PPAR-γ在严重烧伤后延迟补液诱导的肠屏障损伤中的作用机制研究

Action mechanism of PPAR-γ in delayed fluid resuscitation-induced intestinal barrier injury following severe burns

摘要

背景 严重烧伤后延迟补液会显著加剧肠道缺血-再灌注损伤，进而破坏肠道屏障功能，然而过氧化物酶体增殖物激活物受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ)在此特定病理背景下对肠道屏障的具体保护机制目前仍未见系统报道。 目的 探讨延迟补液所致严重烧伤后肠道屏障损伤中PPAR-γ的表达特点及其在肠道屏障损伤中的作用机制。 方法 研究分为两部分。第一部分为时间依赖性实验，纳入30只C57/BL小鼠，制作30%总体表面积烫伤模型。所有动物随机分为5组：假手术组(Sham)、即刻液体复苏组(PR)、延迟3 h复苏组(3hR)、延迟6 h复苏组(6hR)以及不复苏组(NR)。于伤后12 h检测肠道病理损伤、肠道屏障通透性指标血清肠道型脂肪酸结合蛋白(intestinal-type fatty acid-binding protein，iFABP)、血清D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAO)、肠紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)和闭合蛋白(Occludin)表达及PPAR-γ的表达情况。第二部分为干预实验，18只小鼠分为延迟6 h复苏组(6hR)、延迟6 h+罗格列酮组(6hRR)及延迟6 h+GW9662组(6hGR)。在评估上述参数的同时，检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)水平。 结果 与PR组相比，各延迟复苏组(3hR、6hR和NR)在伤后12 h肠道损伤均加重，表现为组织病理学评分升高(P＜0.01)、血清肠道通透性标志物iFABP和DAO水平升高(P＜0.01)、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量显著减少(P＜0.01，P＜0.05)，以及PPAR-γ表达下调(6hR与NR组，P＜0.01)。与3hR组比较，6hR组和NR组肠道损伤呈进行性加重，伤后12 h组织病理学评分均变化(P＜0.01)，血清DAO水平升高(P＜0.05)，ZO-1与Occludin表达均显著降低。与6hR组相比，6hRR组PPAR-γ表达上调P＜0.05)，同时伴有肠道病理损伤明显改善(P＜0.01)、血清iFABP和DAO水平降低(P＜0.01)、ZO-1和Occludin表达增强(P＜0.01，P＜0.05)，以及TNF-α和IL-1β水平受到抑制(P＜0.01)。相反，与6hRR组相比，6hGR组表现出相反的效果，呈现PPAR-γ表达下调，伴有组织病理学损伤加剧(P＜0.01)、血清iFABP和DAO水平升高(P＜0.01)、ZO-1和Occludin表达减弱(P＜0.01)，以及TNF-α和IL-1β含量增加(P＜0.01)。 结论 PPAR-γ通过抑制炎症反应和维持紧密连接蛋白的稳定性，减轻延迟补液诱导的肠道屏障损伤。早期补液或药物激活PPAR-γ具有潜在的治疗价值，并为优化烧伤复苏策略提供了新的靶点。

