基于3D打印微流控芯片的乳腺癌类器官培养及药物敏感性检测模型建立研究

Development of a 3D-printed microfluidic platform for culturing breast cancer patient-derived organoids and assessing drug sensitivity

摘要

背景 乳腺癌发病率高且异质性大，亟需个性化治疗策略。患者来源类器官(patient-derived organoids，PDO)具有药敏筛选优势，但传统培养中营养供应不足等问题限制了其应用。微流控芯片技术可通过连续灌流模拟血流环境，提高PDO培养的生理相关性。 目的 采用3D打印微流控芯片培养乳腺癌PDO，评估该培养体系对PDO生长状态、形态保真性及药敏反应一致性的影响，探索其用于乳腺癌PDO培养和个体化药物敏感性检测的可行性。 方法 从3例经病理确诊的浸润性乳腺癌患者肿瘤标本构建PDO，在传统平板和3D打印微流控芯片中分别培养。通过H&E染色以及雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和增殖标志物Ki67免疫组化比较两种培养方式下PDO与原发肿瘤组织的形态和表型一致性；采用乳腺癌常用化疗药多西他赛和表柔比星进行药敏测试，在正常培养条件下对多西他赛与表柔比星进行剂量-反应实验并计算IC₅₀；采用对应IC₅₀浓度处理芯片培养PDO，比较两种培养方式下药物反应一致性。 结果 与传统培养相比，芯片培养组PDO直径增大、结构更致密，H&E组织结构和免疫组化标志物表达与正常培养总体一致，提示在本研究观察范围内，芯片培养未明显改变PDO的主要组织学和免疫表型特征。在相同药物浓度(半抑制浓度)暴露下，两种培养方式的PDO细胞存活率差异无统计学意义(P＞0.05)，提示在本研究样本量与检测条件下，两种培养方式的药物处理后细胞活力无显著差异。 结论 3D打印微流控芯片培养可改善乳腺癌PDO的培养状态，其在本研究条件下未明显改变PDO的主要组织学表型及药物反应特征，为乳腺癌个体化药物筛选提供了可行的体外培养平台。

Abstract

Background Breast cancer is characterized by high incidence and marked heterogeneity, which highlights the need for personalized therapeutic strategies. Patient-derived organoid (PDO) provides an advantageous platform for drug sensitivity testing, but conventional culture systems may be limited by insufficient nutrient supply and other microenvironmental constraints. Microfluidic chip technology can mimic a blood flow-like environment through continuous perfusion and may improve the physiological relevance of PDO culture. Objective To culture breast cancer PDO using a 3D-printed microfluidic chip and evaluate the effects of this culture system on PDO growth status, morphological fidelity, and consistency of drug responses, thereby exploring its feasibility for breast cancer PDO culture and individualized drug sensitivity testing. Methods Tumor specimens from three invasive breast cancer patients were used to establish PDO. PDO was cultured under conventional plate conditions and in the microfluidic chip with continuous media perfusion. Hematoxylin & eosin staining and immunohistochemistry for estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and Ki-67 were performed to compare organoid histology and phenotype with the original tumors. Docetaxel and epirubicin were tested at multiple concentrations to generate dose - response curves and calculate IC₅₀ values. Chip-cultured PDO was then treated at the corresponding IC₅₀ concentrations to compare drug response consistency between the two culture conditions. Results Organoids grown in the microfluidic chip were larger and more densely structured, while their H&E histology and marker expression patterns were generally consistent with those from plate culture. Under exposure to the same nominal drug concentration (IC₅₀), there was no statistically significant difference in PDO cell viability between the two culture conditions (P＞0.05), suggesting that the microfluidic culture did not markedly alter PDO drug responses under the present experimental conditions. Conclusion The 3D-printed microfluidic chip provides a dynamic culture environment that improves PDO growth, and the present findings preliminarily suggest that it does not markedly alter the main phenotypic features or drug response characteristics of PDOs under the tested conditions. This platform may serve as a feasible tool for personalized chemotherapy screening in breast cancer.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 患者来源类器官 / 微流控芯片 / 3D打印 / 药物敏感性检测

