金黄色葡萄球菌外囊泡通过调控Toll样受体通路激活破骨细胞驱动感染性骨破坏的研究

Staphylococcus aureus extracellular vesicles drive infectious bone destruction by activating osteoclasts via modulation of toll-like receptor pathways

摘要

背景 金黄色葡萄球菌是骨感染的常见病原体之一，可通过多种途径过度激活破骨细胞，导致骨破坏，然而其外囊泡能否发挥关键致病作用尚未明确。 目的 明确金黄色葡萄球菌外囊泡对破骨细胞的激活效应及具体表型变化，深入探索金葡菌外囊泡浓度与骨破坏的关联及潜在生物学机制。 方法 通过切向流过滤系统结合超速离心法提取金黄色葡萄球菌外囊泡，透射电子显微镜及纳米颗粒追踪分析表征其形态、粒径分布及Zeta电位。分离小鼠骨髓来源单核/巨噬细胞，在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)与核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)诱导下建立破骨细胞分化模型，设置不同浓度金黄色葡萄球菌外囊泡处理组(0、0.6、6、60 μg/mL)及对照组。通过TRAP染色和CCK-8细胞毒性实验评估破骨细胞分化及活力变化，采用实时荧光定量PCR检测破骨细胞功能相关基因的表达。选取6 μg/mL外囊泡处理组与对照组进行转录组测序分析，解析相关信号通路。进一步通过小鼠股骨髓腔注射建立体内模型，设置外囊泡处理组与PBS对照组，采用Micro-CT及CTSK免疫荧光染色评估破骨细胞激活及骨破坏情况。 结果 成功分离获得具有典型囊泡结构的金黄色葡萄球菌外囊泡，其粒径主要分布于100 ~ 400 nm，Zeta电位介于-30 ~ -10 mV，提示其具备良好胶体稳定性。体外实验显示，与对照组相比外囊泡处理显著促进破骨细胞分化和多核融合，TRAP阳性细胞数量及面积随外囊泡浓度升高而增加，在6 μg/mL组达到峰值(P＜0.01)。CCK-8结果表明，0.6 ~ 6 μg/mL外囊泡可显著提高破骨细胞活力(P＜0.01)，而60 μg/mL时该促进作用减弱。RT-qPCR分析显示，Acp5、Dc-stamp、Ctsk和Mmp9 mRNA水平均在外囊泡干预后显著上调，其中6 μg/mL组表达最高均(P＜0.01)。转录组学分析鉴定出161个差异表达基因，上调基因主要富集于炎症反应、Toll样受体信号通路及破骨细胞分化相关通路。体内实验结果显示，与对照组相比，外囊泡处理组股骨骨密度降低约23%，骨小梁数量和厚度分别减少约30%和20%(均P＜0.001)，同时骨组织中CTSK阳性信号显著增强(P＜0.001)，提示破骨细胞活性显著升高。 结论 金黄色葡萄球菌外囊泡可通过激活Toll样受体通路，驱动破骨细胞的激活与分化，导致感染性骨破坏。

