麻杏化瘀汤对肺炎支原体肺炎小鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的影响

Effects of Maxing Huayu Decoction on NLRP3/Caspase-1/IL-1β signaling pathway in mice with Mycoplasma pneumoniae pneumonia

摘要

目的 建立肺炎支原体肺炎（MPP）小鼠模型，探讨麻杏化瘀汤对MPP小鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）/白细胞介素1β（IL-1β）信号通路的调节作用。 方法 选取SPF级Balb/c雄性小鼠60只，4～6周龄，体质量（20±2）g，采用随机数字表法分为空白组、模型组、麻杏化瘀汤低、中、高剂量组、小儿肺热咳喘口服液组（阳性组），各10只。对除空白组外的其他5组采用滴鼻法对实验Balb/c小鼠进行MP感染。造模成功后，空白组和模型组予灌胃等量0.9%氯化钠溶液，其余4组分别给予麻杏化瘀汤低（7.625 g·kg^-1）、中（15.25 g·kg^-1）、高（30.5 g·kg^-1）剂量、小儿肺热咳喘口服液（0.018 mL·g^-1），连续给药10 d。末次给药后，采集标本，ELISA法检测各组血清中IL-1β水平，Western Blot法检测各组肺组织中NLRP3炎症小体蛋白表达含量，RT-qPCR法检测各组肺组织中NLRP3、Caspase-1的mRNA转录水平。 结果 与正常组相比，模型组血清中IL-1β含量显著升高（P＜0.01），肺组织中NLRP3炎症小体蛋白表达及NLRP3、Caspase-1 mRNA转录水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性组和麻杏化瘀汤高、中剂量组血清中IL-1β含量显著降低（P＜0.01），肺组织中NLRP3炎症小体蛋白表达及NLRP3、Caspase-1 mRNA转录水平均显著降低（P＜0.01）。 结论 麻杏化瘀汤可对NLRP3炎症小体所介导的NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路具有显著的抑制作用，有效控制炎症反应，这可能是麻杏化瘀汤防治MPP的重要机制之一。

Abstract

Objective To establish a mouse model of Mycoplasma pneumoniae pneucmonia(MPP), and to investigate the regulatory effect of Maxing Huayu Decoction on NOD-like receptor thermal protein domain-associated protein 3 (NLRP3)/ cysteinyl aspartate specific proteinase 1 (Caspase-1） / interleukin-1β (IL-1β) signaling pathway in MPP mice. Methods 60 SPF male Balb/c mice aged 4~6 weeks with body weight (20±2)g were randomly divided into the blank group, the model group, the low -dose Maxing Huayu Decoction group, the medium -dose Maxing Huayu Decoction group and the high-dose Maxing Huayu Decoction group, and Infantile Feire Kechuan Oral Liquid group (positive group) according to random number table method, with 10 mice in each group. In addition to the blank group, the other five groups of Balb/c mice were infected with MP by nasal drops. After the model was successfully established, the blank group and the model group were given the equal volume of 0.9% sodium chloride solution by gavage, and the other four groups were given low (7.625 g·kg^-1), medium (15.25 g·kg^-1) and high (30.5 g·kg^-1) doses of Maxing Huayu Decoction and Infantile Feire Kechuan Oral Liquid(0.018 mL·g^-1）, respectively, for 10 consecutive days. After the last administration, samples were collected. The serum IL-1β level in each group was detected by ELISA. Western blot was used to detect the protein expression of NLRP3 inflammasome in lung tissues in each group. RTqPCR was used to detect the mRNA transcription levels of NLRP3 and Caspase-1 in lung tissues in each group. Results Compared with the normal group, the model group had a significant increase in the serum content of IL-1β (P<0.01) and significant increases in the protein expression of NLRP3 and mRNA transcription level of Caspase-1 in lung tissues (P<0.01). Compared with the model group, the levels of IL-1β in the serum of the positive group and the high-dose Maxing Huayu Decoction group and the medium -dose Maxing Huayu Decoction group were significantly decreased (P<0.01), while the protein expression of NLRP3 inflammasome in lung tissue and mRNA transcription levels of NLRP3 and Caspase-1 in lung tissue were significantly decreased (P<0.01). Conclusion Maxing Huayu Decoction can significantly inhibit NLRP3/Caspase-1/IL-1β signaling pathway mediated by NLRP3 inflammasome, which effectively controls inflammatory response. This may be one of the important mechanisms by which Maxing Huayu Decoction prevents and treats MPP.

