热射病(heat stroke，HS)是因环境温度过高、相对湿度过大所引起，以中枢神经系统损伤(谵妄、癫痫和昏迷)及严重高热(核心体温＞40℃)为主要特征的疾病，可迅速进展为多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction，MODS)，进而导致患者死亡[1]。HS可分为经典型热射病(classic heat stroke，CHS)和劳力型热射病(exertional heatstroke，EHS)。前者多见于老年及基础疾病较多的患者，因长期被动暴露于高温(和/或高湿)环境中发病；后者则多发生于年轻患者(如运动员、户外工作者和军人)，因处于高温环境中剧烈运动后发病[1]。随着全球气候变暖，HS发病率呈逐年升高态势。我国中暑监测系统的纵向研究显示：2010至2023年我国共报告HS病例86 406例，总体发病率为44.83/千万人年，且呈增长趋势[2]。高热对细胞的直接损伤、全身炎症反应和凝血功能紊乱被认为是HS发病机制的核心环节[3-6]。然而，目前HS的治疗策略仍依靠早期降温和器官功能支持，缺乏针对发病机制的治疗手段，其死亡率仍居高不下[7]。该监测系统数据显示，HS死亡率为0.89/千万人年；32.02%的病例为重症；总体病死率为1.98%，重症病例病死率为6.19%[2]。与CHS相比，EHS发生横纹肌溶解、严重肝损伤、急性肾损伤和凝血功能紊乱的风险更高，因而其死亡率更高[1]。解放军总医院(2011 — 2020年)数据显示，EHS患者一旦发生严重急性肝损伤，病死率可高达57%[8]。
近年来，程序性细胞死亡(如焦亡和坏死性凋亡)在HS发病机制中的作用受到广泛关注[3, 9]。脓毒症与HS在发病机制上既有重叠又有本质区别：相同点在于两者均可触发全身性炎症反应综合征，导致免疫失调、线粒体功能障碍、内皮损伤、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及MODS[10]；不同点在于脓毒症由病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)通过模式识别受体激活引发，而HS则源于热损伤导致的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)释放。此外，脓毒症中细菌内毒素可进一步增强凝血和炎症反应，该病理驱动环节为HS发病之初所缺失。中性粒细胞炎性死亡(NETosis)在脓毒症中的作用机制已得到充分证实[11]，该模式与脓毒症凝血功能紊乱[12]、全身炎症反应[13]和器官功能损伤(如肝[14]、肺[15]、肾[16]等)均密切相关。但其在HS疾病进展中的作用研究较少，且关键分子机制可能与脓毒症不尽相同。本综述旨在总结NETosis在HS及其导致MODS中的机制研究现状，并探讨靶向NETosis通路作为潜在治疗策略的科学依据与前景，以期为深入阐明热射病的发病机制和开发新型干预手段提供理论参考。
1 NETosis及其相关信号通路
NETosis是一种特殊形式的程序性细胞死亡。中性粒细胞激活后，可以向细胞外释放由降解的染色质(cell free DNA，cfDNA)和细胞内颗粒蛋白(如组蛋白)等组成的胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs的形成常伴随中性粒细胞死亡，这种新型的死亡方式被称为NETosis[17]。该术语一直广泛使用，直至2009年发现了非致死的NETs形成过程[18]。目前已鉴定出3种不同形式的NETosis：自杀型、活性型和线粒体NETosis[19]。
自杀型NETosis是NETosis的经典途径，是最终导致中性粒细胞裂解的终末过程。在这一类型的NETosis致病机制中，PAMPs或DAMPs可以与中性粒细胞表面的Toll样受体(toll-like receptor，TLR)或Fcγ受体结合，并通过两种途径介导NETosis[17]。一种是磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase，NOX]依赖途径：某些激动剂[如PMA，内毒素(lipopolysaccharide，LPS)或细菌]激活NOX，介导活性氧产物(reactive oxygen species，ROS)产生，导致一系列激酶的激活和颗粒蛋白[如髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)]的释放。