芍药苷通过抑制JNK/p38信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤

Alleviation of traumatic brain injury in rats by inhibiting the JNK/p38 signaling pathway with paeoniflorin

摘要

目的 探讨芍药苷（PF）通过调节JNK/p38信号通路对大鼠创伤性脑损伤（TBI）后的脑水肿、神经元凋亡、炎症反应、血脑屏障及神经功能的影响。 方法 采用Feeney法建立TBI模型，SD大鼠随机分为假手术组、TBI组和芍药苷组（TBI+PF组），芍药苷组给予20 mg·kg^-1·d^-1腹腔注射。分别于术后第1天、第3天、第5天、第7天进行神经功能评分和脑含水量测定；第3天进行病理检查，TUNEL染色，ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TIMP-1水平，qRT-PCR检测JNK和p38 mRNA表达。 结果 与假手术组相比，TBI组神经功能评分和脑含水量显著升高，神经元损伤加重、凋亡增加，TNF-α、IL-6、MMP-9、JNK和p38 mRNA表达上调，TIMP-1 mRNA表达下调（P＜0.05）；与TBI组相比，TBI+PF组在第3天、第5天、第7天评分和脑水肿显著改善，神经元结构更完整，凋亡减少，TNF-α、IL-6、MMP-9、JNK和p38 mRNA表达明显下调，TIMP-1 mRNA表达明显上调（P＜0.05）。 结论 芍药苷可能通过抑制JNK、p38信号通路减轻血脑屏障的破坏，降低毛细血管通透性，减轻脑水肿，抑制炎症反应、减少神经元凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effects of paeoniflorin (PF) on brain edema, neuronal apoptosis, inflammatory response, blood-brain barrier, and neurological function after traumatic brain injury (TBI) in rats by regulating the c-Jun N-terminal kinase (JNK) /p38 mitogen-activated protein kinase (p38) signaling pathways. Methods A TBI model was established in Sprague-Dawley (SD) rats using the Feeney method. The SD rats were randomly divided into the sham-operated group, the TBI group, and the paeoniflorin group (TBI+PF group). The paeoniflorin group received intraperitoneal injection of paeoniflorin at a dose of 20 mg·kg^-1·d^-1. Neurological function scores and brain water content were measured on postoperative days 1, 3, 5, and 7. On the third day, pathological examination was performed, TUNEL staining was performed, ELISA was used to detect the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) and TIMP-1, and the expression of JNK and p38 mRNA was detected by qRT-PCR. Results Compared with the sham-operated group, the TBI groups showed significantly increased neurological function scores and brain water content, aggravated neuronal damage, increased apoptosis, up-regulated expression of TNF-α, IL-6, MMP-9, JNK and p38 mRNA, and dow-nregulated TIMP-1 mRNA expression (P<0.05). Compared with the TBI group, on days 3, 5 and 7, the TBI+PF group exhibited significantly improved neurological function scores, reduced brain edema, more intact neuronal structure, decreased apoptosis, significantly down-regulated expression of TNF-α, IL-6, MMP-9, JNK and p38 mRNA, and significantly up-regulated TIMP-1 mRNA expression (P<0.05). Conclusion Paeoniflorin may reduce blood-brain barrier disruption, decrease capillary permeability to alleviate cerebral edema, and inhibite inflammatory responses and reduce neuronal apoptosis by inhibiting the JNK and p38 signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

芍药苷 / 创伤性脑损伤 / c-Jun氨基末端激酶 / p38丝裂原活化蛋白激酶 / 神经保护

Key words

paeoniflorin / traumatic brain injury / c-Jun N-terminal kinase / p38 mitogen-activated protein kinase / neuroprotection

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是指由于机械能对头部造成的物理损伤，导致脑组织损伤^[1]，是世界范围内一个重大的健康问题，每年约有69万人发生TBI。尽管近年来对TBI病理生理学的认知有所提升，但尚未转化为有效的临床疗法^[2]。TBI包括原发性和继发性损伤^[3]，原发性损伤引起局部神经元的破坏，继发性损伤始发于炎症反应，随后是血脑屏障的破坏、外周血细胞浸润、脑水肿以及多种免疫介质的排出^[4]，这会导致神经元凋亡，最终影响神经功能。原发性损伤是一过性的、不可逆的，研究重点应转为如何预防及治疗继发性损伤，并探究其机制^[5]。

芍药苷（paeoniflorin，PF），一种单萜糖苷，是芍药中的主要生物活性化合物之一，研究^[6]发现芍药苷在腹腔给药后可通过血脑屏障并可在给药后30 min在脑组织中检测到。现代研究^[7-11]表明其具有减轻炎症和氧化应激反应，调节神经递质平衡，改善脑血流，减缓神经元凋亡，保护神经元和改善认知功能的作用。但芍药苷对TBI的作用鲜有报道，所以本研究旨在探讨其对TBI后大鼠的继发性脑损伤的作用及机制。

1 材料

1.1 实验动物

117只7周龄Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，体质量（220±20）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。所有大鼠健康状况良好，无神经系统疾病、运动功能异常或感染等情况。饲养温度为22～25℃，相对湿度为50%～60%。动物伦理编号为EC-022-185。

