胚胎干细胞来源的区域化神经嵴细胞上清修复大鼠坐骨神经损伤的功能特异性研究

Functional specificity of supernatant from regionally patterned neural crest cells derived from embryonic stem cells in repairing rat sciatic nerve injury

摘要

背景 周围神经损伤是高发致残性疾病，神经嵴细胞治疗虽有效，但免疫排斥和致瘤风险限制了其临床转化，而神经嵴细胞上清对神经修复的功能尚未明确。 目的 探究人胚胎干细胞诱导的头颅神经嵴、躯干神经嵴细胞的上清对大鼠坐骨神经损伤的修复作用及功能特异性。 方法 通过调整无翅相关整合位点(wingless-related integration site，WNT)通路激活剂浓度及作用时间诱导获得头颅神经嵴与躯干神经嵴细胞，经磁珠分选纯化后，采用定量 Real-Time PCR检测SOX10、P75NTR等神经嵴特异性标志物及HOX家族区域特异性标志物表达水平，免疫荧光染色验证神经嵴细胞身份；构建大鼠坐骨神经离断伤模型，将实验动物随机分为对照组(control，CTRL组)、头颅神经嵴细胞来源上清组(cranial neural crest cells supernatant，CNC-S组)和躯干神经嵴细胞来源上清组(trunk neural crest cells supernatant，TNC-S组)，每组6只，分别采用负载基础培养基、头颅神经嵴上清、躯干神经嵴上清的聚己内酯导管桥接修复，术后通过免疫荧光染色检测血管生成(α-SMA、CD31)、轴突延伸(S100-β、NF200)相关指标，透射电子显微镜检测髓鞘厚度、G比率髓鞘生成相关指标，结合组织病理学分析各组修复差异。 结果 成功诱导的头颅神经嵴细胞高表达HOXA1、HOXB1基因，躯干神经嵴细胞高表达HOXA7、HOXB7基因，二者均稳定表达神经嵴标志物SOX10、P75NTR(P＜0.01)；CNC-S组和TNC-S组均能修复大鼠坐骨神经缺损伤，且与CTRL组比较，CNC-S组早期血管生成的α-SMA⁺CD31⁺阳性区域占比升高(P＜0.01)，TNC-S组轴突再生长度(P＜0.01)、髓鞘厚度(P＜0.01)均高于CNC-S组和CTRL组，其G比率更接近最佳值0.6，与其余两组比较差异有统计学意义。 结论 本研究探究了头颅神经嵴细胞上清与躯干神经嵴细胞上清在坐骨神经缺损伤修复中呈现区域化的功能特异性，CNC-S主导早期血管生成，TNC-S驱动轴突延伸与髓鞘成熟。该发现阐明区域化神经嵴上清的功能分工机制，为周围神经损伤提供精准化、序贯化无细胞修复新策略，为研发分型靶向的神经修复生物制剂提供一定的实验基础。