这些激酶可激活转录因子，NE可以引起细胞骨架破坏，二者共同介导染色质降解[20]。另一种是NOX非依赖途径：某些激活剂(如钙离子载体A23187或离子霉素)可导致钙离子内流和细胞内钙离子浓度升高，进而促使线粒体产生ROS。此外，钙离子浓度升高还可以激活肽基-精氨酸去氨酶4(peptidyl arginine deiminase-4，PAD4)并协助其转移至细胞核，从而介导组蛋白3瓜氨酸化(citrullination of histone 3，CitH3)。在这一途径中，不同的激酶和转录因子协同瓜氨酸化，诱导染色质降解[20]。值得一提的是，抑制PAD4可抑制钙离子载体激活或志贺毒素激活的NETosis；但PAD4基因敲除小鼠的中性粒细胞在PMA激活下，也无法产生NETs，提示PAD4同时参与了NOX依赖和非依赖途径介导的NETosis[17]。最终，同时参与细胞焦亡的打孔蛋白GSDMD在NE的水解下激活，在中性粒细胞膜上形成孔道，释放出cfDNA并形成NETs[21]。此外，另一种打孔蛋白MLKL也可能参与了NETs释放[17]。据报道，脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)Ⅰ和Ⅲ可降解cfDNA；缺乏DNase Ⅰ和Ⅲ的小鼠模型在病原感染和中性粒细胞激活后，因无法降解NETs而导致死亡[22]。
目前关于“NETosis”这一术语使用的讨论仍在进行中。2018年，细胞死亡命名委员会建议，在有明确证据表明细胞死亡之前，不要使用“NETosis”一词[23]。然而，目前所有关于NETosis与HS的相关研究，仍局限于自杀型NETosis的范畴，因此本综述中的NETosis和NETs形成，均特指自杀型NETosis及在该过程中释放的NETs。
2 热射病患者血浆NETs组分水平显著升高——来自临床研究的直接证据
目前NETosis及其标志物在临床研究中的直接证据很少。一项前瞻性队列研究中，纳入了10例入住重症监护室(intensive care unit，ICU)的HS患者，获取知情同意后在入住ICU的24 h收集外周血样本。血清外泌体的蛋白质组学分析发现，与健康志愿者相比，HS患者外泌体中组蛋白H3、S100A8等NETs相关成分显著上调，且在严重HS患者中上调更加明显。进一步的京都基因与基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析显示，NETs形成通路在HS患者中被显著激活[24]。Wang等[25]回顾性分析了18例EHS患者的血清样本，并以健康志愿者作为对照，结果显示EHS发病时，患者表现出显著的中性粒细胞增多症。虽然治疗后数天内中性粒细胞计数恢复正常，但在整个7 d的随访期间，与对照组相比，患者血清MPO和NE水平仍持续显著升高，提示EHS患者外周血中性粒细胞可能长期存在NETs形成，即中性粒细胞处于一种长期的失调状态，可能会导致EHS幸存者出现急性组织损伤以及长期免疫并发症。
3 热应激不直接诱导NETosis，但却是NETosis的催化剂——来自体外实验的间接证据
中枢性高热是HS的核心特征。高热本身即可作为强烈的应激源，可直接作用于细胞导致器官功能损伤，但多个体外研究提示，热应激是NETosis的催化剂，即热应激本身并不会直接介导NETosis，但可放大其他刺激因素的作用。
有报道显示，将中性粒细胞短暂暴露于发热范围的高热(39.5℃)下1 h，本身并不会引起NETosis[26]。然而，如果先用高热处理细胞，再使用PMA或铜绿假单胞菌进行刺激，NETosis的进程会被显著加快，这一作用与热应激导致中性粒细胞内ROS水平升高有关。具体表现为，细胞核DNA解聚出现得更早，释放到细胞外的、与髓过氧化物酶共定位的DNA也更多，这一结果提示热应激是NETs形成的催化剂[26]。
不同温度对NETs形成的催化作用是否存在差异？Janko等[27]用体外实验回答了这一问题。该研究分离健康人外周血多形核白细胞(polymorpho-nuclear leukocytes，PMNs)在35 ~ 42℃条件下体外培养3 h，并分别加入感染性(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)和无菌性(线粒体)刺激物，以PMA作为阳性对照。结果发现与正常体温(37℃)相比，40℃时NETs形成增加；而35℃和42℃时该反应受到抑制。然而，40℃和42℃时中性粒细胞对两种细菌的吞噬作用并无差异。NETs诱导TLR-9介导的核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化的能力与温度无关，提示温度不影响NETs的免疫原性。此外，较高温度下NETs的降解增强，这与血浆DNase活性随温度升高而增加的趋势一致[27]。上述研究表明，温度是NETs稳态的关键调控因子。在热应激条件下，中性粒细胞吞噬功能与NETs形成功能可共存，尤其在发热温度下两者均增强，颠覆了传统认为二者互斥的观点。极端高热则导致NETs降解加快和形成受损，导致免疫失衡。