Abstract

Background Staphylococcus aureus, a common pathogen in bone infections, can excessively activate osteoclasts through various pathways, leading to osteolytic destruction. However, whether its secreted outer membrane vesicles play a pivotal pathogenic role in this process remains unclear, and the underlying mechanisms warrant further investigation. Objective To systematically define the osteoclast-activating effects and phenotypic remodeling induced by Staphylococcus aureus extracellular vesicles, and explore the dose-dependent association between extracellular vesicle burden and bone destruction, together with the underlying biological mechanisms. Methods Staphylococcus aureus extracellular vesicles were isolated using a tangential flow filtration system combined with ultracentrifugation, and their morphology, size distribution, and zeta potential were characterized by transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis. Bone marrow–derived monocytes/macrophages were isolated from mice and induced to differentiate into osteoclasts in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL). Cells were treated with different concentrations of Staphylococcus aureus extracellular vesicles (0, 0.6, 6, and 60 μg/mL) or vehicle control. Osteoclast differentiation and cellular viability were evaluated by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and CCK-8 assays, respectively, while the expression of osteoclast-related functional genes was assessed by quantitative real-time PCR. Transcriptomic profiling was performed to compare the 6 μg/mL extracellular vesicle-treated group with the control group, followed by pathway enrichment analysis. Furthermore, an in vivo mouse model was established by intramedullary injection of extracellular vesicles into the femur, with phosphate-buffered saline as a control. Bone destruction and osteoclast activation were evaluated using micro-computed tomography and cathepsin K (CTSK) immunofluorescence staining. Results Staphylococcus aureus extracellular vesicles with typical vesicular morphology were successfully isolated, exhibiting a size distribution predominantly ranging from 100 to 400 nm and a zeta potential between -30 and -10 mV, indicating good colloidal stability. In vitro experiments demonstrated that, compared with the control group, extracellular vesicle treatment significantly promoted osteoclast differentiation and multinucleation, with the number and area of TRAP–positive cells increasing in a concentration-dependent manner and peaking at 6 μg/mL (P＜0.01). CCK-8 assays revealed that extracellular vesicles at concentrations of 0.6 - 6 μg/mL significantly enhanced osteoclast viability (P＜0.01), whereas this stimulatory effect was attenuated at 60 μg/mL. RT-qPCR analysis showed that the mRNA expression levels of Acp5, Dc-stamp, Ctsk, and Mmp9 were significantly upregulated following extracellular vesicle treatment, with the highest expression observed in the 6 μg/mL group (all P＜0.01). Transcriptomic analysis identified 161 differentially expressed genes, with upregulated genes predominantly enriched in inflammatory responses, Toll-like receptor signaling pathways, and osteoclast differentiation-related pathways. In vivo, extracellular vesicle-treated mice exhibited a significant reduction in femoral bone mineral density (23%), accompanied by decreases in trabecular number (30%) and trabecular thickness (20%) compared with controls (all P＜0.001). Consistently, CTSK-positive signals in bone tissue were markedly increased in the extracellular vesicle-treated group (P＜0.001), indicating markedly elevated osteoclast activity. Conclusion Staphylococcus aureus extracellular vesicles can establish a localized pro-inflammatory microenvironment by activating the Toll-like receptor pathway, thereby driving the activation and differentiation of osteoclasts and leading to the development of infectious bone destruction.

Graphical abstract

关键词

金黄色葡萄球菌 / 外囊泡 / 破骨细胞 / 骨感染疾病 / Toll样受体

Key words

staphylococcus aureus / extracellular vesicles / osteoclasts / bone diseases, infectious / toll-like receptors

感染性骨破坏是骨髓炎、感染性关节炎、创伤后骨感染及植入物相关感染等多种骨科疾病的共同病理基础，其主要特征表现为局部炎症反应持续存在、骨吸收显著增强以及骨组织结构的进行性破坏，是常见的并发症之一^[1-3]。骨骼的功能与稳态依赖平衡的骨重塑过程，该过程由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收构成，是贯穿生命周期的持续循环^[4]。骨重塑过程处于精密调控之下，其失衡会破坏骨骼结构并导致各种骨相关疾病^[5-7]。在骨感染环境中，金黄色葡萄球菌始终是破坏性、侵袭性最强的致病菌，严重打破骨平衡状态，导致破骨细胞活性异常亢进，造成骨质流失及严重的骨破坏现象^[8-9]。破骨细胞是唯一负责骨组织吸收的多核巨细胞，来源于造血干细胞的单核-巨噬细胞谱系，在维持骨重建中起核心作用^[10-12]。研究表明，骨微环境中的核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)会启动破骨细胞分化过程^[13-14]。在历经一系列活化、增殖、融合以及成熟阶段之后，最终分化的多核破骨细胞能够分泌耐酒石酸盐酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)、组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)和基质金属肽酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)等蛋白酶和酸性物质，加剧骨破坏现象的发生^[15]。细菌外囊泡作为细菌衍生的小分子活性物质，具有结构稳定性高、有效循环时间长等优点，被认为是细菌间相互作用以及细菌与宿主间相互作用的关键新媒介^[16]。细菌外囊泡是细菌在生长过程中主动分泌到外部环境的纳米级膜性小泡，直径通常为20 ~ 400 nm，携带细菌来源的蛋白质、脂质、核酸、肽聚糖、毒素等活性分子^[17-18]。它不仅参与包括毒力因子运输、生物膜形成及抗生素抗性在内的多种细菌生物过程，同时在宿主的生物活动过程中也扮演着至关重要的角色^[17,19-20]。学者们对细菌外囊泡的分类、特性、生理病理结果及未来应用前景等方面有不断深入的理解，但金黄色葡萄球菌外囊泡在骨破坏中的作用机制仍待进一步研究^[21-23]。本研究旨在明确金黄色葡萄球菌外囊泡促进破骨细胞激活的生物学进程，进一步探索其调控感染性骨破坏的浓度规律，结合高通量组学技术和生物信息学技术揭示其潜在机制，为骨感染性疾病的防治提供新的视角和理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