Abstract

Background Peripheral nerve injury is a highly prevalent disabling disease. The immune rejection and tumorigenic risks of cell therapy limit its clinical translation, while the functional specificity effect of the embryonic regionalization characteristics of neural crest cell supernatant on nerve repair remains unclear. Objective To investigate the reparative effect and functional specificity of the supernatant of cranial neural crest and trunk neural crest cells induced by human embryonic stem cells on sciatic nerve injury in rats. Methods Cranial neural crest and trunk neural crest cells were induced by adjusting the concentration and action time of WNT (wingless-related integration site) pathway activators. After purification via magnetic bead sorting, quantitative Real-Time PCR was adopted to detect the expression levels of neural crest-specific markers (such as SOX10 and P75NTR) and regional-specific markers of the HOX family, and immunofluorescence staining was used to verify the identity of neural crest cells. A rat model of sciatic nerve transection injury was established, and the experimental animals were randomly divided into control group (CTRL group), cranial neural crest supernatant group (CNC-S group) and trunk neural crest supernatant group (TNC-S group), with 6 rats in each group. Polycaprolactone conduits loaded with basal medium, cranial neural crest supernatant and trunk neural crest supernatant were used for bridging repair respectively. After surgery, immunofluorescence staining was performed to detect indicators related to angiogenesis (α-SMA, CD31) and axon extension (S100-β, NF200); transmission electron microscopy was used to detect myelin formation-related indicators including myelin thickness and G-ratio. The repair differences among groups were analyzed combined with histopathology. Results The successfully induced cranial neural crest cells highly expressed HOXA1 and HOXB1, while trunk neural crest cells highly expressed HOXA7 and HOXB7. Both cell types stably expressed neural crest molecules such as SOX10 and P75NTR (P＜0.01). Both the CNC-S group and TNC-S group significantly repaired sciatic nerve defect injury in rats. Compared with the CTRL group, the proportion of α-SMA⁺CD31⁺ positive areas for early angiogenesis in the CNC-S group was significantly increased (P＜0.01); the axon regrowth length (P＜0.01) and myelin thickness (P＜0.01) in the TNC-S group were significantly higher than those in the CNC-S group and CTRL group, and its G-ratio was closer to the optimal value of 0.6, with statistically significant differences compared with the other two groups. Conclusion This study demonstrates that cranial neural crest cell supernatant (CNC-S) and trunk neural crest cell supernatant (TNC-S) exhibit regionalized functional specificity in repairing sciatic nerve defect. CNC-S predominantly promotes early angiogenesis, whereas TNC-S drives axon extension and myelin maturation. These findings elucidate the mechanism underlying the functional division of regionalized neural crest supernatants, provide a novel strategy for precision and sequential cell-free repair of peripheral nerve injury, and lay an experimental foundation for the development of typed and targeted biological agents for nerve repair.

Graphical abstract

关键词

胚胎干细胞 / 神经嵴细胞 / 周围神经损伤 / 坐骨神经损伤 / 神经损伤修复 / 无细胞治疗 / 上清

Key words

embryonic stem cells / neural crest cells / peripheral nerve injury / sciatic nerve injury / nerve injury repair / cell-free therapy / supernatant

周围神经损伤作为全球高发的致残性疾病，其发病率与危害性已成为不容忽视的公共卫生问题^[1-2]。据统计，全球每年有数百万人因外伤、疾病等因素遭受创伤性神经损伤，患者常遗留严重后遗症^[3-4]。细胞治疗曾被视为潜在替代方案之一，其可通过细胞替代或旁分泌作用辅助神经修复，此前研究证实，神经嵴细胞移植可通过分化为施万细胞、释放营养信号促进神经再生^[5-6]。人诱导多能干细胞来源的神经嵴可以修复周围神经损伤，但该疗法存在一定局限，其中最关注的缺陷在于移植后的安全性隐患，这也是阻碍其临床转化的核心障碍，主要体现在免疫排斥与致瘤风险两方面^[7]。这些问题限制了细胞治疗的临床转化。直接移植的局限性促使研究者探索其分泌产物的治疗价值。而细胞上清具有易于储存、保质期长、细胞移植并发症少等优点，成为治疗周围神经损伤候选药物^[8]。

神经嵴可从胚胎干细胞、人诱导多能干细胞来源分离诱导获得，虽在成体组织中丰度较低，但其作为周围神经系统“祖细胞”，能分化为周围神经元、施万细胞等关键细胞类型，且可分泌多种神经营养因子调节损伤微环境，在神经修复中具备更精准的适配性并且可以改善神经损伤后的痛觉^[9]。胚胎发育过程中，神经嵴从神经管迁移至不同部位，形成了头颅神经嵴、躯干神经嵴、心脏神经嵴、肠神经嵴，发挥着不同的功能^[10-11]。既往研究未充分探究神经嵴的胚胎生态位。因此本研究利用胚胎干细胞，通过改变无翅相关整合位点(wingless-related integration site，WNT)通路激活剂的窗口，诱导出区域化神经嵴(头颅神经嵴和躯干神经嵴)细胞，获取其上清进行周围神经损伤修复，旨在为神经修复提供无细胞修复新策略。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

