腹泻病是引起5岁以下儿童发病和死亡的主要原因之一，其特征是大便呈稀水或伴有黏液血便，每日3次以上
[1]，严重者可导致脱水、营养不良、影响其生长发育，其发病与肠黏膜屏障结构及功能损伤密切有关
[2]。肠道黏膜屏障可有效阻隔外源性病原体、抗原性物质及内毒素等有害成分的跨膜转运，并调控上皮细胞分泌功能及免疫细胞交互作用，动态维持着肠道微生态平衡与内环境稳态，在机体黏膜免疫防御网络中占据核心地位
[3]，主要包括：机械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化学屏障
[4]。因此保护肠黏膜屏障功能是治疗腹泻病的关键所在。
中医药治疗儿童腹泻具有较好的临床疗效，腹泻病属于祖国医学中“泄泻”范畴，若失治误治或治疗不及时，亦或起病急骤易致泻下无度、水液耗失、阴津受劫、液亏气伤而发展为气阴两伤型腹泻，该证型亦是临床治疗难点。人参乌梅汤原为清代吴鞠通《温病条辨》久痢伤阴而设，诸版《中医儿科学》
[5]及中医儿科指南均将其设为气阴两伤型常用方剂，课题组前期在原方基础上化裁为加味人参乌梅汤治疗气阴两伤型腹泻，临床研究疗效显著
[6]，且前期实验验证具有较好生津止泻效应，对水液代谢、菌群平衡具有良好的调控效应
[7-8]。结合前期研究结论及本次研究结果拟探讨加味人参乌梅汤对气阴两伤型腹泻大鼠肠上皮黏膜屏障功能的保护作用。
1 材料
1.1 动物
本研究选用24只3～4周龄雄性SD大鼠作为实验对象，其体质量范围在60～70 g，购于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（豫）2020-0005。动物饲养过程在SPF级屏障设施内实施标准化管理，环境控制条件包括：光照周期严格维持12 h昼夜节律，温控系统保持环境温度（25±2）℃，空气流通系统确保持续有效通风。本研究方案经河南中医药大学实验动物伦理委员会审核批准（伦理批号：IACUC-202308037），所有实验操作均严格遵循国家《实验动物管理条例》及伦理规范相关要求。
1.2 药品与试剂
番泻叶300 g，生晒参、乌梅各8 g，山楂、怀山药、石榴皮、广藿香、炒茯苓、炒莲子各5 g，炮姜1 g，炙甘草3 g，购自于河南中医药大学第一附属医院。枯草杆菌二联活菌颗粒（北京韩美药品有限公司，S20020037）。
二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，CEV643Ge），D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，SEA656Ra），黏蛋白（mucoprotein，MUC）2试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，SEA705Ra），MUC4试剂盒（艾迪抗生物科技有限公司，AD32459），MUC6试剂盒（江苏酶免实业有限公司，MM-0737R2），分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，SEA546Ra），闭合蛋白（Occludin）抗体（北京博奥森生物技术有限公司，bs-10011R），紧密连接蛋白-1（Claudin-1）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，28674-1-AP），闭锁连接蛋白-1（Zonula Occludens-1，ZO-1）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，21773-1-AP），水通道蛋白（aquaporin，AQP）3抗体（博奥森生物技术有限公司，bs-1253R），AQP8抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，DF9224）。
1.3 仪器与设备
Multiskan FC多功能酶标仪（赛默飞世尔科技公司），SIM-F140AY65-PC型制冰机（日本三洋公司），NANODROP 2000型核酸定量仪（赛默飞世尔科技公司），赛洛捷克SCILOGEX CF1524R型4℃离心机，LightCycler480型qRT-PCR仪（罗氏生物科技公司）。