金黄色葡萄球菌(BNCC186335)购自丰海生物；营养肉汤培养基购自索莱宝公司；α-MEM培养基、胎牛血清、0.25% Trypsin EDTA酶、PBS缓冲液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Corning公司；CCK8试剂盒、BCA试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；青霉素-链霉素双抗液购自美国Corning公司；鼠M-CSF因子、鼠RANKL因子、TRAP染色试剂盒购自杭州炀明生物有限公司；光学显微镜购自德国Leica公司；NTA纳米颗粒追踪分析仪购自德国Particle Metrix公司；自动蛋白浓度仪购自美国Luminex公司；透射电子显微镜购自日本JOEL公司；酶标仪购自Tecan infinite m200 pro公司。

1.2 细菌培养和外囊泡的提取

将35 g营养肉汤培养基与2 L超纯水配制培养基，用玻璃棒搅拌均匀，用纱布、带阀气袋、耐高温皮筋密封封口，高温液体灭菌后，将扩充后的100 mL菌液放入2 L细菌培养基，加入40 mg氯霉素。放入恒温摇床中，至培养基OD600达到1.0(约8 h后)，收集细菌培养基。先用离心机8 000 g，4℃离心20 min去除游离细菌，再用0.45 µm水系滤膜过滤泵对培养基进行抽滤，进一步去除游离的细菌。将去除菌体的细菌上清液放入5 L的烧瓶中。连接切向流过滤系统对细菌菌液进行浓缩，浓缩至60 mL后，停止浓缩。将其放入超速离心管中，100 000 g离心3 h后，弃上清，PBS重悬后离心100 000 g再次离心70 min，用1 mL PBS重悬即为最终提取的金黄色葡萄球菌外囊泡，冻存于-80℃中备用。

1.3 透射电镜鉴定金黄色葡萄球菌外囊泡

将提取的金黄色葡萄球菌外囊泡重悬于PBS中，取200目碳膜铜网，用镊子夹持边缘将20 μL外囊泡悬液滴加于铜网碳膜表面室温静置5 min，使囊泡充分吸附于碳膜上，用滤纸边缘轻轻接触铜网侧面，吸除多余液体，立即滴加20 μL 2%醋酸双氧铀染液于铜网上，染色2 min，用滤纸吸干表面染料。用蒸馏水洗涤铜网3次，室温干燥10 ~ 15 min，然后用透射电镜进行观察拍摄。

1.4 Zeta View粒径分析仪检测金黄色葡萄球菌外囊泡颗粒数

取5 μL原始金黄色葡萄球菌外囊泡悬液用超纯水按1∶1 000的比例进行稀释至5 mL，用标准品对仪器进行校准，无菌注射器将样品缓慢注入仪器，避免产生气泡，用Zeta View粒径分析仪检测，选择预设的程序对样品的颗粒数进行检测。用无菌双蒸水将仪器冲洗3 ~ 5次。

1.5 金黄色葡萄球菌外囊泡的粒径与Zeta电位检测

采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)仪检测金黄色葡萄球菌外囊泡的粒径与Zeta电位时，将样本与超纯水按1∶100比例混合制备1.5 mL稀释液，注入专用样品池后置入仪器，通过预设程序捕获并分析纳米颗粒的布朗运动，计算粒径分布，同时利用电泳光散射原理测定表面Zeta电位以评估胶体稳定性。