Key words

breast cancer / patient-derived organoid / microfluidic devices / 3D printing / drug sensitivity tests

乳腺癌已经成为全球女性中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一^[1]。我国2022年新发乳腺癌病例约35.72万例^[2]。乳腺癌患者具有显著的肿瘤异质性，空间/时间层面的分子差异可影响肿瘤进展、治疗反应与耐药形成，从而增加精准分层与个体化治疗决策的难度^[3-4]。因此，开发能够反映个体肿瘤特征的体外模型，对于药物筛选和制定个性化治疗方案具有重要意义。

作为一种新兴的三维模型体系，患者来源类器官(patient-derived organoid，PDO)能够在体外保留原始肿瘤的组织结构特征与关键分子改变，并可进行相对稳定的长期扩增及生物样本库化，为肿瘤生物学研究与精准用药评估提供了重要平台^[5-6]。与传统二维细胞系相比，肿瘤类器官在表型与分子特征维持方面更接近原发肿瘤，且二维细胞系在连续传代过程中更易发生基因型/表型漂移、难以再现肿瘤内异质性及复杂微环境^[7-8]。然而，类器官体系仍存在局限。目前尚难在体外完全复刻血管灌流等关键微环境要素，且PDO建立与药筛在成本、时间及标准化方面仍面临挑战^[9-10]。

近年来，微流控器官芯片技术为在体外引入可控灌流、模拟体内血流供给与代谢废物清除提供了可行方案^[11]。芯片系统可通过微通道结构与灌流控制实现对流速、剪切力及物质传输过程的精细调节，从而改善营养与氧气供给、提升细胞/类器官活性并减少坏死倾向；同时，规范化的灌流流程也有望降低手动换液带来的批间差异，提高模型可重复性与可比性^[12]。国外已有多种“类器官-on-a-chip”用于肿瘤研究与药物筛选的探索，但在乳腺癌PDO的3D打印微流控芯片培养与药敏检测方面仍有待进一步系统化验证。

本研究设计并制备了一种基于3D打印的微流控培养芯片，用于乳腺癌PDO的动态培养。该芯片具有模拟毛细血管灌流的螺旋状微通道结构，可以持续为PDO提供营养和氧气。本研究将比较芯片培养与正常培养获得PDO在形态学、免疫表型及化疗药物敏感性方面的一致性，以评估该微流控系统在PDO培养和药物筛选中的应用潜力与创新性。

1 材料与方法

1.1 人体标本获取

用于PDO构建的3例肿瘤标本组织均来源于解放军总医院第一医学中心普通外科收治的、经病理活检确诊为浸润性乳腺癌的患者手术标本。肿瘤标本临床样本信息如表1所示。PDO-1、PDO-2、PDO-3分别代表3位患者来源的独立PDO系，后续药敏实验在相同流程下分别进行。所有涉及人类样本的实验均由解放军总医院医学伦理委员会评估和批准(编号：S2024-675-02)。研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，所有患者均签署了书面知情同意书。

1.2 PDO正常培养

将肿瘤组织进行机械剪切后，置于Advanced DMEM/F12无血清培养基(Gibco，2919340)中，加入200 U/mL胶原酶Ⅳ(Sigma-Aldrich，C4-28)配制消化液，在37℃下轻轻振荡消化30 min。消化结束后，将消化产物通过100 μm细胞筛分离单细胞悬液，置于15 mL离心管并以250×g离心5 min收集细胞。弃上清后，将回收细胞重悬于培养基与Matrigel(Corning，356231)按3∶4体积比混合的基质中。向24孔板每孔中央加入40 μL细胞悬液，密度为1×10⁵个/孔(PDO培养体系)(图1)，待其凝固后加入500 μL培养基。置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，每2 ~ 3 d更换1次含Wnt-3a、R-spondin-1等生长因子的PDO培养基。

