小鼠乳腺炎的模型建立及乳痈汤改善小鼠乳腺炎的机制研究

Establishment of a mouse mastitis model and study on the mechanism of Ruyong Decoction in improving mouse mastitis

摘要

目的 研究探讨小鼠乳腺炎模型的建立方法及乳痈汤改善脂多糖（LPS）诱导的小鼠乳腺炎机制研究。 方法 通过网络药理学预测乳痈汤治疗乳腺炎的作用机制。取24只产后4 d的SPF级雌性昆明小鼠，确定LPS的最佳造模剂量和时间。根据最佳造模剂量和时间，取产后4 d的SPF级雌性昆明小鼠36只，随机分为空白对照组、模型组、地塞米松组（5 mg·kg^-1）、乳痈汤低剂量组（6 g·kg^-1）、乳痈汤中剂量组（12 g·kg^-1）、乳痈汤高剂量组（24 g·kg^-1），各6只。除空白对照组外，其余各组进行乳腺炎造模。造模结束2 h后，各组灌胃相应药物或生理盐水，连续给药7 d。取材后，苏木素-伊红（HE）染色观察乳腺组织的病理变化，酶联免疫吸附测定法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测乳腺组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平。 结果 通过HE染色确定了LPS的最佳造模剂量为10 μg，最佳造模时间为6 d；与模型组比较，乳痈汤各剂量组乳腺腺泡结构有明显改善，乳腺腺泡及腺泡间质中炎性细胞明显减少，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低，乳腺组织中Wnt3a、β-catenin表达水平均明显降低。 结论 乳痈汤可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活来改善LPS诱导的小鼠乳腺炎。

Abstract

Objective To explore the establishment method of mouse mastitis model and the mechanism of Ruyong Decoction in improving lipopolysaccharide (LPS)-induced mastitis in mice. Methods The mechanism of action of Ruyong Decoction in treating mastitis through network pharmacology was predicted. 24 SPF-grade female Kunming mice at 4 days postpartum were selected to determine the optimal modeling dose and time of LPS. According to the optimal modeling dose and time, 36 SPF-grade female Kunming mice at 4 days postpartum were selected and randomly divided into the blank control group, the model group, the dexamethasone (5 mg·kg^-1) group, the low-dose Ruyong Decoction (6 g·kg^-1) group, the medium-dose Ruyong Decoction (12 g·kg^-1) group, and high-dose Ruyong Decoction (24 g·kg^-1) group, with 6 mice in each group. Except for the blank control group, the other groups underwent mastitis modeling. Two hours after the completion of modeling, each group was administered the corresponding drug or normal saline by gavage for 7 consecutive days. After sampling, hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe pathological changes in mammary tissue; ELISA was used to detect serum levels of tumor necrosis factor (TNF-α）, interleukin (IL)-1β, and IL-6; and immunofluorescence staining and Western blotting were used to measure the protein expression levels of Wnt3a and β -catenin in mammary tissue. Results HE staining identified the optimal LPS modeling dose to be 10 μg and the optimal modeling time to be 6 days. Compared with the model group, all Ruyong Decoction groups showed significant improvement in mammary acinar structure, marked reduction of inflammatory cells in mammary acini and interacinar stroma, decreased serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6, and notably reduced expression levels of Wnt3a and β-catenin in mammary tissue. Conclusion Ruyong Decoction may ameliorate LPS-induced mastitis in mice by inhibiting the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

乳痈汤 / 乳腺炎 / 脂多糖 / wnt/β-catenin信号通路

Key words

Ruyong Decoction / mastitis / lipopolysaccharide / Wnt/β-catenin signaling pathway