Abstract

Background Delayed fluid resuscitation following severe burns significantly exacerbates intestinal ischemia-reperfusion injury, thereby impairing intestinal barrier function. However, the specific protective mechanism of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ) on the intestinal barrier in this particular pathological context has not been systematically reported. Objective To investigate the expression characteristics of PPAR-γ and its role in intestinal barrier injury following severe burns with delayed fluid resuscitation. Methods The study consisted of two parts. The first part was a time-dependent experiment involving 30 C57/BL mice subjected to a 30% total body surface area scald model. Animals were randomly divided into five groups: sham-operated (Sham), immediate fluid resuscitation (PR), delayed resuscitation at 3 hours (3hR), delayed resuscitation at 6 hours (6hR), and no resuscitation (NR). At 12 hours post-injury, intestinal pathological damage, intestinal barrier permeability markers serum intestinal-type fatty acid-binding protein (iFABP) and serum D-amino acid oxidase (DAO), expression of tight junction proteins zonula occludens-1 (ZO-1), Occludin, and PPAR-γ expression were assessed. The second part was an intervention experiment involving 18 mice divided into three groups: delayed 6-hour resuscitation (6hR), delayed 6-hour resuscitation with rosiglitazone (6hRR), and delayed 6-hour resuscitation with GW9662 (6hGR). In addition to evaluating the aforementioned parameters, inflammatory cytokine levels (TNF-α) and Interleukin-1 beta (IL-1β) were measured. Results Compared to the PR group, all delayed resuscitation groups (3hR, 6hR, and NR) exhibited significantly aggravated intestinal injury at 12 hours post-injury, as evidenced by significantly increased histopathological scores (P＜0.01), elevated serum intestinal permeability markers iFABP and DAO (P＜0.01), reduced expression of tight junction proteins ZO-1 and Occludin (P＜0.01, P＜0.05), and significantly downregulated PPAR-γ expression (6hR and NR groups, P＜0.01). Compared to the 3hR group, more severe delayed resuscitation groups showed progressively worsened intestinal injury. At 12 hours post-injury, the 6hR and NR groups displayed significantly deteriorated histopathological scores (P＜0.01), serum DAO levels (P＜0.05), and expression of ZO-1 and Occludin. Compared to the 6hR group, the 6hRR group exhibited significantly upregulated PPAR-γ expression (P＜0.01, P＜0.05), accompanied by markedly improved intestinal pathological damage (P＜0.01), reduced serum iFABPand DAO levels (P＜0.01), enhanced ZO-1 and Occludin expression (P＜0.01, P＜0.05), and suppressed TNF-α and IL-1β levels (P＜0.01). Conversely, compared to the 6hRR group, the 6hGR group showed opposite effects, with downregulated PPAR-γ expression, aggravated histopathological damage (P＜0.01), increased serum iFABP and DAO levels (P＜0.01), reduced ZO-1 and Occludin expression (P＜0.01), and elevated TNF-α and IL-1β levels (P＜0.01). Conclusion PPAR-γ alleviates delayed fluid resuscitation-induced intestinal barrier injury by suppressing inflammatory responses and maintaining the stability of tight junction proteins. Early fluid resuscitation or pharmacological activation of PPAR-γ holds potential therapeutic value and provides a novel target for optimizing burn resuscitation strategies.

Graphical abstract

关键词

烧伤 / 延迟补液 / 肠屏障损伤 / PPAR-γ / 罗格列酮

Key words

burns / delayed fluid resuscitation / intestinal barrier injury / PPAR-γ / rosiglitazone

严重烧伤可导致低血容量性休克，而液体复苏是救治的基石。然而，临床实践中常因各种因素导致复苏延迟。研究证实，延迟补液会加剧肠道缺血-再灌注损伤，破坏肠道屏障功能，这可能引发肠源性感染等严重后果，但其分子机制尚未完全阐明^[1-6]。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ)被证实在维持肠道屏障完整性和抗炎中发挥关键作用^[7-11]。然而，在“严重烧伤-延迟补液”这一特定病理背景下，PPAR-γ对肠道屏障的具体保护机制目前仍缺乏系统研究。严重烧伤所特有的持续性组织坏死、剧烈的氧化应激，叠加延迟补液引发的独特且复杂的缺血-再灌注损伤，构成了一个与其他危重症模型既相关联又存在显著差异的病理生理环境^[12]。

基于以上发现，本研究旨在量化延迟时间与早期肠屏障损伤严重程度的关系，探讨PPAR-γ在严重烧伤后延迟复苏诱导肠道屏障损伤中的作用机制。通过建立30%总体表面积(total body surface area，TBSA)小鼠烫伤模型，检测液体复苏对肠道屏障完整性及PPAR-γ表达的时序性影响，并采用药理学激活(罗格列酮)与抑制(GW9662)方法验证PPAR-γ的保护功能，以期深入解析烧伤后肠道病理生理机制，为优化临床复苏策略及开发靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