1.3 微流控芯片制备与PDO培养

采用光固化3D打印技术制备微流控培养芯片。该芯片包含多个独立培养腔及相连的进出口流道，通过双向微流控泵为各培养腔提供连续灌流。每个培养腔内部设计有螺旋状微通道，通道壁上均匀分布直径约7 μm、间距约70 μm的微孔，用于模拟毛细血管结构并实现培养基对PDO的高效渗透。PDO培养芯片结构见图2。在每个培养腔中加入100 μL含5×10⁴个细胞的80% Matrigel/培养基混合液，待Matrigel凝固后将芯片连接至微流控培养系统，以恒定低速灌流方式持续注入培养基，培养基以10 µL/min的恒定流速灌注，同时通过同步抽液泵以相同流速自动排出废液以维持腔内体积稳定。灌流模式为连续性灌流，培养基储液瓶每3 d更换1次，并通过滤过器排出气泡，降低气泡对灌流稳定性的影响。培养过程维持在37℃、5% CO₂培养箱内进行。

选取培养第7天明场显微图像，使用Image J进行尺度校准后测量类器官最大Feret直径。每例患者肿瘤标本培养的PDO在两种培养方式下分别测量可辨认且边界清晰的类器官(每组取30个)，并计算该PDO在对应条件下的平均直径。

1.4 组织学与免疫组化分析

使用苏木精-伊红(HE)染色评价正常培养和芯片培养获得的PDO与原始肿瘤组织在形态学上的一致性。培养结束后，收集PDO至冰冷PBS中，并添加细胞回收液(Corning，354253)去除Matrigel基质。将PDO和新鲜肿瘤组织标本分别在4%多聚甲醛中固定30 min，按照常规流程石蜡包埋^[13]。取5 μm厚切片进行H&E染色，并在显微镜下进行组织病理学评估。

1.5 免疫组化鉴定类器官表型

对PDO和原发肿瘤组织切片进行免疫组化染色，评估PDO与亲本组织的表型一致性。将石蜡切片脱蜡并水化，置于含EDTA(pH 9.0)抗原修复液的修复盒中，微波炉高火加热5 min后转低火加热15 min，然后自然冷却至室温。将切片用PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5 min，3% H₂O₂溶液中室温避光孵育10 min以阻断内源性过氧化酶。PBS洗涤，组化圈内加入3% BSA封闭液，室温封闭20 min。去除封闭液，在湿盒中向切片滴加按比例稀释的一抗溶液(雌激素受体α抗体，Affinity AF6058，1∶100；孕激素受体抗体，Affinity AF6106，1∶100；Ki67抗体，Affinity AF0198，1∶200)，4℃孵育过夜。抗体孵育结束后，用PBS洗涤3次，每次5 min，在切片上滴加对应物种的HRP标记二抗，室温孵育50 min。洗涤后用新配制的DAB显色液显色，显微镜下实时观察，显色达到适当程度后用自来水冲洗终止反应。对切片进行苏木素复染(1 min)、脱水、透明和封片。所有制备完成的切片使用3DHISTECH Pannoramic SCAN 150全自动扫描系统进行图像采集与分析。

1.6 传统培养PDO药物敏感性检测

明场显微镜下观察到PDO生长恢复良好(大小适中、形态呈球形)后进行药物敏感性实验。收集含Matrigel的PDO悬液，冰冷PBS洗涤以250×g离心5 min收集细胞沉淀。去除上清，加入细胞回收液(Corning，354253)重悬细胞，冰上温和振荡30 min以去除基质，再以250×g离心5 min收集单细胞沉淀。取细胞沉淀加入2 mL TrypLE Express(Gibco，12604-013)消化，至PDO完全解离为单细胞。以每5 μL含5 000个细胞的80% Matrigel/培养基混合液重悬细胞，并将5 μL混合胶-细胞悬液滴加于96孔板中，每孔再加入100 μL培养基。置于37℃、5% CO₂培养箱中培养48 h，当类器官恢复球形时移除培养基，加入待测试化疗药物进行处理。每种药物每个浓度设置三个技术重复，以0.2% DMSO作为阴性对照。