Wang等
[28]利用小鼠骨髓中性粒细胞在体外进行热应激(42℃，2 h)实验，发现细胞ROS产生增加，CitH3表达上调，对其上游转录因子Cebpe敲降后，则细胞ROS产生减少，CitH3表达下调。但这一研究并未探索细胞外NETs标志物的表达，如MPO-DNA等，因此尽管这一研究提示热应激可能直接诱导NETosis，但仍需进一步研究确认。此外，上述研究均是在离体条件下进行，还需通过体内实验中进一步证实(
表1)。
4 NETosis参与HS所致MODS——来自体内实验直接证据
动物实验为NETosis介导HS致MODS提供了线索。一项HS狗模型的研究显示，血清组蛋白水平在患病组与对照组之间具有显著差异，且与其他HS严重程度生物标志物之间显著正相关，并在重症犬中进一步升高[29]。在啮齿类动物中，通过联合高温和LPS诱导HS，其NETs标志物(血清CitH3)水平显著高于对照组，且源自HS的NETs促进了DIC的发展：DNase I通过清除中性粒细胞聚集形成的NETs，可以改善凝血功能障碍，并提高小鼠的存活率[30]。小鼠HS引起的肝损伤模型中，打击结束后3、6和9 h，HS小鼠血浆游离DNA和MPO-DNA浓度以及肝组织CitH3和MPO水平均随时间呈进行性升高，且显著高于对照组，提示NETs在HS肝损伤的发病中起重要作用，其机制可能是通过激活Nlrp3炎性小体/IL-1β信号通路介导热应激肝损伤。此外，利用氯脒降解NETs可以减轻HS引起的肝损伤[31]。
单细胞测序为NETosis参与HS发病机制提供了更加直接的证据。Wang等[28]建立HS小鼠模型，分离肺和肝组织的免疫细胞进行单细胞组学测序，发现CD177+中性粒细胞是肝、肺损伤的主要参与亚群。免疫荧光显示肝、肺组织中NETs(MPO+CitH3)显著升高，利用DNase Ⅰ和PAD4抑制剂可以改善小鼠肝、肺损伤并降低病死率。此外，Cebpe是Cd177+中性粒细胞分化的关键转录因子。热应激(42℃，2 h)诱导中性粒细胞Cebpe、Cd177、ROS、CitH3表达升高；siRNA敲降Cebpe可抑制Cd177表达、ROS产生和CitH3表达。这一研究为NETosis参与HS介导的MODS提供了有力证据。提示中性粒细胞是HS多器官损伤的核心免疫细胞且异质性显著。同时，不同器官(肝、肺)在HS中呈现相似的免疫变化，提示存在共同的干预机制，可能是HS介导MODS治疗的线索。
5 NETosis介导HS的借鉴性证据——基于其他细胞/疾病研究的理论推测
5.1 热应激可升高内皮细胞内ROS水平
在极限高热的情况下，将人脐静脉内皮细胞和肺微血管内皮细胞在体外行热应激(43℃，2 h)实验，血管内皮细胞内的ROS水平升高，而NOX2的激活是ROS积累的关键上游事件[32]。这提示高热可能直接或间接诱导中性粒细胞内NOX2衍生的ROS爆发性产生，从而启动NETosis程序。
5.2 NETosis是连接炎症反应和血栓形成的核心机制
NETosis是连接包括脓毒症在内的其他多种疾病中炎症、凝血[33]和器官损伤[14-15]的重要桥梁。NETs的主要成分包括CitH3、cfDNA、MPO和NE等，这些成分除了可以发挥清除病原体作用以外，也可以进一步激活单核吞噬系统，引起级联炎症瀑布反应，并进一步促进凝血与内皮损伤[34]。更重要的是，NETs还包含促凝因子(如组织因子、vWF因子和纤维蛋白原等)，可促进凝血酶形成，同时干扰生理性抗凝途径(抗凝血酶、蛋白C系统)。凝血酶激活血小板后又可进一步促进NETs形成。因此，NETosis可以造成严重的全身炎症反应和凝血功能紊乱，在脓毒症引起的DIC[35]、肝素诱导的血小板减少症[33]、血栓性微血管病[13]等多种炎症-凝血过度激活的相关疾病中发挥了核心作用。