1.2 实验药品

芍药苷（北京索莱宝科技有限公司，P0500）；尼氏染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，G1430）；TUNEL细胞凋亡试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，T2195）；大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）、TIMP-1 ELISA试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，ER1393、ER0042、ER0139、ER0064）；RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP451）；逆转录试剂盒（天根生化科技有限公司，KR116）。

2 方法

2.1 动物分组及造模

实验大鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组、TBI组和芍药苷组（TBI+PF组），每组39只。除假手术组外，其余大鼠均采用改良Feeney DM法建立创伤性脑损伤模型。具体方法如下：麻醉后沿头皮正中切开皮肤及皮下组织，暴露颅骨骨膜，以骨拨轻柔分离骨膜，使用止血钳牵开双侧皮肤充分显露手术区域。定位于冠状缝前约3 mm、矢状缝右侧约3 mm处，以该点为中心磨制直径约5 mm的圆形骨窗，注意保持硬膜完整。将撞击针置入骨窗，将40 g砝码沿金属导管自25 cm高度自由落体击打右侧大脑半球。术后以棉球按压止血，碘伏消毒后缝合头皮。假手术组仅建立骨窗，不进行打击。造模完成后以改良Bederson评分评估神经功能，评分＞2分判定为造模成功^[12]。

2.2 给药方法

造模成功后开始给药。芍药苷组每日给予芍药苷溶液20 mg·kg^-1，溶于生理盐水后腹腔注射大鼠；TBI组和假手术组给予等体积生理盐水腹腔注射大鼠^[13]。

2.3 实验方法

2.3.1 神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）与脑组织含水量测定

于造模后第1天、第3天、第5天、第7天从各组中分别随机抽取6只大鼠对其测试，测试包括运动、感觉、反应和平衡等方面的能力，最高分数18分，评分愈高损伤愈重，由对本试验分组及内容不知情的人士评分。评分后取脑，用吸水纸吸去表面血液，测定锡纸重量后包裹，称湿重，置入45℃烘箱烘烤72 h至恒重，称干重。脑含水量%=（湿重-干重）/湿重×100%^[14]。

2.3.2 脑组织病理学观察（尼氏染色）

每组分别随机选取5只造模3 d后的大鼠，经麻醉后，固定于铁丝网上，置于不锈钢托盘中，开胸找出心脏并轻轻剥离，提起左心室刺入灌流针，于右心耳破洞，灌注0.9%氯化钠溶液，见肝和肺变白，流出液清亮后，灌注4%多聚甲醛溶液，大鼠出现四肢抽动，后大鼠四肢逐渐伸直、全身逐渐僵硬，取脑后置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h，石蜡包埋后切片，尼氏染色后显微镜下观察并拍照。

2.3.3 神经元凋亡检测

TUNEL染色前步骤同“2.3.2”，染色后在荧光显微镜下观察，Image J软件统计凋亡神经元数量。凋亡率=凋亡神经元数/总神经元数×100%。

2.3.4 ELISA法检测TNF-α、IL-6、MMP-9和TIMP-1含量

每组分别随机选取造模3 d后大鼠5只，切取脑损伤灶及边缘3 mm区域，组织匀浆，离心后取上清液，严格按说明书检测。

2.3.5 qRT-PCR法检测脑组织中JNK和p38的mRNA表达水平

每组分别随机选取造模3 d后大鼠5只，严格按照说明书进行RNA的提取、逆转录及扩增，β-actin作为内参基因，2^-ΔΔCt法计算各组目的基因的表达水平。引物序列见表1。

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0分析实验数据，计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 芍药苷对TBI后大鼠神经功能缺损评分的影响

见表2。

3.2 芍药苷对TBI后大鼠脑组织水肿的影响

见表3。

3.3 芍药苷对TBI后大鼠脑皮层神经元形态的影响

假手术组神经元排列规整，尼氏体数量多，染色深且均匀；TBI组神经元排列杂乱，尼氏体数量减少，可见核固缩、核碎裂、核溶解；与TBI组比较，芍药苷组神经元排列更为齐整，数量更多，尼氏体数量更多且染色更深，神经元形态更正常。见图1。

3.4 芍药苷对TBI后大鼠神经元凋亡的影响

假手术组神经元无凋亡，TBI组及芍药苷组神经元凋亡较多，凋亡率分别为（72.84±1.25）%、（57.38±3.44）%，均明显高于假手术组（P＜0.05），芍药苷组凋亡率较TBI组更低（P＜0.05）。

3.5 芍药苷对TBI后大鼠TNF-α、IL-6、MMP-9和TIMP-1表达的影响

见图2。

3.6 芍药苷对TBI后大鼠脑组织中JNK与p38 mRNA表达的影响

见图3。

4 讨论

TBI是一个重要的公共卫生问题，在全球范围内造成了重大的健康负担，可以由多种原因引起，如交通事故、体育活动中的撞击、战争及家庭暴力等^[15]。机械损伤导致的原发性损伤如轴突破坏、神经元损伤等不可逆转，而继发性损伤通常包括细胞凋亡、神经炎症、氧化应激等过程，在TBI后一段时间内持续发生，对脑组织进一步造成损害，因此继发性损伤是研究TBI治疗的重点。本研究通过建立TBI模型探究芍药苷对TBI后继发性脑损伤的神经修复作用机制。