1.7 芯片培养PDO药物敏感性检测

取出3D打印微流控芯片，应用冷PBS冲洗并收集含Matrigel基质的PDO，300×g离心5 min使PDO及基质沉淀。除去Matrigel基质并将PDO解离至单细胞(过程同1.6)。每个培养腔中加入100 μL含有5×10⁴个解离细胞的80% Matrigel/培养基混合物，Matrigel固化后接入芯片，将培养基以低流速恒定灌注，废液通过同步吸液泵排出。

给药方式：在芯片药物处理阶段，将按1.8所述浓度配制的含药培养基加入入口储液瓶，并以10 µL/min 的恒定流速连续灌流72 h；出口端同步抽吸以维持培养腔体积稳定。为尽量降低药物在37℃条件下的降解影响，给药期间储液瓶内含药培养基现配现用并每24 h更换1次。表柔比星溶液全程避光，储液瓶用铝箔包裹。阴性对照组采用相同终浓度DMSO(0.2%)的培养基进行灌流处理。

1.8 检测药物和浓度

所用药物为多西他赛(Hy-B0011，MCE公司)和表柔比星(HY-13624AR，MCE公司)，均以10 mmol/L浓度溶于DMSO制备储备液并保存在-80℃。药敏实验前，将药物复溶于室温培养基并依次稀释至5个浓度梯度：10、1、0.1、0.01和0.001 μmol/L，用于绘制剂量-反应曲线并计算IC₅₀值(方法1.9)。为在两种培养体系间进行药效比较，本研究采用常规静态培养测得的IC₅₀值作为芯片灌流培养基中的初始药物浓度(名义浓度)，以评估在相同初始给药浓度下，两种培养体系中PDO反应的差异。在比较正常培养与芯片培养的药敏反应时，以常规培养体系计算得到IC₅₀作为名义浓度，将药物加入入口储液瓶中的培养基并进行连续灌流给药72 h，用于评估两种培养方式在相同名义浓度暴露下的药物反应一致性。对每一例PDO(PDO-1/2/3)分别采用相同的5个浓度梯度进行72 h处理并绘制剂量-反应曲线，曲线拟合与IC₅₀计算方法一致。

在正常培养条件下，对PDO-1、PDO-2和PDO-3这3组类器官进行IC₅₀计算，分别得到多西他赛和表柔比星在3种类器官的IC₅₀。应用对应IC₅₀浓度处理芯片培养的PDO：PDO-1应用0.2 μmol/L的多西他赛和0.1 μmol/L的表柔比星共同处理；PDO-2应用0.1 μmol/L的多西他赛和0.02 μmol/L的表柔比星处理；PDO-3应用0.1 μmol/L的多西他赛和0.02 μmol/L的表柔比星处理。

1.9 细胞活力测定

正常培养PDO：药物处理3 d后移除培养基。向96孔板中含PDO的孔加入100 μL等体积混合的CellTiter-Glo 3D试剂(Promega)和培养基(1∶1)，在室温、100 转/min条件下振荡5 min后，避光孵育25 min以充分裂解细胞并稳定发光信号。取100 μL裂解液转移至白底96孔板中，使用酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax i3x)以发光模式(luminescence)读取发光信号强度。发光信号强度与细胞内ATP含量成正比，以反映细胞活力。计算各组IC₅₀值及细胞存活率。

芯片培养PDO：药物处理3 d后取出培养芯片，置于装有1 mL等体积混合CellTiter-Glo 3D试剂和培养基(1∶1)的6孔板中，使试剂完全覆盖芯片中的PDO。在室温、100 转/min条件下振荡5 min后避光孵育25 min以裂解细胞并稳定发光信号。充分混匀6孔板内溶液后取100 μL转移至白底96孔板，使用酶标仪以发光模式读取发光信号强度。各组细胞存活率计算同上。