2 方法
2.1 药品制备
2.1.1 30%番泻叶制备
30%番泻叶标准煎液制备过程：取番泻叶300 g浸入1 000 mL纯净水中，充分搅拌后浸泡30 min，武火煮沸文火煎煮15 min，其间避免蒸发，4层200目滤筛过滤，而后充分榨出番泻叶中水分，取滤液，通过旋转蒸发仪将药液减压浓缩并溶解定容至1 000 mL，过滤除菌，标记并保存于４℃冰箱。
2.1.2 加味人参乌梅汤制备
本方由生晒参、乌梅、山楂、怀山药、石榴皮、广藿香、炒茯苓、炒莲子、炮姜、炙甘草组成，全方共50 g。第1次加10倍量纯净水500 mL，煎煮1 h后200目滤网过滤，取滤液；第2次加8倍量纯净水400 mL，煎煮1 h后200目滤网过滤，取滤液；合并滤液，滤液减压浓缩为每毫升含1.74 g生药的药液。除菌，并放入４℃冰箱保存备用。以上中药煎液均由河南中医药大学药学院中药炮制教研室提供。
2.2 分组造模及给药
24只实验大鼠适应性喂养7 d后按随机数字表随机抽取6只作为空白组，余18只随机分为模型组、中药组和阳性药组，每组6只，依据文献方法
[9-12]，采用30%番泻叶灌胃（20 mL·kg
-1），灌胃1 h后，将其置于水深40 cm，水温30℃的水中负重游泳（大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体质量5%的保险丝），以力竭为度（大鼠鼻尖没入水面5 s），后用毛巾拭去皮毛水分，饥饱失常（隔日禁食不禁水）制作腹泻模型，共造模14 d。造模结束后进行模型评估，采用大鼠体质量、毛发、精神状态等一般行为状况评定腹泻模型是否成功。
空白组、模型组予生理盐水灌胃（20 mL·kg-1·d-1），阳性药组予枯草杆菌二联活菌颗粒灌胃（0.7 g·kg-1·d-1），中药组予每毫升含1.74 g生药的加味人参乌梅汤灌胃（35 g·kg-1·d-1），持续7 d。
2.3 标本采集及处理
大鼠给药治疗1周后，禁食不禁水12 h，戊巴比妥钠（2.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血4～6 mL，取血后迅速剪取肛门上4 cm范围内长约2 cm结肠组织，颈椎脱臼法处死大鼠。
2.4 指标检测
2.4.1 一般状态和体质量观察
观察造模期间、给药前后各组的精神状态、毛发色泽、活动及排便情况等，记录每日体质量变化。
2.4.2 HE染色观察结肠黏膜炎症反应
取大鼠结肠组织，将其置于4%多聚甲醛中固定。固定后经乙醇梯度脱水、透化、石蜡浸没与包埋，用自动切片机切成4 μm的切片，将切片脱蜡后置于苏木精中染色5 min，流水冲洗后，置于伊红染色液中染色3 min，流水再次冲洗，将切片晾干后用中性树胶封固，最后用显微镜观察并进行图像采集分析。
2.4.3 ELISA法检测DAO、D-LA、MUC2、MUC4、MUC6含量
取各组血液5 mL，静置15 min，以3 000 r·min-1离心10 min，离心结束后取上清液，按照试剂盒检测步骤检测各组DAO、D-LA、MUC2、MUC4、MUC6水平。
2.4.4 qRT-PCR检测Occludin、Claudin-1、ZO-1、AQP3、AQP8 mRNA表达水平
取适量结肠组织，匀浆，加入1 mL总RNA提取试剂，振荡混匀，提取总RNA，去基因组DNA，逆转录，在95℃条件下预变性5 min，然后95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，共40循环。引物序列见
表1。
2.4.5 Western blot法检测Occludin、Claudin-1、ZO-1、AQP3、AQP8蛋白表达水平
收集大鼠结肠组织，加入裂解液及蛋白酶抑制剂，以12 000 rpm离心15 min后，并以BCA法测定蛋白浓度，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，半干法转膜、5%脱脂牛奶封闭培养2 h，加入Occludin、Claudin-1、ZO-1、AQP3、AQP8及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体，4℃过夜孵育，次日加二抗常温孵育2 h，最后滴加ECL显色剂用于定影。