芍药苷的用药方式多样，主要包括口服、皮下注射、静脉注射、腹腔注射及鼻腔给药。药代动力学研究^[16]表明，芍药苷的口服生物利用度较低。其在肠道内可能部分被转化为苯甲酸，这可能是其能够进入大脑发挥抗抑郁作用的机制之一。研究表明，芍药苷经非口服途径给药后可在脑组织中检测到。例如：夏素梅等^[17]通过大皮下给药，何希辉等^[18]通过静脉给药，分别利用色谱-质谱联用或HPLC方法在大鼠海马中检测到芍药苷。张小军等^[6]的研究进一步显示，腹腔注射芍药苷后，发现药物可以分布于杏仁核、丘脑、下丘脑和海马等多个脑区，给药30 min后达到浓度峰值。尽管多种给药方式都能使芍药苷入脑，但目前仍不清楚其穿透血脑屏障的机制，未来如果想要提升其对中枢神经系统疾病的疗效，首先要研究其跨越血脑屏障的药效动力过程及具体机制，降低给药剂量并提高脑内有效浓度。

芍药苷具有改善脑血流、减少神经元死亡、减轻炎症反应和氧化应激等作用。罗娴秦等^[19]研究发现芍药苷在血管性痴呆模型中发挥抗炎作用从而改善神经元损伤及凋亡，靶点为抑制mTOR/NF-κB信号通路下游M1小胶质细胞促炎症因子的释放，和激活大麻素受体2/PI3K/Akt信号通路，促进小胶质细胞从M1表型向M2表型的转化。王涛等^[20]研究发现，芍药苷可抑制氧化应激反应及减少神经元凋亡来减轻蛛网膜下腔出血后第3天时的脑组织水肿，具有保护血脑屏障的能力及神经保护修复作用，与Nrf2/HO-1通路相关。本研究发现，芍药苷能够显著降低神经功能缺损评分、脑含水量、炎症因子TNF-α、IL-6水平，减少神经元凋亡和血脑屏障损伤，提示芍药苷能有效地起到对TBI后大鼠的神经修复作用。

JNK（c-Jun N-terminal kinase）信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的重要成员，也被称为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）。JNK通路在细胞的应激反应、细胞分化、细胞凋亡、炎症反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着关键作用。孙静等^[21]研究发现芍药苷可通过抑制p-ERK和p-JNK的蛋白表达起到抗过敏性炎症的作用。丛超^[22]研究发现芍药苷可通过MKK4-JNK信号通路抑制下丘脑神经元凋亡，起到神经保护作用。唐红丽等^[23]研究发现在缺血性脑损伤中，芍药苷可通过JNK信号通路抑制TNF-α、IL-6的表达起到神经保护作用。p38信号通路（p38 MAPK signaling pathway）是细胞内重要的信号传导系统之一，属于MAPKs家族的分支。该通路通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平，参与细胞生长、发育、分化及死亡等多种生理过程。p38 MAPK通路在炎症反应、细胞应激响应、细胞周期调控等方面发挥关键作用，并且在多种疾病的发生和发展中扮演重要角色。吴福斌等^[24]研究发现芍药苷可通过抑制p-JNK和p-p38的表达起到抑制心肌细胞凋亡的作用。王少军等^[25]研究发现芍药苷可逆转脂多糖（lipopolysac-charide，LPS）诱导的p38磷酸化的增加来降低IL-6和TNF-α的表达并抑制心肌细胞凋亡。张彤帅等^[26]研究发现抑制p38/MAPK/SGK1通路可对血脑屏障有保护作用。顾欣怡等^[27]研究发现芍药苷可通过增加Bcl-2/Bax比值和抑制caspase-3的活性抑制神经元凋亡，下调p-p38 MAPK表达来降低炎症反应。Marika Massaro等^[28]研究发现抑制p38通路可减少血脑屏障相关蛋白MMP-9的表达。苏彦等^[29]研究发现通过抑制p38的磷酸化可降低MMP-9的表达，提高TIMP-1的表达，这提示p38信号通路可影响血脑屏障。本研究发现芍药苷治疗后JNK和p38表达明显下调，提示芍药苷可能通过抑制JNK、p38信号通路来减少炎症反应和神经元凋亡，并对血脑屏障产生保护作用。

综上，芍药苷具有一定的神经保护作用，其可能通过抑制JNK、p38信号通路减轻血脑屏障的破坏，降低毛细血管通透性减轻脑水肿，抑制炎症反应、减少神经元凋亡而起作用。但目前仍存在不足，未进行更进一步的对于JNK和p38下游相关因子的研究。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划项目(212102310708)

河南省神经修复重点实验室开放课题(HNSJXF-2021-001)