小鼠血清肠道型脂肪酸结合蛋白(intestinal-type fatty acid-binding protein，iFABP)ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)；小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)；小鼠白细胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)；小鼠血清D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAO)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；兔源闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)单克隆抗体(杭州华安生物技术有限公司)；兔源闭合蛋白(Occludin)单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；PPAR-γ单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司)；Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)(武汉赛维尔生物科技有限公司)；Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG(武汉赛维尔生物科技有限公司)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)封片剂(北京索莱宝科技有限公司)；罗格列酮(TargetMol公司)；GW9662(TargetMol公司)；DBE-420水浴锅(江苏南通科学仪器厂)；SYD-B-F石蜡包埋机(沈阳誉德电子仪器有限公司)；ASP3005脱水机(德国徕卡公司)；RM2245病理切片机(德国徕卡公司)；超高速低温离心机(Thermo Fisher Scientific公司)、1X51倒置荧光显微镜(Olympus公司)；Bio Tek酶标仪(Agilent公司)；Fluor ChemE凝胶成像仪(Protein Simple公司)。

1.2 实验动物

48只健康SPF级成年雄性C57BL/6小鼠(21 ~ 24 g)由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2024-0001。实验前，所有小鼠在通风、恒温(22℃ ± 2℃)、恒湿(50% ± 10%)环境中适应性饲养14 d。本研究方案经解放军总医院动物实验伦理委员会审查批准(伦理批号：2024-X20-10)。所有实验程序均严格遵守国家及有关部门关于实验动物护理与使用的规定。

1.3 动物分组及实验方法

在动物实验的第一部分，为探究补液时机，通过随机数字表法将30只小鼠分为5组(每组n=6)：假伤组(Sham)、即刻补液组(PR)、延迟3 h补液组(3hR)、延迟6 h补液组(6hR)及未补液组(NR)。在致伤前，所有小鼠均采用异氟烷麻醉(诱导浓度5%，维持浓度2%)。麻醉后，剃除小鼠背部约占30% TBSA的毛发，该区域定义为双侧后肢与耳部之间的皮肤范围。除Sham组外，其余各组小鼠均通过将脱毛的背部区域浸泡于90℃水浴中10 s，造成30% TBSA全层烫伤；Sham组小鼠则在相同操作条件下浸泡于37℃水浴中10 s，以模拟致伤过程但不造成实际热损伤，且术后不给予任何干预处理。PR组、3hR组和6hR组小鼠分别在伤后即刻、伤后3 h及伤后6 h，按Parkland公式[4 mL/(kg·%TBSA)]计算补液量，经腹腔注射乳酸钠林格溶液；Sham组与NR组不予补液处理。

在动物实验的第二部分，为探究PPAR-γ的作用，将18只小鼠随机分为3组(每组n=6)，分别接受不同的延迟6 h补液方案：单纯补液组(6hR)、补液联合罗格列酮组(6hRR)及补液联合GW9662组(6hGR)。所有动物均采用前述相同的麻醉与致伤操作流程。伤后6 h，6hR组、6hRR组和6hGR组小鼠均按Parkland公式计算剂量，经腹腔注射乳酸钠林格溶液([4 mL/(kg·%TBSA)]；同时，6hRR组和6hGR组分别额外经腹腔注射罗格列酮(3 mg/kg)和GW9662(1 mg/kg)。实验分组及缩写见表1。

1.4 样本采集

伤后12 h，所有小鼠经麻醉后，通过眼眶采集血样，以3 000 转/min离心15 min，分装上清液并置于-80℃保存。截取近端回肠8 ~ 10 cm，用冰生理盐水充分冲洗。取其中1 cm组织固定于4%多聚甲醛溶液中，其余肠段沿纵向剖开，用玻片小心刮取黏膜层，液氮速冻后置于-80℃保存。

1.5 HE染色与Chiu's评分评估肠黏膜病理损伤程度

经4%多聚甲醛充分固定后，肠组织样本进行石蜡包埋并切片(厚度5 μm)，行HE染色以观察组织病理学改变，并于光镜下采集代表性图像进行记录。采用Chiu's评分系统评估肠黏膜损伤程度，标准如下：0分表示组织结构正常；1分为绒毛顶端上皮下间隙增宽；2分为绒毛顶部上皮与固有层分离；3分为绒毛两侧片状上皮脱落；4分为绒毛上皮完全脱落仅存固有层；5分为黏膜全层崩解伴出血与溃疡形成。该分级标准为肠道屏障损伤程度提供了定量评估依据。

1.6 ELISA法检测血清iFABP与DAO浓度

严格按照商品化ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中iFABP和DAO的浓度。

1.7 免疫荧光染色技术检测紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)及PPAR-γ的表达与定位