乳腺炎是发生于乳房部位的急性化脓性感染^[1]，主要由细菌感染引起，作为哺乳期常见并发症，多见于哺乳期初产妇^[2]。患者初期症状包括乳房红肿、疼痛，乳房体积增大、局部变硬以及发热、头晕、乏力等全身性症状，若不及时采取有效治疗，易形成脓肿，严重影响哺乳期女性的身体健康和生活质量，甚至危及生命^[3-4]。目前西医临床上主要使用抗生素药物^[5]，但其疗效有限且易产生不良反应。因此，探索新的临床治疗方法具有重要意义。中医学将乳腺炎归于“乳痈”^[6]范畴，认为乳腺炎是由于外感毒邪、内热蕴积所致^[7]。乳痈汤由金银花、瓜蒌、连翘、知母、王不留行、路路通、乳香、没药、丹参、蒲公英10味中药组成，诸药协同，共奏清热解毒，通乳消痈之功，是临床治疗乳腺炎的经验方。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）细胞壁的特征性结构成分，可激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）等信号通路，诱导肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β等炎性细胞因子的释放^[8]，导致乳腺细胞功能受损和乳腺损伤、刺激乳腺管肿胀、乳汁淤积，最终导致乳腺炎的发生^[9]。有研究^[10]发现，Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路与多种炎症性疾病相关。因此，针对该通路进行靶向抑制可能成为乳腺炎治疗的有效策略。本研究首先筛选了LPS诱导小鼠乳腺炎的最佳剂量和时间，进一步通过乳腺组织病理学改变、炎症因子及Wnt/β-catenin信号通路相关指标的变化情况，探究乳痈汤对小鼠乳腺炎的改善作用及潜在机制，为乳腺炎的临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括IX73型研究级倒置显微镜（日本Olympus公司），Infinite 200 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司），HYQ-2121A型涡旋器（美国Crystal Instruments公司），MIKRO 220R型低温高速离心机（德国Hettich公司），Mini-PROTEAN® Tetra电泳槽（美国Bio-Rad公司）、Imager 600型凝胶成像系统（美国General Electric公司）等。

1.2 主要药品与试剂

金银花、瓜蒌、连翘、知母、王不留行、路路通、乳香、没药、丹参、蒲公英饮片均购自黑龙江中医药大学附属第一医院，经黑龙江中医药大学吴军凯副教授鉴定，均为真品。

醋酸地塞米松（dexamethasone，DEX）片（批号2308131，规格0.75 mg）购自郑州遂成药业股份有限公司；LPS（货号L2630D）购自北京博奥拓达科技有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6测试盒（批号分别为20240624、20240624、20240624）均购自南京建成生物工程研究所；苏木素伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号240004005）购自北京索莱宝科技有限公司；组织荧光自发淬灭剂、抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）（批号CR2311008、CR2407026）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、飞克特超敏ECL发光液（批号分别为MA0082-2-May-07J、MA0186-1-Jul-26J）均购自大连美仑生物有限公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）、Wnt3a、β-catenin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（批号分别为AH11286487、BC06283380、BD06041159、BA12163708）均购自北京博奥森生物技术有限公司；异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批号A0562）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 动物

本试验所用动物为哺乳期的SPF级雌性昆明小鼠，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号SCXK（辽）：2020-0001。小鼠购入后，适应性饲养1 d，自由摄食、饮水。本实验经黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会审核批准（伦理审查批号：2024042921）。

2 实验方法

2.1 乳痈汤药液的制备

取金银花9 g，瓜蒌15 g，连翘12 g，知母12 g，王不留行9 g，路路通6 g，乳香6 g，没药6 g，丹参9 g，蒲公英9 g，混匀，加10倍量水浸泡1 h，煮沸后以小火煎煮90 min，过滤，再加入10倍量水，煮沸后以小火煎煮1 h，过滤，合并滤液，浓缩制得1.2 g·mL^-1（以生药量计）的药液，于4℃下储存备用。

2.2 网络药理学

2.2.1 乳痈汤活性成分及相关靶点筛选

在中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，https://www.tcmspw.com/tcmsp.php）中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18作为标准，筛选乳痈汤各药材中的主要化学成分及其作用靶点。对于在TCMSP数据库中未能检索到的药材，通过HERB数据库（Herb.ac.cn）进行筛选。

2.2.2 乳腺炎疾病靶点筛选

在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库中，以“Mastitis”为关键词，筛选疾病相关靶点。

2.2.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

在STRING数据库中输入乳痈汤与乳腺炎疾病共同靶点绘制蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，并保存其TSV格式，将TSV格式导入Cytoscape 3.10.3软件中提取hub-target。