2.5 统计学方法
本研究采用SPSS 24.0进行数据分析处理。连续变量资料以均数±标准差（±s）形式呈现，对于服从正态分布的组间比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计推断。方差齐性检验通过后实施最小显著差异法（LSD）进行事后多重比较；当方差不齐时，则采用Dunnett's T3法进行检验。设定检验水准α=0.05，当P值小于此阈值时视为组间差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 一般状态观察
造模2周后大鼠表现出大便稀溏、毛发枯晦、爪甲耳廓干枯、神疲倦怠、反应迟钝、喜扎堆、暴躁、体型瘦弱、肛周污秽（部分破溃）；给予相应药物干预之后，中药组和阳性药组以上证候特点及大便性状较模型组显著改善。
3.2 各组体质量变化情况
3.3 各组结肠组织形态学变化
空白组结肠黏膜组织完整，未发现显著结构破坏；模型组上皮层和固有层遭破坏，可见明显炎性细胞浸润；中药组结肠黏膜组织相对完整，未见显著炎性细胞浸润；阳性药组黏膜组织结构完整，可见少量炎性细胞浸润。见
图1。
3.4 各组DAO、D-LA、SIgA血清水平比较
3.5 各组MUC2、MUC4、MUC6血清水平比较
3.6 各组Occludin、Claudin-1、ZO-1、AQP3、AQP8 mRNA表达水平比较
3.7 各组Occludin、Claudin-1、ZO-1、AQP3、AQP8 蛋白表达水平比较
4 讨论
小儿为“稚阴稚阳”之体，脏腑柔弱，血气未充，脾常不足，脾胃的运化功能相对较差，加
之卫外机能不固，极易受到外邪的侵袭，若乳食不当、调护失宜，容易导致泄泻的发生。泄泻日久，水液耗失，阴津受劫，液亏气虚，因此，益气养阴，酸甘敛阴为小儿气阴两虚型腹泻的常用治则。在原方基础上化裁加味人参乌梅汤，即加酸味山楂、石榴皮和甘味茯苓以加强酸甘化阴作用，佐用辛温藿香、少量辛热干姜配伍方中甘味中药，以“辛甘化阳”达“阳中求阴”之意。诸药共伍充分发挥益气养阴、运脾生津、醒脾止泻之功。加味人参乌梅汤治疗气阴两伤腹泻不仅具有较好的临床疗效，同时对水液代谢具有良好的调控效应，其作用机制可能与肠黏膜屏障完整性相关。
肠黏膜屏障破坏是腹泻病发生的始动环节，肠黏膜免疫功能异常是腹泻发生发展的关键因素，肠黏膜屏障和免疫功能持续性损伤是迁延性或慢性腹泻反复不愈的重要因素，且互为因果，恶性循环，因此肠黏膜屏障是众多疾病尤其是消化道疾病研究的切入点和热点。其中机械屏障主要由肠上皮细胞及其之间的紧密连接蛋白构成，紧密连接蛋白是肠黏膜屏障的核心部分，而Occludin、Claudin-1和ZO-1均是参与上皮细胞紧密连接形成的蛋白质，其作用是共同维持上皮细胞及内皮细胞层的完整性，这些蛋白质中的任何功能异常都可能导致紧密连接完整性的破坏
[13]，而黏膜屏障障碍如紧密连接完整性受损可能会导致肠道疾病的发生。赵婵娟等
[14]研究表明，中药可通过提高脾虚泄泻大鼠结肠的3个关键作用蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的表达，从而达到修复肠黏膜屏障损伤。本研究显示复合造模条件下腹泻大鼠Occludin、Claudin-1、ZO-1基因及蛋白表达均显著下调，中药组、阳性药组均能显著上调Occludin、Claudin-1、ZO-1基因及蛋白表达水平，提示加味人参乌梅汤可通过修复肠上皮黏膜机械屏障而发挥益气生津止泻作用。D-LA、DAO是评估肠道通透性变化的经典生物标志物
[15]，DAO作为具有催化活性的胞内酶，其主要表达部位定位于肠道黏膜上皮细胞层，通过参与黏膜代谢过程对维持肠道屏障的结构完整性和屏障功能发挥核心作用。当肠道屏障完整性遭遇破坏时，受损的黏膜上皮细胞将从基底膜剥离脱落至肠腔，导致细胞内储存的DAO大量释放入血液循环系统，进而引发外周血DAO浓度的显著升高。因此，血清DAO浓度可作为评估肠黏膜屏障完整性和损伤程度的敏感生物标志物。CAI等
[16]研究显示，克罗恩病患者的D-LA和DAO水平与腹泻的严重程度呈正相关。本研究显示模型组血清D-LA、DAO水平上调，提示肠黏膜通透性升高，经药物治疗后，D-LA、DAO血清水平下调，提示加味人参乌梅汤可有效降低肠黏膜通透性而减轻腹泻症状。