1.10 统计学分析

分析使用GraphPad Prism 8完成。数据以均数±标准差(\overline{x} ± s)表示。每个药物浓度设3个技术重复；PDO-1、PDO-2、PDO-3作为独立生物学样本。两种培养方式下在相同药物浓度(IC₅₀浓度)处理后的存活率比较采用配对t检验(正态性不满足时采用Wilcoxon符号秩检验)。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微流控芯片构造及培养原理

本研究在培养过程中，通过双向微流控泵同步运作，新鲜培养基从入口持续流入、废液从出口同时被抽出，实现连续动态灌流。该微流控系统高度自动化，可显著减少手动换液操作，降低实验误差并提高重复性。见图2。

2.2 芯片培养与正常培养PDO形态学分析

培养7 d后在明场显微镜下对比观察两种培养方式下PDO的形态差异。结果显示，微流控芯片培养组的PDO直径明显增大、细胞更加致密，整体形态更为完整(图3)。与传统培养相比，芯片培养组PDO直径增加(P=0.035 5)(图4)。病理学分析进一步提示，无论是正常培养还是芯片培养获得的PDO，其H&E染色所示的组织结构与原始肿瘤组织在形态学上未见明显差异(图5)。免疫组化结果显示，PDO总体保留了原始肿瘤的主要标志物表达特征，包括雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和增殖标志物Ki67(图5)。结合H&E形态学结果，提示在本研究观察范围内，芯片培养未明显改变PDO的主要组织学结构及免疫表型特征。

2.3 PDO药敏性初筛

构建成功的3例患者来源独立PDO系(PDO-1、PDO-2、PDO-3)在相同浓度梯度设置下分别接受多西他赛(docetaxel，记为T)与表柔比星(epirubicin，记为E)处理，并绘制剂量–反应曲线计算IC₅₀。为每种药物设置五个浓度梯度(0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)，作用3 d后，绘制剂量-反应曲线并计算IC₅₀值。明场显微镜观察发现，随药物浓度增加，PDO球体呈现典型的药物效应：在低浓度组PDO形态基本未见明显变化，而在高浓度组PDO颜色变暗、球体结构出现破裂和瓦解(图6)。这些结果表明药物浓度增加能够逐渐抑制和杀伤肿瘤类器官。利用CellTiter-Glo 3D试剂对药物处理后的PDO进行细胞存活率测定，通过非线性回归拟合剂量-反应曲线并计算各组PDO对两种药物的IC₅₀值。所得剂量-反应曲线趋势与显微镜下PDO形态观察结果一致(图7)，进一步验证了药物对PDO的毒性效应。

2.4 芯片培养与传统培养药敏对比

基于上述IC₅₀结果，我们选取对应药物浓度分别处理正常培养和芯片培养的PDO。明场显微镜观察表明，在相同药物浓度作用下，两种培养条件下的PDO均出现球体缩小和裂解的表型，显示出药物的典型抑制效应。其中，芯片培养组PDO在给药前状态更佳，类器官直径更大、形态更圆；给药后，其形态变化也更明显(图8)。使用CellTiter-Glo 3D试剂测定药物处理后PDO的存活率，并对3组PDO在两种培养方式下的存活率进行统计分析。结果显示，两种培养方式下各组PDO的平均存活率差异无显著性(P＞0.05)(图9)。这些结果表明，在本研究所选药物及样本量范围内，芯片培养与常规培养在IC₅₀对应浓度暴露后的细胞活力未观察到显著差异，提示芯片灌流培养在改善生长状态的同时未明显改变药物反应。

3 讨论

本研究通过与正常培养方法对比，验证了3D打印微流控芯片用于乳腺癌PDO动态培养与药物敏感性检测的可行性。结果显示，芯片持续灌流环境下PDO形态更完整、体积增大，提示微流控培养可能通过改善物质交换而提升类器官生长质量。此持续灌流为PDO提供稳定的营养和氧气供应，可有效避免传统静态培养中常见的内部缺氧和坏死现象。既往研究指出，传统静态类器官培养主要依赖被动扩散进行氧气、营养与代谢废物交换，类器官增大后易出现扩散受限，从而形成低氧/坏死核心并影响长期培养的稳定性与一致性^[12]。器官芯片通过微通道灌流可对流速、剪切力及物质输运进行更精细的控制，为三维组织提供更接近体内的动态微环境^[14-15]；在其他器官类器官体系中，“在流动条件下培养”已被证明可改善类器官活性并促进组织成熟，例如既往研究中肾类器官在流动条件下出现更丰富的内皮祖细胞与血管样结构，与本研究观察到的“芯片培养促进PDO生长”在机制层面具有一致性^[16]。

