基于工程化巨噬细胞治疗小鼠骨骼肌损伤修复

摘要

背景 骨骼肌损伤修复是组织再生领域的重要研究前沿，深入揭示其细胞与分子调控机制对于应对运动损伤、人口老龄化及退行性疾病具有重要意义。目的 该研究旨在通过工程化改造巨噬细胞，构建稳定表达胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）且缺失促纤维化因子转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF-β）的细胞，评估其在骨骼肌损伤修复中的作用及潜在应用价值。方法 利用RAW264.7小鼠巨噬细胞系，通过CRISPR-Cas9技术敲除巨噬细TGF-β基因，继而利用慢病毒介导IGF-1稳定表达，构建稳定表达IGF-1且缺失TGF-β的工程化巨噬细胞(IGF1^secTGFβ^koM)。采用蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验对细胞进行鉴定，并通过转录组学分析描绘其与对照细胞的差异表达。将120只C57BL/6鼠随机分为6组，分别为正常对照组（NC）、PBS对照组、野生型巨噬细胞组（M）、TGF-β敲除巨噬细胞组(M-TGF^ko)、IGF1^secTGFβ^koM治疗组(IGF1M-TGF^ko)和重组IGF1蛋白组，于损伤后7 d和14 d利用CatWalk系统对小鼠站立时间、摇摆时间、足印面积及强度等进行统计，处死取肌组织进行HE、Masson染色并定量分析，荧光实时定量验证IGF1、Pax7、TNF和IL-1β表达情况。结果 成功构建IGF1^secTGFβ^koM细胞。Western blot显示TGFβ^koM细胞TGF-β蛋白表达缺失，IGF1^secTGFβ^koM的IGF1表达显著增强；ELISA检测IGF1^secTGFβ^koM的IGF-1分泌量相比M升高32倍（P<0.001）。转录组分析发现，与M组比较，IGF1^secTGFβ^koM组中IGF1表达上调，TGFβ下调，差异基因富集于JAK-STAT、PPAR、ECM-受体相互作用等通路(P_adj<0.05)。qPCR检测显示，与PBS组比较，IGF1M-TGF^ko组7 d的IGF1（P<0.001）和Pax7（P=0.038）表达升高，TNF（P=0.007）、IL-1β（P<0.001）短暂升高；14 d时IGF1因子（P<0.001）和Pax7因子（P<0.028）持续升高，炎症因子恢复正常（P>0.05）。步态分析显示，与PBS组比较，IGF1M-TGF^ko组7 d的支撑时长[（0.189±0.025）s vs（0.154±0.040）s,P=0.043]、摆动时长[（0.140±0.017）s vs（0.109±0.016）s,P=0.017]和足印面积[（0.385±0.057）cm² vs（0.485±0.079）cm²,P=0.009]均显著改善。14 d时功能恢复持续优于对照组。组织学检测表明，IGF1M-TGF^ko组7 d肌纤维直径[（51.09±17.95）μm vs（39.39±17.65）μm,P=0.002]和横截面积[（1 287.48±734.42）μm² vs（730.23±599.48）μm²,P=0.040]显著增大。IGF1M-TGF^ko组14 d肌纤维直径[（57.47±13.86）μm vs（46.79±11.54）μm,P=0.002]和横截面积[（1 698.86±458.11）μm² vs（999.24±150.81）μm²,P=0.040]进一步增大，胶原纤维面积（0.69%±0.56%vs 6.66%±2.78%,P=0.043）显著减少。结论 工程化巨噬细胞注射加速了小鼠骨骼肌功能恢复，减少了损伤肌肉组织的纤维化。

关键词

巨噬细胞 / 胰岛素样生长因子-1 / 转化生长因子β / 骨骼肌 / 损伤