本实验所用胚胎干细胞系人ESC-H9(产品号DC-02)购买自中盛溯源生物科技有限公司(中国，安徽)。头颅神经嵴细胞和躯干神经嵴细胞均由该胚胎干细胞诱导而成。

1.2 主要试剂及仪器

Matrigel(CORNING，产品号354277)；Y27632(STEM CELL，产品号72302)；细胞消化液Accutase(Gibco，产品号A1110501)；P75NTR抗体(Abcam，产品号Ab52987)；S100-β抗体(Abcam，产品号Ab52642)；NF200抗体(Sigma，产品号N0142)；α-SMA抗体(Abcam，产品号Ab7817)；CD31抗体(Abcam，产品号Ab222783)；山羊抗兔-Alexa Fluor®594(Thermo Fisher，产品号A-11012)；山羊抗小鼠-Alexa Fluor®488(Abcam，产品号Ab150117)；ESSENTIAL 6 MEDIUM(Thermo Fisher，产品号A1516401)；ESSENTIAL 8 MEDIUM(Thermo Fisher，产品号A1517001)；FGF2 (R&D，产品号233-FB/CF)；SB-431542(Sigma，产品号S4317)；BMP4(MCE，产品号 HYP-7007)；CHIR(Sigma，产品号SML1046)；Anti-Mouse IgG1 MicroBeads(130-047-101，Miltenyi Biotec)；逆转录试剂盒(Vazyme，产品号R333-01)；qPCR试剂盒(Vazyme，产品号Q712-02)；4%多聚甲醛固定液(Beyotime，产品号P0099)；冷冻切片包埋剂(SAKURA，产品号4583)；冰冻切片机(Leica，产品号CM1950)；免疫染色封闭液(Beyotime，产品号P0102)；激光共聚焦显微镜(蔡司，产品号LSM780)；共聚焦全景扫描仪(3DHISTECH，产品号Pannoramic)；生物安全柜(ESCO)；磁珠分选仪(Miltenyi Biotec)。

1.3 胚胎干细胞的培养和扩增

将胚胎干细胞均匀种植在Matrigel上，使用Essential 8培养液维持培养，每日换液。每隔4 ~ 5 d用0.5 mmol/L EDTA传代一次。所使用的细胞均有正常核型。

1.4 头颅神经嵴和躯干神经嵴细胞的诱导培养

Matrigel在DMEM/F12中按1∶100的比例稀释，将12孔板在37 ℃下用稀释的Matrigel孵育30 min。用Accutase解离缓冲液分离胚胎干细胞至单细胞，并以10万/cm²的密度种植到含Matrigel的12孔板上，在含有10 mmol/L Y-27632的E6培养基中培养过夜。对于头颅神经嵴，次日将胚胎干细胞在含有SB431542、BMP4和0.6 mmol/L CHIR的E6培养液中培养2 d，切换到含有SB431542和1.5 mmol/L CHIR的E6培养液中培养10 d。对于躯干神经嵴，次日将胚胎干细胞在含有SB431542、BMP4、FGF2和1.5 mmol/L CHIR的E6培养液中培养4 d，切换到含有SB431542和1.5 mmol/L CHIR的E6培养液中培养15 d^[12]。

1.5 收集上清

本研究分为对照组(control，CON组)、头颅神经嵴细胞组(cranial neural crest cells，CNC组)、躯干神经嵴细胞组(trunk neural crest cells，TNC组)3组。将头颅神经嵴细胞和躯干神经嵴细胞以4×10⁴细胞/cm²的密度分别种植在六孔板中，待细胞融合度达到70% ~ 80%时，更换至无血清、无额外添加因子的DMEM/F12培养基中培养48 h，分别获得头颅神经嵴细胞上清和躯干神经嵴细胞上清。同时设置对照组，即六孔板中仅加入等量DMEM/F12培养基，同条件培养48 h后收集对照组上清。所有组别的样品均在500×g下离心10 min以去除细胞碎片，通过0.22 μm注射器过滤器过滤，使用JetSpin超滤离心管在4 500×g下离心2 min得到浓缩液，收集的上清在-80°C下保存备用。