在组织学与免疫表型方面，本研究通过H&E及ER/PR/Ki-67免疫组化比较，发现芯片培养并未改变PDO的形态学结构与关键分子标志物表达，且其模式与原发肿瘤相一致。芯片培养样本在制片过程中存在PDO脱落及切片层面受限等问题，且存在非特异性染色干扰。而两组培养体系对应的PDO均源自同一批次同一患者的原始肿瘤组织，HE染色已证实芯片培养可完整复刻原始肿瘤组织形态学结构。因此，结合展示的常规培养组PDO稳定标志物表达结果，我们认为可以支撑“芯片培养体系可稳定保留肿瘤原生分子表型”的这一结论。这一发现与既往乳腺癌类器官可保留原肿瘤组织学特征及受体状态的发现相符，Sachs等^[17]建立的乳腺癌类器官活体库显示，类器官形态通常与原发肿瘤病理一致，并能够维持激素受体状态与HER2状态等关键信息。肿瘤类器官在肿瘤研究与转化医学中的价值也已在多项研究中被证实，认为其在一定程度上保留了患者肿瘤的遗传/表型特征，为个体化用药评估提供了更接近临床的体外模型^[18-19]。因此，结合既往研究与本研究结果，微流控灌流作为“培养方式的工程学升级”，在不破坏PDO关键表型的前提下，有望提升培养过程的稳定性与可重复性。

在药物敏感性检测方面，两种培养方式下PDO对多西他赛与表柔比星在IC₅₀浓度暴露下存活率无差异，提示微流控培养虽改变了培养微环境与生长状态，但药物反应特性保持一致。需要指出的是，微流控持续灌流条件下药物输运以对流-扩散过程为主，PDO周围的瞬时浓度分布与累积暴露量(如AUC)可能与静态孔板体系存在差异。因而本研究采用相同“名义浓度”进行跨体系一致性比较，未来可结合示踪方法或定量检测进一步评估芯片内药物稳定性与实际暴露水平。既往研究显示，乳腺癌PDO药敏结果与患者临床治疗反应可具有一定一致性。例如，基于患者活检样本建立的乳腺癌类器官可用于预测新辅助化疗反应，并可体现患者间药物敏感性差异^[20]。同时有研究建立乳腺癌患者来源PDO用于指导个体化治疗，药敏结果与临床反应在多数病例中表现一致^[21]。此外，发表在Theranostics上的专家共识讨论强调了PDO药敏用于临床决策的潜力，同时也指出标准化、质量控制与结果解释规则对于提高预测准确性至关重要^[22]。近年，我国发布了肿瘤类器官诊治平台质量控制与类器官药物敏感性检测的相关专家共识，为类器官药敏检测的流程规范、质控要点与结果呈现提出了建议^[23-24]。结合本研究结果，芯片平台在维持药敏一致性的同时，具备以工程化方式提升“可控性、可重复性、可拓展性”的优势，提示其可作为PDO药敏检测的可行载体之一。

值得强调的是，微流控系统的自动化灌流与参数可控性，可能进一步降低人工换液导致的批间差异。既往研究指出，芯片系统可通过标准化流体操作与环境控制，提高微环境稳定性并提升实验重复性^[14]；同时，面向类器官的自动化微流控平台已被用于实现动态、组合式药物筛选与高通量分析，从而更好地服务个体化治疗研究需求^[25]。因此，从平台化应用角度看，本研究的3D打印微流控芯片不仅是培养器具的替代，更可能为后续集成“自动化灌流-实时成像-多药组合筛选-数据建模”提供工程基础。

