白术芍药散抗溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜损伤的作用机制研究

Study on the mechanism of Baizhu Shaoyao San on colonic mucosal injury in mice with ulcerative colitis

摘要

目的 探讨白术芍药散治疗溃疡性结肠炎结肠黏膜损伤的修复机制。 方法 60只雄性小鼠随机分为正常组、模型组、白术芍药散高、中、低剂量组、柳氮磺吡啶组。除正常组外，其余各组给予葡聚糖硫酸钠（DSS）水溶液7 d，建立溃疡性结肠炎小鼠模型。给药组分别灌胃白术芍药散水煎液5、15、45 g•kg^-1•d^-1，柳氮磺吡啶200 mg•kg^-1•d^-1，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续7 d。测量结肠长度，HE染色观察形态学变化，ELISA法检测血清白细胞介素（IL）1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量，Western blot法检测结肠组织Bcl-2、Bax、Beclin 1、LC3蛋白表达水平。 结果 模型组结肠壁增厚，炎细胞浸润深达浆膜层，隐窝完全破坏，杯状细胞消失；白术芍药散各剂量组及柳氮磺吡啶组炎症均明显减轻。与模型组比较，白术芍药散组IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD含量升高（P＜0.01），结肠组织中Bcl-2、Beclin 1、LC3表达水平蛋白升高，Bax蛋白降低（P＜0.05，P＜0.01）。 结论 白术芍药散能够减轻溃疡性结肠炎小鼠结肠组织炎症反应，修复受损黏膜，作用机制与促进结肠组织抗凋亡、激活自噬信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the repair mechanism of Baizhu Shaoyao San in treating colonic mucosal injury in ulcerative colitis (UC). Methods 60 mice were randomly divided into six groups, namely the normal group, the model group, the low-dose BZSYS group, the medium-dose BZSYS group, the high-dose BZSYS group, and the sulfasalazine group (positive control). Except for the normal group, all other groups received dextran sulfate sodium (DSS) aqueous solution for 7 days to establish an UC mouse model. The administration groups were given the decoction of BZSYS at doses of 5, 15, and 45 g·kg⁻¹·d⁻¹, and sulfasalazine at 200 mg·kg⁻¹·d⁻¹ by gavage respectively. Both the normal group and the model group received equal volumes of normal saline by daily gavage for 7 consecutive days. The length of the colon was measured and morphological changes with HE staining were observed. Serum levels of interleukin(IL)-1β, IL-6, IL-12, tumor necrosis factor-α (TNF-α), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were measured by ELISA. The expression of Bcl-2, Bax, Beclin 1, and LC3 proteins in colonic tissue was detected by Western blot using protein extracts from the colon tissue samples. Results In the model group, the colonic wall was thickened, inflammatory cell infiltration extended to the serosal layer, crypts were completely destroyed, and goblet cells disappeared. In various doses of BZSYS groups and the sulfasalazine group, inflammation was significantly reduced. Compared with the model group, the BZSYS group showed decreased levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and MDA (P<0.05, P<0.01), and increased SOD content (P<0.01). The levels of Bcl-2, Beclin 1 and LC3 proteins in colon tissues were increased, while the level of Bax protein was decreased (P<0.05, P<0.01). Conclusion BZSYS can alleviate inflammatory responses in colon tissues of mice with UC and repair damaged mucosa, and its mechanism of action is related to promoting the activation of anti-apoptotic and autophagy signaling pathways in colon tissues.

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 白术芍药散 / 凋亡 / 自噬

Key words

ulcerative colitis / Baizhu Shaoyao San / apoptosis / autophagy

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种主要累及大肠黏膜层的慢性炎症性疾病，其病程漫长，常反复发作^[1-2]。UC患者由于胃肠道黏膜组织损伤，从而导致腹痛、腹泻及便血等症状，严重影响患者的生活质量^[3-4]。UC发病机制目前尚不明确，大多认为是由饮食习惯、环境、免疫调节、肠道微生物等多种因素共同作用的结果^[5-6]。UC的治疗主要有免疫调节剂、非甾体抗炎药，如柳氮磺胺吡啶和糖皮质激素等。然而，这些药物疗效不佳，不良反应较多，如呕吐、全身性水肿和贫血等^[7-8]。因此，寻找疗效显著、毒副作用小的药物是UC防治的热点。

白术芍药散（痛泻要方）源自《丹溪心法》，由炒白术、白芍、陈皮、防风组成，功擅补脾柔肝、止痛止泻，主治肝旺脾虚所致的腹痛泄泻^[9-10]。本研究使用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）构建UC小鼠模型研究白术芍药散对小鼠结肠损伤的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性BALB/c小鼠，体质量（20±2）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001。本研究符合伦理学相关要求，经长春中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理编号：2020245）。

1.2 材料与试剂

葡聚糖硫酸钠（DSS，美国MP Biomedicals公司，216011090），白术（长春中医药大学附属医院，20250417），芍药（长春中医药大学附属医院，20250304），防风（长春中医药大学附属医院，20241205），陈皮（长春中医药大学附属医院，20240327），柳氮磺吡啶（上海福达制药有限公司，22200107），白细胞介素（interleukin，IL）-1β试剂盒（北京华英生物技术研究所，20230529），IL-6试剂盒（北京华英生物技术研究所，20230529），IL-12试剂盒（北京华英生物技术研究所，20230529），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（北京华英生物技术研究所，20230529），丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（北京华英生物技术研究所，20230526），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（北京华英生物技术研究所，20230526），兔抗LC3多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，14600-1-AP），山羊抗兔单克隆二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，SA00001-2），山羊抗鼠单克隆二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，SA00001-1），鼠抗β-actin单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，66009-1-Ig），兔抗Beclin 1多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，11306-1-AP），兔抗Bax多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，50599-2-Ig），兔抗Bcl-2多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，12789-1-AP）。