1.6 原代骨髓单核/巨噬细胞的提取及破骨细胞的诱导

采用颈椎脱臼法，处死6 ~ 8周龄的雌性C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡消毒。沿小鼠髂骨上沿剪一横向环形切口，利用无菌的剪刀和镊子分离出两侧股骨、胫骨，剪去骨的两端，保留骨干，暴露骨髓腔。1 mL注射器(胰岛素针头)抽取含10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM完全培养基后，插入骨髓腔冲洗直至骨头变白。冲洗下的细胞悬液用100 μm筛网过滤后1 400 r/min离心5 min，弃上清液，用α-MEM完全培养基重悬细胞，并在37℃，5% CO₂细胞培养箱孵育过夜。次日收集细胞1 400 r/min离心5 min，弃上清液，加入500 μL红细胞裂解液，吹打混匀90 s后加入PBS，离心弃上清液。用α-MEM完全培养基重悬细胞调整计数为1×10⁶/mL后种板培养24 h，弃悬浮细胞，PBS轻柔洗涤2次，用加有20 μL M-CSF的α-MEM完全培养基重悬后培养24 h，向培养基中加入1 μL RANKL因子。前体破骨细胞在RANKL干预24 h后出现，成熟破骨细胞在RANKL干预120 h后出现。

1.7 TRAP染色检测破骨细胞增殖分化能力

将培养皿中的破骨细胞弃上清液，用PBS冲洗1次，加入TRAP染色试剂盒固定液30 s后弃去，用PBS冲洗1次。室温下将试剂盒内各试剂按说明书比例配制成染液添加至培养皿中，37℃孵育1 h。弃去染色液，将培养皿中加入PBS，光镜下观察拍摄。

1.8 CCK8实验检测破骨细胞活力

CCK-8细胞活力检测按说明书进行。将细胞以适当密度接种于96孔板(每孔100 μL)，贴壁/恢复培养过夜后给予相应处理(对照组与实验组)，在预设时间点向每孔加入CCK-8试剂(一般为10 μL/孔)。混匀后避光37℃孵育1 ~ 2 h。随后使用酶标仪在450 nm波长测定各孔吸光度(OD450)，以培养基与CCK-8为空白孔进行扣除，并将处理组OD值相对于对照组进行归一化以计算细胞相对活力；各组设置≥3个复孔并重复独立实验。

1.9 实时荧光定量PCR检测破骨细胞相关基因表达情况

使用Trizol试剂提取破骨细胞总RNA，用紫外分光光度计测A260/A280 (1.8 ~ 2.0为合格)，琼脂糖电泳检验完整性，调整各样本RNA浓度一致。按体系加RNA、随机引物、反转录酶等，得到cDNA；设计引物(如Acp5、Ctsk、Dc-stamp、Mmp9等破骨相关基因)；以cDNA为模板，加入SYBR Green反应体系；进行qPCR扩增(95℃预变性，循环95℃变性、60℃退火延伸)；分析熔解曲线确认特异性；采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量，统计分析后绘图。引物信息见表1。

1.10 小鼠股骨切片免疫荧光染色

快速分离小鼠新鲜股骨，用生理盐水冲洗，浸入液氮中速冻30 s，用水溶性冷冻包埋剂-80℃包埋。使用粘合膜贴在骨组织切割面，用一次性碳化钨刀片切片，获得10 μm的完整切片，软硬组织均保存完好。切片洗涤与封闭：取出冰冻切片置于室温下10 ~ 30 min，然后再将切片放入盛有DPBS溶液的切片盒中以洗去包埋剂。在股骨切片周围用组化笔画一个疏水圈，在圈内滴加50 μL的封闭液，室温下封闭1 h。一抗孵育与洗涤：吸弃封闭液，在疏水圈内滴加稀释后的CTSK一抗(稀释液为封闭液，稀释比例均为1∶200，50 μL/疏水圈)，将冰冻切片放入切片孵育湿盒中并置于4℃冰箱孵育过夜，次日用DPBS洗涤5遍，每遍5 min。二抗孵育与洗涤：用荧光偶联二抗稀释液在室温下避光孵育切片30 min，随后用DPBS洗涤5遍，每遍5 min。染核与封固：在股骨周围滴加DAPI封固剂，随后盖上载玻片，将染色后的切片避光置于4℃冰箱保存并使用激光共聚焦显微镜拍照。

1.11 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0进行数据分析。采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性，符合正态分布的两组计量资料采用两独立样本t检验进行比较，多组计量资料比较采用单因素方差分析(两两比较采用Tukey检验)；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌外囊泡的鉴定与表征