2.2.4 GO功能与KEGG通路富集分析

在DAVID数据库中上传乳痈汤与乳腺炎疾病共同靶点，选择物种为homo sapiens，进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，并使用Cytoscape 3.10.3软件构建“中药-成分-靶点-通路”网络。

2.3 LPS诱导小鼠乳腺炎的最佳浓度筛选

分娩后第4天，将12只哺乳期雌鼠随机分为空白对照组（3只）和模型组（9只）。造模前12 h，将仔鼠与母鼠分笼，母鼠禁食不禁水。使用3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠，固定后暴露第4对乳头，消毒后剪掉乳头尖端约1 mm以暴露乳腺导管，使用微型注射器向模型组乳腺导管中注入50 μL不同浓度的LPS生理盐水溶液，每侧总量分别为10 μg（3只）、20 μg（3只）、40 μg（3只），空白对照组注入等量生理盐水。造模后1 d观察并记录各组临床症状和乳腺组织病理学改变。

2.4 LPS诱导小鼠乳腺炎的时间筛选

分娩后第4天，将12只哺乳期雌鼠随机分为空白对照组（3只）和模型组（9只）。采用“2.3”项下的造模方法及最佳造模浓度诱导乳腺炎小鼠模型，空白对照组注入等量生理盐水。分别于造模后第1天、第3天、第6天随机选取3只模型组，观察小鼠乳腺组织病理学改变。

2.5 造模、分组及给药

分娩后第4天，将36只哺乳期雌鼠随机分为空白对照组、模型组、DEX组、乳痈汤高、中、低剂量组，各6只。采用“2.3”和“2.4”项下的造模方法及最佳造模浓度和时间诱导乳腺炎小鼠模型。乳痈汤的成人临床日用量为93 g，按照成人临床常用剂量换算得到小鼠给药剂量，乳痈汤高、中、低剂量组分别灌胃乳痈汤24 g·kg^-1、12 g·kg^-1、6 g·kg^-1（以生药量计），DEX组灌胃5 mg·kg^-1醋酸地塞米松，给药体积均为20 mL·kg^-1，空白对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水。造模结束2 h后，各组灌胃相应药物或蒸馏水，每日1次，连续7 d。

2.6 样品采集

末次给药1 h后，从小鼠两侧眼底静脉丛取血，4℃、3 000 r·min^-1 离心10 min，分离血清备用。采血后通过颈椎脱臼法处死小鼠后，取第4对乳腺组织，一部分置于4%多聚甲醛溶液液中固定，其余组织于-80℃冷冻备用。

2.7 检测方法

2.7.1 组织学观察

乳腺组织经固定后，石蜡包埋，然后切片（厚度约5 μm）。根据试剂盒说明对样品进行HE染色，采用倒置显微镜观察乳腺组织的病理变化。

2.7.2 炎症因子水平测定

使用ELISA试剂盒检测各组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.7.3 免疫荧光染色

石蜡切片经EDTA抗原修复，封闭液封闭10 min后，滴加Wnt3a、β-catenin一抗在4℃孵育过夜。用PBS洗涤载玻片3次，在室温下与FITC标记的山羊抗兔荧光二抗孵育50 min。用PBS洗涤3次，滴加自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min后，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。使用荧光倒置显微镜观察并拍照。

2.7.4 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白检测

采用Western blot法进行检测。选取各组乳腺组织样本制备组织匀浆后提取蛋白，使用BCA蛋白质检测试剂盒检测样品蛋白质的浓度。用SDS-PAGE电泳分离等量蛋白质，转移至PVDF膜，室温封闭2 h，洗去封闭液，洗膜后分别加入内参β-actin、Wnt3a、β-catenin（1:1 000）抗体，4℃孵育过夜。加二抗（1:5 000），室温孵育2 h后，使用ECL发光液在Amersham lmager 600成像仪中曝光拍照，使用Image J软件分析条带灰度值。

2.8 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。所有数据均以均值±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey's多重比较检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 网络药理学预测乳痈汤治疗乳腺炎的潜在靶点及可能机制