Graphical abstract

关键词

麻杏化瘀汤 / 肺炎支原体肺炎 / NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 / 半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1 / 白细胞介素-1β / NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体

Key words

Maxing Huayu Decoction / Mycoplasma pneumoniae pneumonia / NOD-like receptor thermal protein domain-associated protein 3 / cysteinyl aspartate specific proteinase 1 / interleukin-1β / NOD-like receptor thermal protein domain-associated protein 3 inflammasome

肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是由感染肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的肺部感染性病变，近年来，本病的发病率逐渐升高，爆发流行年可达40%以上^[1]。MP是一种广泛分布于自然界中，介于细菌和病毒之间的微生物，主要经呼吸道飞沫传播^[2-3]，可激活机体免疫系统并诱导多种细胞因子的释放，抵抗病原体侵袭，过量产生却可能对机体造成损害，甚至引发过度炎症反应^[4]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain-associated protein 3，NLRP3）炎症小体属于NLRs家族，为一种多聚蛋白复合物，是调控炎症产生的关键因子，由NLRP3受体、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和Caspase-1前体（pro-caspase-1）三部分组成^[5]。研究^[6]发现，NLRP3炎症小体能促进MP感染后的炎症反应，且与病情严重程度和病程发展密切相关。MP感染宿主细胞，激活NLRP3后，接头蛋白ASC结合，形成NLRP3-ASC复合物，进一步募集pro-caspase-1，形成NLRP3炎症小体，最终活化半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1（cysteine-aspartic acid protease 1，Caspase-1），促进白细胞介素（interleukin，IL）-1β等炎症因子成熟、释放，发挥促炎作用。具有活性的Caspase-1亦可通过切割gasdermin D（GSDMD），引发细胞焦亡，导致细胞死亡并释放更多炎症介质，进一步加剧炎症反应^[7]。麻杏化瘀汤为甘肃省中医院治疗小儿MPP的经验方，在本课题组前期研究中，已经证实麻杏化瘀汤对小儿肺炎有确切临床疗效，可改善患儿临床症状，降低炎症反应，缩短病程，促进康复^[8-10]，但其作用机制尚不清晰。基于此，本课题拟建立MPP小鼠模型，观察麻杏化瘀汤对MP感染后小鼠NLRP3炎症小体相关因子表达的影响，探讨其在治疗小儿MPP过程中可能的作用机制，以期为本方的临床应用提供基础研究依据。

1 材料

1.1 菌株

MP国际标准株（FH）由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。将冻存的MP菌株接种至液体培养基中，并置于37℃，含5%二氧化碳（carbon dioxide，CO₂）的温箱中培养，培养液颜色由红变黄时进行连续传代，取第3代。以培养基由红色变为黄色时的最高稀释度作为颜色改变单位（colour change unite，CCU），采用CCU·mL^-1方法测定MP浓度，取菌液浓度1×10⁷CCU·mL^-1备用。

1.2 动物

选取4～6周龄的SPF级Balb/c雄性小鼠60只，体质量（20±2）g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，生产合格证号：SYXK（甘）2020-0010，使用合格证号：SCXK（甘）2020-0002。本次研究中饲养及处理方法均遵守动物伦理原则，已通过中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物伦理委员会审查和批准（编号：LVRIAEC-2024-058）。