本研究仍存在一定局限性。第一，样本量仅3例PDO，尚不足以覆盖乳腺癌的多维异质性；后续需扩大病例数并纳入不同分子亚型及不同治疗史患者，以验证平台的普适性与分层适用性。第二，本研究仅评估两种化疗药物，尚未覆盖内分泌治疗与靶向治疗等乳腺癌关键治疗谱系，考虑到PDO平台在个体化用药中的应用场景通常涉及多药联合方案筛选，未来可进一步拓展药物谱并结合临床随访结局进行验证。第三，芯片培养参数(如流速、剪切力、灌流模式)仍需系统优化。一方面，适度流动可改善运输与代谢环境；另一方面，剪切力也可能影响细胞应激与信号通路，应在“提升生长质量”与“维持生物学真实性”之间寻求平衡。需要说明的是，本研究的观察窗口主要覆盖灌流培养第7天的形态学和表型验证以及药物灌流处理72 h阶段，因此本研究数据可支持芯片灌流培养在至少7 d范围内维持PDO生长并完成药敏检测，但尚未系统评估其可维持的最长培养时限。既往器官芯片研究提示，在适当的灌流与培养基更新策略下，三维组织模型可实现更长周期维持，提示延长PDO培养时间具有潜在可行性。后续我们将进一步开展长周期培养稳定性、形态/表型漂移及污染控制等评估，以明确本芯片平台的最长可用培养周期与适用边界。此外，本研究芯片目前主要实现“类血管灌流的物理模拟”，尚未引入真正的内皮细胞血管网络或免疫/基质共培养。已有研究在微流控芯片上构建了可灌流的三维微血管网络^[26]，并可通过生物打印等方式获得含灌流通道的厚组织结构^[27]，提示“流动+血管化”可促进成熟与功能提升。因此，未来可考虑在本平台中引入内皮细胞、成纤维细胞及免疫细胞共培养^[28-29]，或与血管化模块耦联，以进一步提高肿瘤微环境模拟程度与药物反应预测能力^[30]。

综上，3D打印微流控芯片为乳腺癌PDO培养提供了动态灌流微环境，可改善类器官生长状态。本研究结果初步提示，在短期培养及所测试药物条件下，芯片培养未明显改变PDO的主要组织学、免疫表型及药物反应特征。该平台有望用于乳腺癌患者个体化药物筛选与疗效预测，为精准医疗提供新的技术支撑。后续研究可通过扩大样本量、优化灌流参数、引入血管化与多细胞共培养，并与临床真实世界疗效数据进行关联验证，以进一步推动该系统的临床转化。

数据共享声明

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参考文献

[1] Bray F， Laversanne M， Sung H，et al. Global cancer statistics 2022：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin，2024，74（3）：229-263.

[2] Sun KX， Zhang BL， Lei SY，et al. Incidence，mortality，and disability-adjusted life years of female breast cancer in China，2022［J］. Chin Med J，2024，137（20）：2429-2436.

[3] Guo LT， Kong DG， Liu JH，et al. Breast cancer heterogeneity and its implication in personalized precision therapy［J］. Exp Hematol Oncol，2023，12（1）：3.

[4] Tomasik B， Garbicz F， Braun M，et al. Heterogeneity in precision oncology［J］. Camb Prisms Precis Med，2024，2：e2.

[5] Zhao ZX， Chen XY， Dowbaj AM，et al. Organoids［J］. Nat Rev Meth Primers，2022，2：94.

[6] Qu SQ， Xu RY， Yi GZ，et al. Patient-derived organoids in human cancer：a platform for fundamental research and precision medicine［J］. Mol Biomed，2024，5（1）：6.

[7] Porter RJ， Murray GI， McLean MH. Current concepts in tumour-derived organoids［J］. Br J Cancer，2020，123（8）：1209-1218.

[8] Bhatia SN， Ingber DE. Microfluidic organs-on-chips［J］. Nat Biotechnol，2014，32（8）：760-772.