全身炎症反应和凝血功能紊乱之间的交互作用是HS器官功能损伤的核心机制[5-6]。在HS发病过程中，极端高热可引起线粒体功能障碍，直接导致组织细胞损伤和坏死，释放出大量的DAMPs。这些内源性危险信号在激活先天免疫反应，特别是NETosis中起着至关重要的作用[36]。释放的DAMPs包括高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)、ATP和热休克蛋白等。其中，线粒体DAMPs(mtDAMPs)包括mtDNA、ATP、心磷脂、细胞色素C、琥珀酸、血红素、甲酰化肽等，具有类细菌分子特征，可被通常用于识别病原体的PRRs识别，是NETosis的强效诱导剂[36-38]。DAMPs与受体结合后，可激活下游如NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等关键信号通路。这些通路的激活促进促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)的表达和释放。HS患者血清中炎症因子如IL-6水平显著升高[39]。这些炎症因子本身又能进一步激活和招募中性粒细胞，并与ROS信号协同，形成正反馈环路，强烈诱导NETosis。因此，理论上，NETosis在HS发病机制中扮演了核心性角色。
补体系统的广泛激活是HS另一个关键的病理事件[39]。C3a、C5a生成，增强中性粒细胞NETs释放，促进血小板聚集，形成正反馈循环。补体激活、凝血功能障碍和内皮损伤共同构成了热射病中的“免疫血栓形成”(immunothrombosis)的病理基础[40]。虽然直接探讨HS中补体激活与NETosis关系的研究有限，但在其他炎症模型中，补体系统与凝血功能紊乱和NETosis的关联已被证实[41]。
6 靶向NETosis治疗的研究展望
热应激可以介导线粒体损伤并影响中性粒细胞功能[36]。mtDAMPs通过类细菌分子特征激活中性粒细胞，在无菌性炎症中介导NETosis，是创伤、自身免疫病、缺血再灌注损伤等疾病的重要病理机制，也可能在HS诱导的NETosis中发挥重要作用。针对mtDAMPs-NETs轴的治疗策略可从线粒体保护、受体阻断、信号通路抑制、NETs清除四个层面展开。值得注意的是，由于不同疾病引起的NETosis介导的器官损伤具有异质性，这些策略均基于其他疾病研究，迄今尚无针对HS的治疗研究，因而仅可作为HS治疗研究的线索。上游策略聚焦于线粒体保护，旨在从源头减少mtDAMPs的释放，代表药物包括线粒体靶向抗氧化剂(如MitoQ、SkQ1)和线粒体通透性转换孔抑制剂(如环孢素A)，但多数仍处于临床前或早期临床阶段。中上游策略针对受体-配体相互作用，通过阻断mtDAMPs与模式识别受体的结合来抑制NETosis启动，如TLR9拮抗剂(羟氯喹)、cGAS-STING抑制剂(RU.521)、FPR1拮抗剂(HCH6-1)等，但通路冗余性限制了单一受体阻断的疗效。中游策略干预信号转导通路，包括PAD4抑制剂(GSK484、Cl-amidine)通过抑制组蛋白瓜氨酸化阻断染色质解凝，以及针对NOX、MAPK等通路的抑制剂，但需警惕长期抑制对宿主防御功能的影响[34]。下游策略侧重于NETs清除，主要利用重组DNase I降解NETs骨架DNA，减少其在微血管中的沉积与毒性，然而临床试验中疗效受限，提示需优化给药途径与联合方案。鉴于NETosis通路的复杂性与中性粒细胞的异质性，且上述靶点机制均尚未在HS中获得证实，未来治疗可以考虑转向多靶点联合(如TLR9阻断联合PAD4抑制)、时序性干预(早期线粒体保护、中期信号阻断、后期NETs清除)以及生物标志物指导的个体化策略，以期在抑制病理性NETosis的同时保留抗菌免疫功能[38]。
一些临床研究开始探索直接调控NETosis关键分子在众多NETosis相关疾病（如缺血性卒中[42]、糖尿病肾病[43]和风湿性关节炎[44]）中的治疗作用(包括临床前研究和临床研究)。NE抑制剂是临床应用和研究最为深入的药物。第一代NE抑制剂Sivelestat已在急性呼吸窘迫综合征[45]、慢性阻塞性肺疾病[46]和造血干细胞移植后闭塞性细支气管炎综合征[47]等系统疾病中已经开展临床研究，且已在我国上市用于治疗急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。有研究发现，抑制NE可重塑含铝佐剂的注射疫苗所引发的先天免疫应
国家自然科学基金面上项目(82472238)
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