2.3 Mito@LNP的细胞摄取及其对氧化应激损伤的保护

PC12细胞分离自大鼠嗜铬细胞瘤，是一种理想的体外神经元模型。线粒体用Mitotracker Red预染后与LNP负载，同PC12细胞共孵育4 h。结果显示，Mito@LNP与Mito@FITC-LNP组的线粒体红色荧光强度没有统计学差异(P＞0.05)，且高于Mito组(P＜0.05，图3A、图3B)。提示在具备同样的理化性质前提下，LNP与FITC-LNP具备等同的递送效率。在H₂O₂诱导的氧化损伤模型中，Mito@LNP可挽救细胞活力(P＜0.001)，效果优于游离Mito组(P＜0.01，图3C)。同时，Mito@LNP有效逆转了氧化应激导致的ATP耗竭(P＜0.001，图3D)。进一步通过JC-1荧光染色检测线粒体膜电位(图3E、图3F)，结果显示H₂O₂导致严重的线粒体膜电位受损(P＜0.001)，而Mito@LNP处理组的红/绿荧光比值回升(P＜0.001)，线粒体膜电位恢复水平优于游离Mito组(P＜0.05)。以上结果表明，LNP封装提升了外源线粒体向PC12细胞的递送效率，并在氧化损伤模型中证实，Mito@LNP能够有效恢复细胞的活力、ATP水平及线粒体膜电位，从而成功重建受损细胞的线粒体稳态。

2.4 Mito@LNP 促进面神经损伤后的功能恢复与神经再生

通过局部面神经束膜下注射将预染线粒体注入大鼠面神经颊支损伤段(图4A)。动物体内的荧光成像及定量分析显示，与游离线粒体(Mito)组相比，Mito@LNP组在损伤部位表现出更高的辐射效率(P＜0.05)，表明LNP封装有效增强了线粒体在靶区域的滞留与生物利用度(图4B)。随后，建立面神经颊支挤压伤模型并观察大鼠胡须运动来评价功能恢复情况(图4C、图4D)。结果显示，在神经挤压伤(Crush组)后，大鼠的胡须摆动幅度下降(P＜0.001)。虽然游离线粒体治疗(Mito组)在一定程度上缓解了功能障碍(P＜0.05)，但Mito@LNP组的胡须摆动角度比值(患侧/健侧)明显优于Crush组和Mito组(P＜0.001)。神经电生理结果显示，Mito@LNP处理缩短了由于神经损伤导致的CMAP相对潜伏期延长(P＜0.001)，并提升了CMAP相对波幅(P＜0.001)，其效果均优于游离Mito组(P＜0.05，图4F)。最后，通过免疫荧光染色(轴突标记物NF200和髓鞘标记物S100β)观察了面神经横截面的组织修复情况(图4G)。荧光定量分析显示，Crush组中NF200、S100β表达降低(P＜0.001)，而Mito@LNP处理提高了两者的表达(P＜0.001，图4H)。以上结果表明，Mito@LNP能够提高组织局部线粒体的递送效率，促进面神经损伤后的电生理指标恢复、运动功能改善以及神经纤维的结构再生。

3 讨论

面神经是以运动功能为主导、兼具末梢分支结构的周围神经。与坐骨神经等混合神经相比，面神经远端分支较细，支配的面部表情肌功能精细，对轴突再生后的准确靶向支配要求较高^[14]。即使神经连续性得到恢复，仍可能因轴突错配再生而出现面部运动功能恢复不佳、联带运动等后遗症^[1,15]。因此，提升损伤后轴突再生质量，是面神经修复领域亟需解决的关键问题。

除形态学层面神经连续性重建外，在损伤早期有效维持轴突与施旺细胞的代谢活性，对于保障高质量的神经再生至关重要^[16]。既往研究表明，周围神经损伤后局部轴突运输受阻、内源性线粒体动力学异常，引发生物能量危机，直接阻碍轴突生长锥的推进及远端神经肌肉接头的突触重塑^[4,17-18]。同时，施旺细胞在去髓鞘与再髓鞘化过程中对能量供给高度依赖，线粒体功能障碍则显著影响其增殖、迁移及神经营养因子分泌能力，从而削弱其对再生轴突的导向与支持作用^[19-21]。基于上述病理生理特征，通过外源性线粒体递送重建损伤局部能量稳态，从代谢层面调控神经再生微环境，为面神经修复提供了新思路。