免疫屏障是肠黏膜免疫系统的中心环节，也是防御致病菌在肠道黏膜上黏附和定植的第一道防线
[17]。SIgA作为肠道免疫屏障的核心组成部分，可通过阻断致病微生物定植、中和细菌外毒素及病毒颗粒发挥防御功能，同时调控黏膜免疫应答以维持局部微环境稳态，还能防止局部炎症的发生
[18]。文献研究
[19]报道，白术多糖可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，提高SIgA分泌以抵御病原的入侵，从而调节肠黏膜免疫屏障的功能，增加病原体抵抗力并促进肠道稳态恢复。本研究显示模型组血清SIgA水平显著下调，中药组、阳性药组均能显著上调血清SIgA水平，提示加味人参乌梅汤可通过修复肠黏膜免疫屏障而改善肠黏膜局部免疫功能，恢复肠道稳态，进而发挥止泻效应。
黏液层是化学屏障的重要组成部分，主要是由肠道杯状细胞分泌的MUC所组成，具有调节组织黏膜屏障、参与细胞信号传导以介导机体免疫等生物学功能，当MUC含量减少，黏液层变薄，肠通透性增加，进而发生肠道疾病
[20]。文献研究
[21-22]显示，MUC2、MUC4、MUC6是维持黏液层功能的主要蛋白，可增强黏液层完整性，其分泌减少易引起腹泻和肠道炎症发生以及病情反复难愈。本研究显示模型组血清MUC4、MUC6分泌显著减少，中药组血清MUC4、MUC6分泌水平显著上调，提示加味人参乌梅汤可提升MUC的分泌进而修复黏液层、降低肠通透性以减轻腹泻症状。
肠道微生物屏障是由定植于肠道内壁的共生菌群构成的防御体系，与其他菌群发挥相互协同作用，形成能够维持动态平衡的微生态系统。肠道微生物以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门等为主，对维持肠道生态和进化平衡具有重要意义
[23]。文献研究
[24]显示，拟杆菌门长期稳定地定植于肠道内，对维持肠道生态具有重要意义，而腹泻可导致其相对丰度下降；厚壁菌门是肠道菌群中最有优势的一种菌群，对维持肠道菌群平衡和免疫调节具有重要意义
[25-26]；乳杆菌属、双歧杆菌属为肠道益生菌，增加其肠道含量有利于提高免疫和防御能力，减轻炎症反应
[27-28]。本课题组前期研究
[29]已发现加味人参乌梅汤可调控腹泻大鼠肠道菌群中拟杆菌门、厚壁菌门、乳杆菌属、拟杆菌属的相对丰度，进而改善大鼠的腹泻症状。
AQPs是分布在肠黏膜中的跨膜蛋白，在维持肠道细胞内外环境的稳态中起着关键作用
[30]。AQPs功能受损可损害肠黏膜机械屏障，使肠黏膜通透性显著增加，导致水分吸收减少，水分在肠腔积聚，从而引发腹泻。文献
[31]报道，通过调节AQPs的表达水平，可能有助于调控肠道黏膜的渗透性，进而影响水分和溶质的吸收，其中AQP3、AQP8在肠道中起着重要的水运输和电解质平衡作用，AQP3主要存在于结肠上皮细胞，其表达下降会导致水液吸收功能障碍，造成大量水液聚集肠腔，导致粪便质地稀溏或水样便。因此，AQP3、AQP8表达水平的降低可通过影响肠道水液重吸收而加剧腹泻症状。本研究显示模型组结肠组织AQP3、AQP8蛋白及基因表达显著下调，中药组可显著上调AQP3基因及AQP3、AQP8蛋白表达水平，提示加味人参乌梅汤可通过上调AQP3、AQP8表达而调控水液代谢减轻腹泻症状。
综上所述，加味人参乌梅汤可有效减轻腹泻大鼠的临床症状，增加体质量，改善其证候特点，其效应机制与结肠上皮黏膜屏障保护机制密切相关。加味人参乌梅汤通过调控机械屏障关键紧密连接蛋白（Occludin、Claudin-1、ZO-1）、黏膜免疫SIgA、黏液层MUC表达和分泌以及肠道菌群平衡而发挥黏膜屏障保护作用，本研究结果显示，加味人参乌梅汤治疗后，DAO、D-LA分泌水平下调，水液代谢指标AQP3、AQP8表达上调，结肠黏膜组织病理形态相对完整。中医药在治疗腹泻方面表现出独特优势，加味人参乌梅汤治疗腹泻不仅具有较好的临床疗效，并且具有多靶点、多途径整体调控等优点，临床上易被患者接受。
河南省科技攻关计划项目(232102311218)
国家自然科学基金面上项目(81674026)
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