本研究采用切向流过滤系统结合超速离心法^[18](图1A)从金黄色葡萄球菌对数期培养上清中成功分离出外囊泡。利用自动蛋白浓度仪检测所提取的金黄色葡萄球菌外囊泡浓度为600 μg/mL。透射电镜观察显示，所获囊泡呈典型的纳米级膜性囊泡结构，形态完整、边界清晰，多数为球形或近球形，部分可见特征性"盘状"或"杯状"凹陷(图1B)；粒径分布不均一，主要介于20 ~ 300 nm范围，呈离散或聚集分布。上述结果证实了外囊泡的有效提取，为后续功能研究奠定了基础。NTA分析显示，金黄色葡萄球菌外囊泡在水相体系中呈单一分散峰，数均粒径分布于100 ~ 400 nm范围，主峰位于150 nm处，与文献相关报道结果一致(图1C)；表面电位介于-30 mV ~ -10 mV，表明外囊泡表面携带负电荷，胶体稳定性良好，符合细菌外囊泡的典型电学特征^[24](图1D)。该粒径范围使其能够借助膜融合或内吞途径高效递送毒力因子至宿主细胞膜及胞内区室，为其在骨感染微环境中调控破骨分化提供了物理基础。

2.2 金黄色葡萄球菌外囊泡促进破骨细胞增殖与分化

本研究使用骨髓单核/巨噬细胞诱导分化为破骨细胞^[25]。在M-CSF扩增后分别用可溶性RANKL(对照组)与RANKL及金黄色葡萄球菌外囊泡(干预组)诱导，沿示意图时间轴追踪破骨前体细胞→早期破骨细胞→成熟破骨细胞的演变(图2A)。前期经全自动蛋白浓度仪器测量外囊泡的蛋白浓度为600 μg/mL，经过10倍浓度梯度稀释后的细胞毒性实验后，故采用0、0.6、6及60 μg/mL的浓度梯度对破骨细胞进行干预。TRAP染色可见，干预组破骨细胞中多核融合的细胞数量和融合体积均高于未添加组(0 μg/mL)，且6 μg/mL干预组的数目最多，融合体积最大(图2B)。定量分析显示，破骨细胞TRAP染色阳性区域面积及细胞数量亦随浓度的变化而发生改变，6 μg/mL时达到峰值(图2C)。CCK-8检测结果表明，金黄色葡萄球菌外囊泡能增强破骨细胞的增殖能力与代谢活性。该促进作用在0.6 μg/mL浓度时即显现出统计学差异性，并于6 μg/mL时达到峰值，而在60 μg/mL高浓度条件下则呈现轻微减弱趋势，提示金黄色葡萄球菌外囊泡在相关浓度规律下促进了破骨细胞增殖与分化，为其在感染微环境中造成骨破坏、加快骨吸收提供了体外实验依据(图2D)。

2.3 金黄色葡萄球菌外囊泡促进破骨细胞功能激活

不同浓度的金黄色葡萄球菌外囊泡可上调破骨细胞关键功能基因的表达，收集金黄色葡萄球菌外囊泡干预后的破骨细胞，对相关基因进行RT-qPCR分析发现：干预后Acp5、Dc-stamp、Ctsk及Mmp9的mRNA水平均显著升高(P＜0.01)，且峰值均出现6 μg/mL组；当浓度进一步增至60 μg/mL时，各基因相对表达量有所下降，提示其对破骨分化的促进作用存在“最适窗口”。该结果从分子水平证实，金黄色葡萄球菌外囊泡可通过增强酸性环境与信号表达(Acp5)、细胞多核化融合(Dc-stamp)、细胞迁移(Mmp9)和骨基质降解(Ctsk)相关基因转录，剂量依赖性地激活破骨细胞活性，为金黄色葡萄球菌导致骨破坏机制提供了新的介导路径(图3)。

2.4 金黄色葡萄球菌外囊泡激活破骨细胞的转录组学分析

对金黄色葡萄球菌外囊泡干预后的破骨细胞进行转录组学分析，图中EV组为6 μg/mL干预组，CON组为未干预组，结果显示，金黄色葡萄球菌外囊泡刺激使破骨细胞基因表达谱发生显著重编程：PCA呈现组内聚集、组间分离现象(图4A)；火山图筛选出161个差异基因(106个上调、55个下调)，上调TOP20基因均为趋化因子、白细胞介素及TNF超家族成员，提示金黄色葡萄球菌外囊泡构建出了促炎微环境(图4B)。GO分析显示破骨细胞高度参与免疫识别与炎症调控，具有活跃的分泌功能和细胞表面信号转导能力，反映了破骨细胞在金黄色葡萄球菌外囊泡刺激下，兼具抗原呈递和免疫调节的功能(图4C)；KEGG分析指向“细胞因子-细胞因子受体相互作用”“Toll样受体信号通路”及“破骨细胞分化”等核心轴，反映了金黄色葡萄球菌外囊泡增强破骨细胞的分化成熟与免疫激活能力(图4D)；其中NF-κB、破骨细胞分化等通路基因集显著激活，表明金黄色葡萄球菌外囊泡通过协同方式诱导破骨前体向成熟破骨细胞分化(图4E)。上述结果从转录水平证实，金黄色葡萄球菌外囊泡以免疫-代谢重塑方式强化破骨活性，使其兼具“骨破坏执行者”和“炎症放大器”双重身份，为靶向囊泡-破骨轴干预金黄色葡萄球菌感染性骨破坏提供了关键分子依据。