1.6 磁珠分选

每10⁷个神经嵴细胞用80 μL缓冲液重悬细胞沉淀，加入20 μL Anti-Mouse IgG1 MicroBeads，充分混匀后在4℃中孵育15 min。加入CD49d抗体，4℃避光孵育5 min。每10⁷个神经嵴细胞加1 ~ 2 mL缓冲液洗涤，300×g离心10 min，彻底吸弃上清。最多10⁸个细胞用500 μL缓冲液重悬；细胞数量更多时，按比例缩放缓冲液体积。将柱体放入MACS分离器的磁场中，用3 mL缓冲液冲洗LS柱体，将细胞悬液上样到柱上，用3 mL缓冲液洗涤LS柱体，仅当柱储液器排空时才加缓冲液进行洗涤。将柱体从分离器中取出，置于合适的收集管上。向柱中加入5 mL分离缓冲液，立即用力将柱塞推入柱中，冲洗出磁性标记细胞。立即将洗脱和滞留的细胞离心沉淀，重悬于神经嵴维持培养基中。

1.7 SD大鼠坐骨神经离断伤模型的构建

本研究方案已经解放军总医院实验动物伦理委员会批准(批准号：2023-x4-19)。选取雌性Sprague-Dawley大鼠(180 g ~ 220 g)共18只，随机分为对照组(control，CTRL组)、头颅神经嵴细胞来源上清组(cranial neural crest cells supernatant，CNC-S组)、躯干神经嵴细胞来源上清组(trunk neural crest cells supernatant，TNC-S组)，每组6只。将Matrigel与各上清，对照组为等体积DMEM/F12培养基，按1∶1体积比混匀后，注入长度为1.2 cm的聚己内酯(polycaprolactone，PCL)导管中，经20 min孵育处理，制作成神经导管。对大鼠进行称重，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，在无菌环境下充分解剖暴露右侧坐骨神经。将坐骨神经切断，制备10 mm的坐骨神经缺损模型。在手术显微镜下，每组移植物均采用无张力8-0带线缝合关闭，其中神经导管缝合时，将切断的神经两端各固定1 mm到导管内。充分止血后，以4-0手术缝线逐层缝合肌层和皮肤，并以碘伏消毒切口。动物从麻醉中苏醒后，饲养在塑料笼中，自由饮水，光照/黑暗周期为12 h。

1.8 神经组织再生分析

桥接手术后第21天，每组随机选取3只大鼠，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。取出神经桥置于4%多聚甲醛中，于4℃固定24 h。样本经30%蔗糖脱水后，吸干水分包埋于最佳切割温度(optimal cutting temperature，OCT)包埋剂中，并用液氮快速冷冻。将神经移植物切成12 μm厚的纵向切片。桥接手术3个月后，每组剩余的3只大鼠通过腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。取出神经桥置于4%多聚甲醛中，于4℃固定24 h。样本经30%蔗糖脱水后，吸干水分包埋于OCT胶中，并用液氮快速冷冻，将神经移植物切成12 μm厚的横向切片。

1.9 免疫荧光染色检测血管生成、轴突延伸相关指标

将样品用4%多聚甲醛固定30 min后，PBS冲洗3遍，在山羊血清中孵育30 min。随后，细胞样本在SOX10，P75的一抗工作液中，用于检测轴突延伸的组织样本在S100-β，NF200的一抗工作液中，用于检测血管生成的组织样本在α-SMA，CD31的一抗工作液中于4℃孵育过夜。次日，用PBS洗3遍样品，然后在山羊抗兔-Alexa Fluor®594和山羊抗小鼠-Alexa Fluor®488的二抗工作液中于室温中孵育2 h。接着，样本用PBS冲洗3次，之后用DAPI孵育30 min，用水性封片剂封片，并使用激光共聚焦显微镜或共聚焦全景扫描仪进行成像。