1.3 药物制备

白术芍药散的人用剂量为：白术30 g，白芍20 g，防风20 g，陈皮15 g。根据体表面积换算小鼠的用药剂量。采用常规水提法：以10倍量和8倍量水分两次煎煮（各30 min），合并滤液后浓缩，制备成1、3、9 g·mL^-1三种浓度的样品。

1.4 造模和分组给药

将60只BALB/c雄性小鼠适应性饲养1周。随机分为6组（每组10只）：正常组、模型组、白术芍药散高、中、低剂量组、柳氮磺吡啶组。除正常组自由饮水外，其余各组均给予2.5% DSS。正常组和模型组给予生理盐水20 mL·kg^-1灌胃，白术芍药散低、中、高剂量组分别给予白术芍药散水煎液5、15、45 g·kg^-1·d^-1灌胃（分别相当于人体用药量的1/3倍、1倍和3倍），柳氮磺吡啶组给予柳氮磺吡啶200 mg·kg^-1灌胃，连续给药7 d。

1.5 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分

每天定时观察小鼠日常状态并进行评分，包括大便性状、血便状态、体质量下降百分比。

1.6 组织黏膜损伤程度评分

根据组织黏膜炎症反应程度、波及范围、隐窝破损程度进行评分。

1.7 结肠炎小鼠血清和肠道组织相关指标测定

将小鼠眼球取血，静止30 min后离心提取血清用ELISA试剂盒检测血清相关指标。取小鼠结肠组织，用RIPA裂解液裂解后匀浆，提取小鼠结肠组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，在10%脱脂奶粉中室温下封闭1 h，加入TBST稀释的一抗（Bcl-2，1:1 000；Bax，1:1 500；Beclin 1，1:1 000；LC3，1:1 000；β-actin，1:5 000）4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL法发光显影，Image J软件分析结果。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.01软件进行统计分析。数据以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验（或SNK-q检验）。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白术芍药散对各组体质量变化、结肠长度及DAI评分的影响

见图1，图2，表1。

2.2 白术芍药散对各组结肠形态学的影响

模型组结肠壁明显增厚，炎症严重，病变深达浆膜层，隐窝完全破坏，杯状细胞消失；白术芍药散各剂量组以及柳氮磺吡啶组均能改善炎症引起的组织学病变。见图3。

2.3 白术芍药散对各组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12的影响

见图4。

2.4 白术芍药散对各组血清MDA、SOD的影响

见图5。

2.5 白术芍药散对各组结肠中凋亡相关蛋白的影响

见图6。

2.6 白术芍药散对各组结肠中自噬相关蛋白的影响

见图7。

3 讨论

研究报道DSS诱导的小鼠结肠炎中促炎因子IL-6和TNF-α水平都显著升高，并参与调节细胞凋亡和迁移及蛋白合成等信号通路^[11-12]。本实验中发现DSS诱导UC模型后，白术芍药散能降低UC小鼠的血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，提示白术芍药散具有调节UC小鼠体内炎症因子的生成，从而减轻炎症对结肠黏膜的病理损伤。IL-12主要由激活的单核巨噬细胞、DC和B淋巴细胞产生，是诱导Th1细胞免疫应答的主要免疫因子，能够有效促进Th1类细胞因子产生^[13-14]。同时IL-12还拮抗Th2细胞免疫反应，抑制Th2类因子的产生。有研究^[15-17]表明肠黏膜内Th1细胞及相应炎症介质水平升高是黏膜破坏的主要原因。本实验中白术芍药散治疗后，发现各干预组小鼠血清中IL-12的水平明显下降。因此，白术芍药散具有抑制IL-12产生继而下调Th1细胞应答反应，调节Th1/Th2细胞平衡改善肠道炎症的作用。

细胞凋亡受细胞内凋亡调节蛋白的调控。Bcl-2和Bax蛋白水平的高低与凋亡直接相关：Bax增高，促进细胞凋亡；Bcl-2升高，抑制细胞凋亡^[18-19]。本实验研究发现，白术芍药散能够提高UC小鼠组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低Bax蛋白的表达。自噬作用是细胞在应激或饥饿状态下，通过分解细胞质内生物大分子为恶劣条件下的存活提供能量，同时清除细胞内衰老细胞器、受损结构及蛋白质分子的过程，是细胞应对不良环境的自我保护机制。LC3和Beclin 1是常用的自噬小体标志物，检测LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转化以及Beclin1的表达，可以明确细胞内自噬水平^[20-21]。本研究发现，白术芍药散治疗后的UC小鼠结肠组织中LC3和Beclin 1蛋白表达量升高，而且其表达趋势与抗凋亡蛋白Bcl-2的表达相一致，与促凋亡蛋白Bax的趋势相反。

综上所述，白术芍药散通过调节细胞凋亡、自噬信号通路促进结肠炎小鼠肠黏膜损伤后恢复。

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基金资助

吉林省科技发展计划项目(20210401061YY)