2.5 金黄色葡萄球菌外囊泡通过激活小鼠体内破骨细胞介导骨破坏

为明确金黄色葡萄球菌外囊泡激活破骨细胞导致的骨破坏效应，借鉴研究前期细胞实验等数据，采用6 μg/mL金葡菌外囊泡干预组与0 μg/mL对照组比较，通过骨髓腔穿刺法将金黄色葡萄球菌外囊泡注射至小鼠股骨内，4周后行Micro-CT扫描及三维重建分析(图5A)。结果显示，与0 μg/mL相比，6 μg/mL组股骨松质骨骨密度显著降低23.3%(300±10 mg/cc vs 230±15 mg/cc，P＜0.001)，骨小梁数量(Tb.N)减少30%(3.6±0.2 mm^-1vs 2.5±0.1 mm^-1，P＜0.001)，骨小梁厚度(Tb.Th)下降约20%(0.05±0.001 mm vs 0.04±0.003 mm，P＜0.001)，提示金黄色葡萄球菌外囊泡可独立诱导显著的骨量丢失(图5B)。免疫荧光染色进一步证实，干预组股骨骨小梁表面CTSK阳性荧光强度较对照组显著增强(P＜0.001)，且CTSK表达6 μg/mL组相较于0 μg/mL组升高1.9倍(图5)。该结果表明，金黄色葡萄球菌外囊泡可在体内诱导大量高活性破骨细胞沿骨小梁表面聚集。从组织学水平直接证明，外囊泡局部存在即可强效上调CTSK介导的程序，揭示其作为金黄色葡萄球菌“远程毒力载体”在感染性骨破坏中的关键激活作用，且此过程无需活菌持续存在即可维持。

3 讨论

金黄色葡萄球菌相关骨感染以持续性炎症反应和进行性骨组织破坏为主要病理特征，是临床上治疗难度较大的骨科疾病类型之一^[8,26-27]。既往研究多将感染性骨破坏的发生归因于活菌在骨组织内的持续定植、扩散及其引发的化脓性炎症反应。然而，随着对细菌分泌产物认识的不断深入，越来越多研究发现，在抗生素治疗后或细菌负荷显著降低的情况下，骨破坏过程仍可持续存在，提示除活菌本身外，仍存在其他重要的致病因素参与调控感染性骨破坏的进程^[28-31]。基于此背景，本研究聚焦于金黄色葡萄球菌外囊泡这一新型致病介质，系统探讨其在破骨细胞激活及骨破坏中的作用，并对相关实验结果进行整合分析。

首先，在体外实验层面，本研究明确证实金黄色葡萄球菌外囊泡能够显著促进破骨细胞的增殖与分化。TRAP染色结果显示，随着外囊泡浓度的增加，破骨细胞的多核化程度和融合体积明显增强，且在中等浓度(6 μg/mL)时达到峰值。这一结果提示，金葡菌外囊泡并非单纯诱导细胞应激或毒性反应，而是在一定浓度范围内主动驱动破骨前体细胞向功能成熟的破骨细胞分化。CCK‑8实验进一步表明，外囊泡处理可增强破骨细胞的代谢活性与存活能力，提示其在促进破骨分化的同时，并未抑制细胞活力。类似现象在其他细菌外囊泡研究中亦有报道，如革兰阴性菌外囊泡可通过递送炎症信号分子促进宿主细胞表型重塑，提示细菌外囊泡在宿主细胞调控中具有高度的生物学选择性^[32-34]。