1.10 定量Real-Time PCR(qPCR)检测神经嵴及区域特异性标志物表达水平

采用Vazyme试剂盒用于RNA提取和反转录，StepOne Real-Time PCR系统进行qPCR。相对基因表达归一化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)表达，并使用-2-ΔΔCT方法计算相对表达水平所有实验独立重复3次。表1列出了用于qPCR的引物序列。

1.11 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0.0进行统计学分析。实验数据先进行正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布且方差齐性的计量资料以均值±标准差(\overline{x}±s)表示。3组间整体比较采用单因素方差分析，进一步采用LSD法进行多重比较；仅两组间直接比较时采用Student's t检验。若数据不满足正态或方差齐性，采用非参数检验进行组间比较。所有检测均进行3次独立重复实验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 头颅神经嵴和躯干神经嵴细胞的鉴定

应用稳定高效的诱导头颅神经嵴和躯干神经嵴细胞的方案进行诱导。qPCR检测结果显示，随着培养时间的增加，头颅神经嵴、躯干神经嵴细胞中神经嵴标志物SOX10和P75的表达量逐渐升高(图1A、1B)。通过磁珠分选法分离CD49d⁺ bright细胞群，并进一步对这些细胞进行表征。在Matrigel包被的培养皿上进行贴壁培养，在体外培养过程中，贴壁细胞保持其典型的细胞形态和神经嵴特异性标记物的表达，如免疫染色所示(图1C)。同时头颅神经嵴和躯干神经嵴也表达出了各自特有的标志物。如HOX家族基因通常用作标记人类发育头尾轴的分子标志物，头颅神经嵴细胞中HOXA1、HOXB1基因表达水平显著升高，躯干神经嵴细胞中HOXA7、HOXB7基因表达水平显著升高(图1D)，各基因表达组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，这与先前的报道一致(图1D)。以上结果表明，成功诱导了头颅神经嵴和躯干神经嵴两种具有区域特性的神经嵴细胞。收集头颅神经嵴和躯干神经嵴细胞的上清进行后续实验。

2.2 躯干神经嵴细胞上清促进坐骨神经损伤后的轴突生成

为验证两种神经嵴来源细胞的上清对周围神经损伤的修复效能，本研究开展了大鼠坐骨神经离断修复实验。术后3周对神经移植物进行纵向免疫荧光染色及定量分析，结果显示，CNC-S组和TNC-S组S100-β⁺ NF200⁺阳性区域长度均长于CTRL组，TNC-S组S100-β⁺ NF200⁺阳性区域长度长于CNC-S组。各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)(图2A、2B)。

2.3 头颅神经嵴细胞上清促进大鼠周围神经损伤后的血管生成

术后12周对神经移植物进行横切免疫荧光染色及定量分析，结果显示，CNC-S组、TNC-S组α-SMA⁺ CD31⁺阳性区域占比均高于CTRL组，CNC-S组α-SMA⁺ CD31⁺阳性区域占比高于TNC-S组，各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)(图3A、3B)。

2.4 躯干神经嵴细胞上清促进坐骨神经损伤后的髓鞘生成

使用透射电子显微镜对移植物的远端部分进行半薄切片扫描，以评估移植物中的髓鞘厚度。术后12周透射电子显微镜检测结果显示，CNC-S组、TNC-S组髓鞘厚度均大于CTRL组，TNC-S组髓鞘厚度大于CNC-S组，各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)(图4A、4B)。G比率定量分析显示，TNC-S组G比率更接近0.6，与CNC-S组、CTRL组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，CNC-S组与CTRL组间G比率比较差异有统计学意义(P＜0.01)(图4C)。