采用免疫荧光染色技术检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及PPAR-γ的表达与定位。肠组织切片于室温晾干后，在65℃烘烤15 min。通过二甲苯及梯度乙醇(100%、95%、70%)依次浸渍进行脱蜡处理。使用柠檬酸盐缓冲液在65℃条件下进行抗原修复，继以3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶、0.2% Triton X-100透膜处理15 min。室温下经5%牛血清白蛋白封闭2 h后，切片分别与ZO-1(1∶200)、Occludin(1∶200)及PPAR-γ(1∶1 000)一抗在4℃孵育过夜。洗涤后，切片与相应种属的荧光二抗(Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 488标记)室温避光孵育2 h。采用荧光显微镜在相同曝光参数下观察并分析各蛋白在肠黏膜中的分布及表达水平。每组随机选取3只动物的肠组织切片，每张切片在荧光显微镜下采集3个具有代表性且不重叠的肠绒毛区域图像。图像采集与分析由不知晓分组情况的实验人员完成。每组最终数据以3只动物的均值±标准差表示。

1.8 Western blot检测肠上皮紧密连接蛋白与PPAR-γ表达

取-80℃保存的肠黏膜组织匀浆以提取蛋白质。采用BCA法测定蛋白浓度后，与上样缓冲液混匀并在95℃加热5 min。经电泳及转印至PVDF膜后，室温下用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h。随后，分别加入ZO-1(1∶1 000稀释)、Occludin(1∶1 000)及PPAR-γ(1∶1 000)一抗，4℃孵育过夜。充分洗涤后，室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h。使用增强型化学发光底物显影，并通过凝胶成像系统采集图像。每组随机选取3只动物的肠黏膜蛋白提取物进行电泳及Western blot检测，每份样本独立上样。以β-actin为内参，采用Image J软件分析目标蛋白条带灰度值。

1.9 ELISA法检测促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β)水平

取小肠黏膜组织匀浆上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α和IL-1β水平。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(\overline{x} ± s)表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，事后两两比较采用Tukey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物存活情况

在12 h的观察期内，48只实验小鼠均未发生死亡。

2.2 补液时机对肠屏障损伤及PPAR-γ表达的影响

2.2.1 小肠组织病理学改变

伤后12 h的组织学观察显示(图1A)，不同实验组呈现明显病理差异。Sham组肠道结构正常，绒毛排列整齐，细胞形态完整，未见炎症浸润及黏膜出血。PR组绒毛结构基本保持，但可见轻微黏膜下出血。3hR组出现明显的黏膜下出血及炎症细胞浸润，绒毛顶端可见Gruenhagen’s间隙形成。这些病理改变在6hR组更为显著，表现为黏膜下出血加重、炎症浸润范围扩大以及大量Gruenhagen’s间隙形成。NR组损伤最为严重，出现广泛黏膜下出血、显著炎症浸润，并伴有绒毛断裂、上皮片状脱落及部分固有层消化/溶解。肠道屏障损伤程度(通过Chiu's评分量化，图1B)与伤后补液延迟时间呈正相关。与Sham组相比，所有处理组(PR、3hR、6hR及NR)的Chiu's评分均升高(P＜0.01)。此外，3hR、6hR和NR组的评分高于PR组(P＜0.01)。与3hR组相比，6hR组和NR组的Chiu's评分均显著升高(P＜0.01)。

2.2.2 肠屏障通透性的变化

反映肠道屏障完整性的敏感指标血清iFABP与DAO浓度随伤后补液延迟呈进行性升高，提示肠道通透性呈时间依赖性恶化(图1C)。定量分析显示，与Sham组相比，所有干预组(PR、3hR、6hR及NR)的血清iFABP与DAO水平均升高(P＜0.01)。进一步分析表明，相较于PR组，3hR、6hR及NR组的上述标志物浓度均增高(P＜0.01)，证明肠道屏障功能障碍呈现时间依赖性加剧。此外，统计学分析提示：6hR组血清iFABP水平与3hR组相当，而NR组则显著升高(P＜0.05)。与3hR组相比，6hR组与NR组的血清DAO水平均升高(P＜0.05)。