从相关数据库中共筛选获得了260个乳痈汤药物靶点和4 640个乳腺炎疾病靶点。合并取交集得到药物与疾病共同靶点194个；使用软件构建“乳痈汤活性成分-靶点网络图”；将共同靶点导入STRING数据库进行PPI分析，获得PPI网络；通过软件的CytoHubba插件，依据degree筛选出排名前10的靶点，以建立核心靶点的PPI网络。将共同靶点导入David数据库进行GO（见图1）和KEGG（见图2）富集分析，结果显示，生物过程主要富集于基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）、RNA聚合酶II介导的转录调控（regulation of transcription by RNA polymerase II）；细胞组成主要富集于细胞外空间（extracellular space）、含蛋白质的复合物（protein-containing complex）；分子功能主要富集于酶结合（enzyme binding）、同型蛋白结合（identical protein binding）。KEGG通路富集结果表明，这些靶点主要与膀胱癌（bladder cancer）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、多物种凋亡通路（apoptosis - multiple species）、胰腺癌（pancreatic cancer）、前列腺癌（prostate cancer）等信号通路相关。为探究乳痈汤的作用机制，选取基因富集程度最高的前20条信号通路开展研究，进一步使用软件构建“乳痈汤-乳腺炎-靶点-通路”网络（见图3）。结果显示，乳痈汤在调控前列腺癌和流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）等信号通路的同时，也影响着Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin的表达（见图4、图5）。

3.2 不同浓度LPS诱导后小鼠乳腺组织病理学改变

观察乳腺组织发现，空白对照组乳腺组织质地细腻呈淡粉色，无明显深浅差异，表面可见细小的毛细血管网，分布均匀，无异常充血或出血点。与空白对照组比较，模型组乳腺灌注10 μg LPS时，其乳腺组织色泽较暗，体积和血管数有所增加。灌注20 μg LPS时小鼠乳腺组织出现结节，色泽呈紫红，血管数明显增加。灌注40 μg LPS时小鼠乳腺组织呈黄白色，色泽不匀，血管数明显增加。进一步采用HE染色后发现，向小鼠乳腺组织中灌注10 μg、20 μg、40 μg LPS时，其乳腺组织腺泡结构均出现明显紊乱，可见大量炎性细胞浸润（见图6），最终确定LPS最佳造模剂量为10 μg。

3.3 LPS诱导后不同时间小鼠乳腺组织病理学改变

HE染色结果显示，向小鼠乳腺组织中灌注10 μg LPS后，乳腺组织中的炎症反应呈先升后降的趋势，在第3天最为严重，在第1天和第6天相近（见图7）。为更好地探究乳痈汤对乳腺炎的改善效果，使用LPS建立乳腺炎小鼠模型，并给予乳痈汤灌胃治疗，于造模后第6天取材进行后续实验。

3.4 乳痈汤对乳腺炎模型小鼠乳腺组织病理学的影响

HE染色显示，空白对照组乳腺组织乳腺形态规整，腺泡呈圆形或椭圆形，紧密分布，未见明显炎性细胞浸润。与空白对照组比较，模型组乳腺组织腺泡结构明显紊乱，腺泡间质可见大量炎性细胞浸润。给药干预后，小鼠乳腺结构有明显改善，乳腺腺泡及腺泡间质中炎性细胞明显减少（见图8）。

3.5 乳痈汤对乳腺炎模型小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

与空白对照组比较，模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）（见图9）。

3.6 乳痈汤对乳腺炎模型小鼠乳腺组织中Wnt3a、β-catenin表达水平的影响

免疫荧光结果显示，与空白对照组比较，模型组乳腺组织中Wnt3a、β-catenin表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组乳腺组织中Wnt3a、β-catenin表达水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）（见图10）。

3.7 乳痈汤对乳腺炎模型小鼠乳腺组织中Wnt/ β-catenin信号通路的影响

与空白对照组比较，模型组乳腺组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；给药干预后，各给药组乳腺组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平较模型组均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）（见图11）。