3 讨论

胚胎发育过程中，神经外胚层在经过神经板凹陷、闭合形成神经管后，在神经管背侧与皮肤交界的位置形成了具有迁移性的神经嵴细胞^[12]。神经嵴细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，因其具有外胚层和中胚层的分化能力，且几乎参与了所有组织器官发育和成熟的过程，因此也被称为“第四胚层”^[13]。神经嵴从神经管迁移至不同部位，形成了头颅神经嵴、躯干神经嵴、骶神经嵴和迷走神经嵴。同时形成了不同的细胞和组织，不同区域神经嵴承担胚胎发育中的功能分工，正是本研究的生物学基础^[14-15]。神经嵴可从胚胎干细胞、诱导多能干细胞等来源分离诱导获得^[16-18]，虽在成体组织中丰度较低，但其作为周围神经系统的前体细胞，能分化为周围神经元、施万细胞等关键细胞类型，且可分泌多种神经营养因子调节损伤微环境，在神经修复中具备更精准的适配性并且可以改善神经损伤后的痛觉。既往研究多采用未区分区域的神经嵴细胞或其分泌物，忽略了神经嵴胚胎区域化带来的功能特异性，这也是本研究所探究的关键科学问题。

由人多能干细胞衍生的神经嵴细胞已经应用在多种领域。如多能干细胞来源的骶神经嵴和迷走神经嵴共同修复先天性巨结肠^[19]，人诱导多能干细胞来源的神经嵴干细胞球体促进神经损伤后神经肌肉再生^[18]。来源于人诱导多能干细胞诱导的神经嵴干细胞所衍生的周细胞修复缺血性脑卒中等^[20]。本研究围绕两种神经嵴细胞的上清的修复功能展开系统探讨，成功诱导并分离获得具有明确区域特性的头颅神经嵴与躯干神经嵴细胞，通过PCR技术(二者分别高表达HOXA1/HOXB1及HOXA7/HOXB7标志物，并稳定表达SOX10、P75等神经嵴特异性分子)^[20-24]、MACS分选技术及免疫荧光验证，提示所诱导细胞严格遵循神经嵴发育的区域化特征，为后续研究提供了标准化、高质量的细胞来源。

本研究的核心发现是验证了胚胎干细胞来源的区域化神经嵴上清在大鼠坐骨神经损伤修复中具有功能特异性：头颅神经嵴细胞来源上清优先主导损伤区域早期血管生成，为神经再生构建血供基础；躯干神经嵴细胞来源上清特异性驱动轴突延伸与髓鞘成熟，完成神经结构与功能修复。深入分析两种神经嵴上清功能差异的机制，推测其核心在于神经嵴细胞胚胎发育中形成的“区域化功能分工”特性——该特性在人多能干细胞诱导的头颅神经嵴与躯干神经嵴细胞中稳定保留，成为实验结果差异的底层生物学基础^[25]。本研究发现头颅神经嵴细胞上清在促进大鼠神经损伤后的早期血管生成中表现出显著优势，从胚胎功能定位来看，头颅神经嵴细胞的核心作用是参与颅面部组织发生，尤其在颅面部血管网络构建中发挥关键调控作用，可分化为血管周细胞、内皮支持细胞，并通过分泌血管相关因子维持血管稳态^[26-27]；既往研究证实，头颅神经嵴细胞衍生的成年干细胞(如下鼻甲干细胞ITSCs、口腔黏膜干细胞)在体外培养中，基因表达谱富集血管内皮生长因子^[9]、成纤维细胞生长因子等血管生成调控因子，且具备高效分化为血管间质细胞的能力。同时，头颅神经嵴细胞的胚胎生态位(如颅面部间充质、嗅球基质)以“高血管化、高代谢需求”为特征，需通过持续血管新生维持组织发育；既往蛋白质组数据显示，头颅神经嵴来源干细胞分泌产物中血管内皮生长因子R2配体、Wnt3a等血管相关成分含量显著高于躯干神经嵴干细胞，且NF-κB通路(调控血管内皮生长因子转录)基础活性更强，这种生态位适应性使得CNC上清在周围神经损伤修复中优先表现出促血管生成功能^[28]。