其次，从分子水平来看，本研究发现外囊泡显著上调了多种与破骨细胞功能密切相关的关键基因表达。Acp5的升高反映了破骨细胞酸性微环境构建能力的增强；Dc‑stamp的上调提示外囊泡促进了破骨前体细胞之间的融合过程；而Ctsk与Mmp9的显著升高则直接指向骨基质降解能力的增强。这些结果在不同浓度外囊泡干预下呈现出一致的变化趋势，并在中等浓度时较为显著，提示其对破骨细胞功能的激活具有“剂量窗口效应”。这一现象在炎症介导的骨代谢研究中并不罕见，过低刺激不足以触发信号级联，而过高刺激则可能诱导负反馈调控或细胞功能抑制。本研究的结果进一步丰富了金黄色葡萄球菌外囊泡参与骨代谢调控的分子证据。

第三，转录组学分析为揭示金黄色葡萄球菌外囊泡介导破骨细胞激活的整体调控网络提供了系统性视角。差异基因分析显示，外囊泡刺激后破骨细胞的基因表达谱发生显著重塑，上调基因多集中于趋化因子、炎症因子及免疫相关分子。GO和KEGG富集分析进一步指出，Toll样受体信号通路、NF‑κB信号轴以及破骨细胞分化通路显著激活。这一结果提示，金黄色葡萄球菌外囊泡并非仅通过单一靶点发挥作用，而是通过激活先天免疫识别通路，构建促炎微环境，从而间接并持续性地增强破骨细胞分化信号。既往研究已证实，Toll样受体在破骨细胞前体中高度表达，其激活可显著增强RANKL诱导的破骨分化效应^[35]。本研究的转录组数据与上述观点高度一致，进一步支持了“免疫‑骨代谢耦联”在感染性骨破坏中的核心作用。

在体内实验方面，本研究通过股骨髓腔注射模型验证了金黄色葡萄球菌外囊泡在活体内诱导骨破坏的能力。Micro‑CT定量分析显示，外囊泡处理组骨密度及骨小梁结构参数显著下降，提示即使在无活菌持续存在的条件下，单纯外囊泡刺激亦足以诱导明显的骨量丢失。免疫荧光结果进一步证实，CTSK在骨小梁表面的表达显著增强，说明高活性破骨细胞在局部骨组织中大量聚集并参与骨吸收过程。这一发现具有重要的病理学意义，提示金黄色葡萄球菌外囊泡可作为一种“远程毒力因子载体”，在感染后期或细菌清除不完全的情况下持续驱动骨破坏，为临床上部分骨感染患者“细菌阴性但骨破坏进展”的现象提供了合理解释。

尽管本研究阐明了金黄色葡萄球菌外囊泡在破骨细胞介导的骨破坏中的作用及部分机制，但仍有待深入探讨之处，这也是未来研究的重点方向。(1)囊泡成分的异质性解析：金黄色葡萄球菌外囊泡为复杂的混合体系，后续研究需结合蛋白质组学与脂质组学技术，精准鉴定其中诱导破骨活化的关键效应分子，并解析其协同作用机制；(2)骨重塑偶联机制探讨：骨稳态维持依赖于成骨-破骨的动态平衡，本研究主要聚焦于破骨细胞，金黄色葡萄球菌外囊泡是否通过抑制成骨细胞功能进一步加剧净骨丢失尚需明确；(3)体内命运追踪：需引入更先进的示踪技术，动态解析其在骨组织内的细胞摄取特异性、分布规律及代谢清除过程；(4)临床转化潜力：基于本研究揭示的分子机制，后续研究可探索靶向清除金黄色葡萄球菌外囊泡或阻断其下游信号通路的策略，为慢性骨髓炎及相关感染性骨病的精准治疗提供新思路。

综上所述，本研究系统地揭示了金黄色葡萄球菌外囊泡可通过激活Toll样受体通路构建局部促炎微环境，驱动破骨细胞的激活分化，导致感染性骨破坏的发生发展。这一发现不仅深化了对金黄色葡萄球菌骨病发病机制的理解，将视角从“活菌感染”扩展到其分泌的“外囊泡”所介导的慢性炎症过程，也为开发针对细菌残留产物所致骨破坏的创新型治疗手段提供了重要的实验依据和潜在的分子靶点。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(82472447)

国家自然科学基金青年项目(82502868)

北京自然科学基金面上项目(7254421)

北京自然科学基金-海淀原始创新联合基金项目(L222146)

北京自然科学基金-海淀原始创新联合基金项目(22L20246)