作为一种大尺度细胞器，线粒体的跨膜递送效率直接决定了其生物学效能。如何提高外源线粒体的细胞摄取效率并维持其生物活性，仍是线粒体移植领域面临的重要挑战。传统的物理递送技术(如微注射、微流控及MitoPunch等)虽在体外单细胞操作中效率较高，但因其依赖特定设备，无法应用于活体组织修复^[22-24]。在化学修饰方面，细胞穿膜肽等表面修饰虽能促进摄取，但多属于表面物理吸附，缺乏对线粒体在细胞外复杂环境中的屏障保护^[25]。而天然外泌体载体虽生物相容性尚可，但由于其自身尺寸限制，对线粒体的包裹效率相对较低^[26-27]。本研究采用LNP对线粒体进行封装，一方面有助于减弱线粒体与细胞膜之间的静电排斥作用，增强细胞摄取效率；另一方面，LNP形成的脂质包裹层可在一定程度上为外源线粒体提供保护，提高其在细胞外环境中的稳定性。体外实验证实，Mito@LNP复合物具有较高的线粒体封装效率，且PC12细胞对其摄取效率明显优于游离线粒体。更重要的是，在H₂O₂诱导的氧化应激模型中，Mito@LNP处理显著提升了细胞内ATP水平并稳定了线粒体膜电位。以上研究结果提示，经LNP封装的外源性线粒体不仅能更充分被细胞摄取，在进入细胞后仍能保持一定的功能活性，可有效缓解应激状态下的细胞能量短缺，为神经修复提供必要的代谢支撑。

周围神经损伤后的再生是一个复杂的生物学过程，并非仅依赖于轴突延伸，还高度依赖于施旺细胞的表型重编程、增殖迁移及随后的再髓鞘化。本研究体内实验结果表明，Mito@LNP处理后大鼠胡须运动功能及CMAP电生理指标均显著改善，提示其促进面神经功能恢复。活体荧光示踪提示，Mito@LNP在损伤部位具有更高的局部滞留水平，这可能与LNP封装后形成的脂质包裹层有关。一方面，LNP可避免线粒体直接暴露于组织液环境，降低其被降解及清除的风险；另一方面，LNP介导的表面电位改变增强了线粒体与细胞膜及周围组织成分的相互作用，提高其在损伤区域的滞留能力和细胞摄取效率。组织学结果提示，Mito@LNP处理后损伤段面神经组织中NF200和S100β表达均显著升高。NF200是成熟轴突细胞骨架的重要组成成分，S100β则主要由施旺细胞表达，与施旺细胞活化、增殖及再髓鞘化过程密切相关^[28-29]。NF200和S100β表达水平变化提示Mito@LNP同时促进了轴突再生和施旺细胞介导的再髓鞘化过程。值得注意的是，尽管游离线粒体在体内环境中稳定性有限，难以保证其高效进入胞内，但体内实验中Mito组仍呈现出优于Crush组的修复趋势。这可能是由于在损伤早期的代谢应激状态下，即便仅有极少量的外源线粒体被成功内吞，但其仍可在关键窗口期触发内源性修复程序的启动。然而，这种效应在后期阶段逐渐减弱，难以持续满足神经再生所需的能量与代谢需求。此外，损伤局部逐步形成的抑制性微环境可能抵消线粒体疗法在早期阶段带来的获益，最终限制整体修复效能^[30]。与裸露线粒体比较，LNP封装可有效提升线粒体在损伤部位的滞留时间与递送效率。这种持续且高效的能量代谢干预，可能是Mito@LNP处理实现显著神经功能恢复与结构重建的关键。

尽管Mito@LNP在大鼠面神经修复中展现出良好前景，但仍面临多重挑战。首先，本研究采用的hUCMSC来源线粒体涉及异种移植。虽然线粒体本身免疫原性较低，但线粒体DNA及损伤相关分子模式仍是否激活宿主免疫应答尚不明确。同时LNP可能引发局部炎症或补体激活，长期生物安全性需系统评估^[31-33]。其次，本研究仅采用损伤后即刻单次给药方案，未能涵盖剂量梯度与干预窗口期的动态变化。考虑到周围神经损伤后复杂的病理演变过程，外源线粒体补充的最佳治疗时机与剂量阈值仍需进一步明确。此外，线粒体制剂的长期赋存稳定性、冻存复苏后的活性保持以及LNP规模化制备的质量控制，也是后续大规模应用亟待解决的问题。

综上所述，本研究成功构建了基于LNP的工程化线粒体递送系统，在PC12细胞及大鼠面神经模型中证实了其良好的神经保护与促再生效能。不仅为解决线粒体递送效率低下的瓶颈提供了新方案，也为面神经损伤的临床干预和再生研究提供了有益参考。

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基金资助

北京市自然科学基金项目(L254019)