2.2.3 紧密连接蛋白表达

免疫荧光(图2)和Western blot(图3)结果显示，随着烧伤后补液时间的延迟，肠上皮紧密连接蛋白ZO-1与Occludin的表达呈进行性减弱。与Sham组相比，PR组肠黏膜ZO-1与Occludin表达无显著差异，而3hR、6hR及NR组的表达均降低(P＜0.01)。定量分析表明，与PR组相比，3hR、6hR及NR组的ZO-1与Occludin表达均下降(或P＜0.05)。此外，相较于3hR组，6hR组与NR组的ZO-1及Occludin表达进一步降低(P＜0.05)。

2.2.4 小肠黏膜PPAR-γ的表达

免疫荧光与Western blot结果均证实，肠黏膜PPAR-γ表达水平随补液时间延迟呈现时间依赖性下调。与假伤组相比，各处理组(PR、3hR、6hR及NR)肠黏膜PPAR-γ表达均显著降低(P＜0.01或P＜0.05)。PR组与3hR组间差异无统计学意义；6hR组与NR组的PPAR-γ表达较PR组进一步下降(P＜0.01)。与3hR组相比，6hR组肠黏膜PPAR-γ表达差异无统计学意义，而NR组显著降低(P＜0.05)。见图4。

2.3 PPAR-γ干预对肠屏障损伤的影响

2.3.1 PPAR-γ表达调控

组织病理学观察(图5A)显示各组出现不同的肠黏膜损伤模式。6hR组绒毛结构尚存，但可见明显的炎症细胞浸润与黏膜下出血，并伴有大量绒毛顶端Gruenhagen's间隙形成。相比之下，6hRR组有所改善，表现为黏膜下出血减轻、炎症反应减弱以及Gruenhagen's间隙减少。而6hGR组则出现严重的结构破坏，包括绒毛断裂、上皮脱落、黏膜下出血以及部分固有层消化。肠道屏障损伤的Chiu's评分结果显示各处理组间存在差异。与6hR组相比，6hRR组的评分降低(P＜0.01)，而6hGR组的评分则升高(P＜0.01)。此外，与6hRR组相比，6hGR组的评分也升高(P＜0.01)。肠道屏障损伤的Chiu's评分结果显示各处理组间存在差异。与6hR组相比，6hRR组的评分降低(P＜0.01)，而6hGR组的评分则升高(P＜0.01)。此外，与6hRR组相比，6hGR组的评分也升高(P＜0.01，图5B)。

2.3.2 肠屏障通透性的变化

6hRR组肠道通透性生物标志物(iFABP与DAO)的血清浓度相较6hR组水平降低(P＜0.01，图5B)，而6hGR组较6hR组水平升高(P＜0.01)。此外，6hGR组的上述指标水平仍高于6hRR组(P＜0.01)。

2.3.3 紧密连接蛋白的表达

免疫荧光分析(图6)显示，与6hR组相比，6hRR组肠黏膜ZO-1与Occludin表达上调(P＜0.01)，而6hGR组则下调(P＜0.01)。此外，6hGR组的表达水平低于6hRR组(P＜0.01)。Western blot分析(图7)表明，与6hR组相比，6hRR组肠黏膜ZO-1与Occludin表达均上调(P＜0.01，P＜0.05)，而6hGR组则下调(P＜0.01，P＜0.05)。值得注意的是，6hGR组的表达水平低于6hRR组(P＜0.01)。

2.3.4 小肠黏膜PPAR-γ表达

免疫荧光(图8A、8B)及Western Blot(图8C、8D)分析表明，与6hR组相比，6hRR组肠黏膜PPAR-γ表达上调(P＜0.01，P＜0.05)，而6hGR组则下调(P＜0.01，P＜0.05)。6hGR组的PPAR-γ表达水平低于6hRR组(P＜0.01)。

2.3.5 炎症因子表达

ELISA结果显示(图8E)，与6hR组相比，6hRR组小肠黏膜中炎症因子TNF-α与IL-1β的表达均降低(P＜0.01)，而6hGR组中这些炎症因子的表达均升高(P＜0.01)。与6hRR组相比，6hGR组小肠黏膜中TNF-α与IL-1β的表达亦升高(P＜0.01)。

基金资助

国家重点研发计划(2024YFC3016604)

省部级课题