4 讨论

乳痈汤是治疗乳腺炎的经验方，立法以“清热解毒、通络散结”为核心。方中金银花、连翘、蒲公英为君，清热解毒以消痈；瓜蒌、知母为臣，前者化痰散结以通乳络，后者清泻肺胃伏火兼护阴液，共解痰热互结之滞；佐以王不留行、路路通疏利乳窍，乳香、没药活血行气止痛，丹参化瘀生新以促组织修复，诸药协同，共奏清热解毒，通乳消痈之功。研究^[10-15]发现金银花、连翘、知母、乳香、丹参、蒲公英中的有效成分均可调控wnt/β-catenin信号通路以改善疾病状态。虽然目前暂无证据表明瓜蒌、王不留行、路路通、没药可调控wnt/β-catenin信号通路，但研究发现均具有明显的抗炎活性^[16-19]。本研究通过网络药理学，对乳痈汤中的有效成分及其潜在作用靶点和通路进行了深入分析，共获得194个与乳腺炎相关的乳痈汤作用靶点，进一步通过构建PPI网路图、筛选核心靶点以及GO功能与KEGG通路富集分析推测乳痈汤可能通过抗炎，保护乳腺细胞等多种途径发挥其治疗作用。乳痈汤调控前列腺癌和流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路的同时，也影响着Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin的表达。现有结果虽未直接将药物作用与Wnt/β-catenin信号通路关联，但发现乳腺炎模型小鼠乳腺组织中Wnt/β-catenin通路关键分子（Wnt3a、β-catenin）的蛋白表达水平发生显著变化^[20-21]。这些结果提示，Wnt/β-catenin通路可能并非现有富集分析覆盖的直接效应通路，但或许是药物调控细胞增殖凋亡和炎症平衡的潜在关键枢纽。

乳腺炎致病因素复杂多样，大肠杆菌等多种革兰氏阴性菌均可诱导乳腺炎的发生^[22]。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的重要组分，是诱发乳腺炎的重要因素^[23]，在体内可通过多种信号通路促进大量炎性因子的释放，引起机体一系列的反应^[24]。本研究首先采用微量注射器向模型组小鼠乳腺导管内注入不同剂量的LPS，以探究LPS诱导小鼠乳腺炎的最佳剂量。采用HE染色后发现，向小鼠乳腺组织中灌注10 μg、20 μg、40 μg LPS后，其乳腺组织腺泡结构均出现了明显紊乱，可见大量炎性细胞浸润。最终确定LPS最佳造模剂量为10 μg，这与刘馨鸿等^[25]、仇娅琪等^[26]、刘雨然等^[27]在成功建立乳腺炎模型小鼠时使用的剂量一致。向小鼠乳腺组织中灌注10 ug LPS后，其乳腺组织中的炎症反应呈先升后降的趋势，在第3天最为严重，在第1天和第6天相近。因此，为更好地探究乳痈汤对乳腺炎的改善效果，在使用LPS建立乳腺炎小鼠模型后，给予乳痈汤灌胃治疗，于造模后第6天取材进行后续实验。

进一步研究乳痈汤对乳腺炎的改善效果，通过HE染色发现，模型组乳腺组织腺泡结构紊乱，腺泡间质可见大量炎性细胞浸润，给予乳痈汤干预后，造模小鼠乳腺腺泡结构有明显改善，乳腺腺泡及腺泡间质中炎性细胞明显减少，初步证实乳痈汤可改善LPS诱导的小鼠乳腺炎症。研究^[28-29]发现，TNF-α、IL-1β以及IL-6的大量释放会启动炎症级联反应，造成乳腺组织炎性病理损伤，还可进一步刺激乳腺管肿胀，导致乳汁淤积，加重乳腺的炎症反应。因此本实验进一步对各组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平进行检测，模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平较空白组显著升高，给予乳痈汤干预后，小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低。结果表明，乳痈汤可改善LPS诱导的小鼠乳腺炎症。

当Wnt/β-catenin通路激活时，β-catenin会在细胞质中积累并发生核转移^[30]，从而上调炎症因子的表达，加重炎症反应^[31]。因此本研究进一步采用免疫荧光和WB分析了Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平。结果表明，与空白对照组比较，模型组乳腺组织中Wnt3a、β-catenin的蛋白相对表达水平明显升高，给药干预后，乳痈汤各剂量组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达水平较模型组明显降低。提示乳痈汤可抑制LPS诱导的Wnt/β-catenin信号通路激活。

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基金资助

黑龙江省卫生健康委科研课题(20220404010995)