[9] Chang CH， Tsai CC， Cheng CF，et al. Tumor organoids：A review of culture methods，applications in cancer research，precision medicine，and drug development［J］. Tzu Chi Med J，2025，37（4）：360-370.

[10] Shuchat S， Yossifon G， Huleihel M. Perfusion in organ-on-chip models and its applicability to the replication of spermatogenesis in vitro［J］. Int J Mol Sci，2022，23（10）：5402.

[11] Cao UMN， Zhang YL， Chen JL，et al. Microfluidic organ-on-A-chip：a guide to biomaterial choice and fabrication［J］. Int J Mol Sci，2023，24（4）：3232.

[12] Papamichail L， Koch LS， Veerman D，et al. Organoids-on-a-chip：microfluidic technology enables culture of organoids with enhanced tissue function and potential for disease modeling［J］. Front Bioeng Biotechnol，2025，13：1515340.

[13] Al-Sabaawy HB， Rahawi AM， Al-Mahmood SS. Standard techniques for formalin-fixed paraffin-embedded tissue：A Pathologist’s perspective［J］. Iraqi J Vet Sci，2021，35：127-135.

[14] Low LA， Mummery C， Berridge BR，et al. Organs-on-chips：into the next decade［J］. Nat Rev Drug Discov，2021，20（5）：345-361.

[15] Li B， Tang YJ， Huang ZY，et al. Synergistic innovation in organ-on-a-chip and organoid technologies：reshaping the future of disease modeling，drug development，and precision medicine［J/OL］.

[16] Homan KA， Gupta N， Kroll KT，et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro［J］. Nat Methods，2019，16（3）：255-262.

[17] Sachs N， de Ligt J， Kopper O，et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity［J］. Cell，2018，172（1/2）：373-386.

[18] Drost J， Clevers H. Organoids in cancer research［J］. Nat Rev Cancer，2018，18（7）：407-418.

[19] Yan HHN， Chan AS， Lai FP，et al. Organoid cultures for cancer modeling［J］. Cell Stem Cell，2023，30（7）：917-937.

[20] Shu D， Shen MY， Li K，et al. Organoids from patient biopsy samples can predict the response of BC patients to neoadjuvant chemotherapy［J］. Ann Med，2022，54（1）：2580-2596.

[21] Wu HZ， Wang WW， Zhang YB，et al. Establishment of patient-derived organoids for guiding personalized therapies in breast cancer patients［J］. Int J Cancer，2024，155（2）：324-338.

[22] Xiang DX， He AN， Zhou R，et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development［J］. Theranostics，2024，14（8）：3300-3316.

[23] 王树滨，高静，朱宇，等. 类器官药物敏感性检测指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识（2022年版）［J］. 中国癌症防治杂志，2022，14（3）：234-239.

[24] 中国抗癌协会肿瘤多学科诊疗专业委员会，中国抗癌协会肿瘤内分泌专业委员会，赵冰，等. 肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识（2022年版）［J］. 中国癌症杂志，2022，32（7）：657-668.

[25] Schuster B， Junkin M， Kashaf SS，et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids［J］. Nat Commun，2020，11：5271.

[26] Kim S， Lee H， Chung M，et al. Engineering of functional，perfusable 3D microvascular networks on a chip［J］. Lab Chip，2013，13（8）：1489-1500.

[27] Kolesky DB， Homan KA， Skylar-Scott MA，et al. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（12）：3179-3184.

[28] Sun Y， Liu JQ， Zhu L，et al. Treatment response to oncolytic virus in patient-derived breast cancer and hypopharyngeal cancer organoids：evaluation via a microfluidics organ-on-a-chip system［J］. Bioengineering，2025，12（2）：146.

[29] Maulana TI， Teufel C， Cipriano M，et al. Breast cancer-on-chip for patient-specific efficacy and safety testing of CAR-T cells［J］. Cell Stem Cell，2024，31（7）：989-1002.

[30] Ong LJY， Islam A， DasGupta R，et al. A 3D printed microfluidic perfusion device for multicellular spheroid cultures［J］. Biofabrication，2017，9（4）：045005.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(6247071009)