针对轴突延伸的检测结果显示，躯干神经嵴细胞上清的促轴突生成效果显著优于头颅神经嵴细胞上清和对照组。并且髓鞘生成的检测结果显示躯干神经嵴细胞上清的修复效果显著优于其余两组，其G比率更接近最佳值0.6，进一步印证了躯干神经嵴细胞上清对周围神经修复的特异性。这一结果源于躯干神经嵴细胞的胚胎区域化功能分工特性。躯干神经嵴细胞的胚胎核心命运是构建外周神经系统，其分化产物以施万细胞、感觉/交感神经元及神经纤维支持细胞为主；躯干神经嵴的胚胎生态位(如坐骨神经束、背根神经节间隙)以“神经纤维密集、依赖施万细胞功能”为核心特征，需通过施万细胞增殖、迁移及髓鞘合成维持神经稳态^[29]。研究表明，躯干神经嵴衍生的干细胞(如坐骨神经p75⁺NCSCs、背根神经节NCSCs)的转录组中，施万细胞活化相关基因(如P0、S100β)及轴突生长导向因子(如Netrin-1、BDNF)的表达水平显著高于头颅神经嵴来源细胞——这种对神经修复微环境的适应性，使得躯干神经嵴细胞的上清在调控施万细胞功能、促进轴突髓鞘再生中表现出突出优势^[30]。

本研究探讨人多能干细胞来源头颅神经嵴与躯干神经嵴细胞上清在周围神经修复中具有显著的功能特异性，该发现可对临床周围神经损伤相关疾病的治疗具有一定的指导意义和应用价值。对于外伤性周围神经损伤(如四肢骨折合并的坐骨神经、桡神经、尺神经离断伤，臂丛神经撕脱伤)，这类损伤常伴随局部血管床破坏、血供不足，且核心损伤为轴突和髓鞘的缺损，临床可采用头颅神经嵴上清联合躯干神经嵴上清的策略，先通过头颅神经嵴上清重建损伤区域血供，再利用躯干神经嵴上清促进轴突延伸和髓鞘再生，实现损伤区域的序贯修复^[31-32]；对于颅面部神经损伤(如面神经、三叉神经损伤)，这类损伤位于头颅区域，与头颅神经嵴的胚胎发育区域相匹配，头颅神经嵴上清可针对性促进颅面部损伤神经的血管再生和局部微环境修复，为颅面部神经损伤的精准治疗提供新方向^[33]；对于脊髓损伤合并的周围神经损伤，躯干神经嵴上清可有效修复外周轴突和髓鞘缺损，改善肢体的运动和感觉功能，为脊髓损伤的综合治疗提供补充策略^[34]。

此外，区域化神经嵴细胞上清作为无细胞治疗制剂，规避了细胞移植的免疫排斥和致瘤风险，且具有易储存、易制备、可批量生产的优势，更符合临床转化的要求。未来可基于本研究结果，开发针对不同类型周围神经损伤的个性化生物制剂：针对缺血为主的神经损伤，研发头颅神经嵴上清为主的制剂；针对轴突髓鞘缺损为主的神经损伤，研发躯干神经嵴上清为主的制剂；针对复合型神经损伤，研发二者的复合制剂。同时，可将区域化神经嵴细胞上清与新型生物支架材料(如取向性PCL支架、缓释水凝胶支架)结合，利用支架的物理引导作用和上清的生物活性作用，进一步提升周围神经损伤的修复效果^[35]。

本研究仍存在一定的局限性，如未对上清中的关键活性成分进行分离与鉴定，暂时无法明确介导血管生成、轴突延伸及髓鞘生成的核心因子，后续需通过蛋白质组学、代谢组学、脂质组学等技术筛选上清中的关键活性靶点，并验证其单独的修复作用。同时上清发挥修复作用的细胞信号通路仍需深入探究，可通过转录组学、基因敲除等技术明确关键信号通路及调控机制。本研究仅在大鼠模型中开展了实验，后续还需在大动物模型(如兔、犬)中验证区域化神经嵴细胞上清的修复效果和安全性，为临床转化提供更充分的实验依据。同时，还需开展临床前药代动力学、药效学研究，以明确区域化神经嵴细胞上清的最佳给药剂量、给药途径和治疗窗口期，并系统评估其长期应用的安全性与潜在生物学效应^[36]。

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