1.3 药物与主要试剂

麻杏化瘀汤（处方组成：蜜麻黄5 g，炒苦杏仁6 g，水蛭3 g，鱼腥草10 g，败酱草10 g，甘草3 g），由甘肃省中医院颗粒剂药房提供；小儿肺热咳喘口服液（国药准字Z10950080）购自黑龙江葵花药业股份有限公司。IL-1β ELISA试剂盒（货号：MM-0176M1，江苏酶免）；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA 蛋白裂解液（货号：PC0040、R0020，北京索莱宝）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、ECL发光液、蛋白电泳Marker（货号：11141ES60、11202ES08、36208-A/B、26616，上海翊圣）；Trizol Reagent（货号：15596026，美国ambion）；ASC抗体（货号：bs-6741R，北京博奥森）；NLRP3抗体、Caspase-1抗体、GAPDH抗体（货号：YT5382、YT5743、YM3215，北京天瑞德）。

1.4 主要仪器

酶标仪（型号：HBS-1096A，南京德铁）；摇床（型号：SK-O180-E，美国）；全自动化学发光成像系统（型号：WD-9423C，北京六一）；电泳转印系统（Bio-Rad公司）；高速冷冻离心机（型号：TGL-1850，四川蜀科）；超低温冰箱（型号：DW-86L419，海尔集团）；全自动样品研磨仪（型号：JXFSTPRP-24L，上海净信）；微量核酸测定仪（型号：K5800，北京凯奥）；PCR扩增仪（型号：A300，杭州朗基）；荧光定量PCR仪（型号：201901003，ROCGENE公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模及给药

60只SPF级雄性小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组、模型组、麻杏化瘀汤低、中、高剂量组、小儿肺热咳喘口服液组（阳性组），各10只。对除空白组外的其他5组滴鼻造模，第0天接种含1×10⁷CCU·mL^-1的MP液各50 μL；第5天、第8天、第9天接种含1×10⁷CCU·mL^-1的MP液各100 μL。空白对照组用等量不含MP的培养液滴鼻。接种后观察记录各组体质量、呼吸、精神状态、活动量、饮食量等情况的变化。造模后，各组给药剂量按照《药理实验方法学》^[11]人和动物间体表面积折算的等效剂量比值进行换算。麻杏化瘀汤高、中、低剂量组分别予10.8、5.4、2.7 g·kg^-1[9]，阳性组予小儿肺热咳喘口服液0.018 mL·g^-1，模型组及空白组予生理盐水0.01 mL·g^-1，每日1次，连续10 d。

2.2 一般情况观察

造模及给药过程中，每天对小鼠的一般状况进行观察与记录，包括小鼠精神状态、被毛亮泽度、呼吸频率、咳嗽情况、摄食饮水量、大便情况、对外界刺激反应程度等。

2.3 样本采集

末次给药24 h后，拔眼采血，迅速吸取45 μL全血，收集于EP管中，室温放置2 h后，4℃、3 000 r·min^-1离心20 min，经离心后取上层血清储存于EP管中，放入-20℃冰箱中冷藏以备进行ELISA检测。将小鼠进行颈椎脱臼处死，置于无菌操作台上进行小鼠仰卧位固定，用酒精将其颈部和胸腹部进行消毒，用无菌手术器械进行操作，无菌开胸，取出完整肺脏，放于-80℃冰箱保存，以备WB、qPCR检测使用。

2.4 指标检测

2.4.1 血清中IL-1β含量

采用ELISA法检测血清中IL-1β含量，经离心后取小鼠上层血清，按ELISA试剂盒说明书操作。按照试剂盒说明书进行稀释，再将样品加于酶标板孔底部，逐步加药反应，最后置于酶标仪中测定光密度值（optical density，OD），绘制回归曲线，计算出样品浓度。

2.4.2 肺组织中NLRP3炎性小体蛋白表达

取出肺组织研磨后加入蛋白裂解液，低温匀浆仪中充分匀浆，高速离心取上清液，使用BAC试剂盒进行蛋白定量，-80℃低温冰箱保存。使用10%凝胶上分离蛋白质，电泳后，将分离的蛋白质转移到PVDF膜转移，转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h。加入GSDMD抗体、NLRP3抗体、Caspase-1抗体、ASC抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜6 min×5次，加入二抗室温孵育1 h后，TBST洗膜6 min×5次，置于化学发光仪中显色，曝光。以GAPDH为内参，采用Image J对条带进行定量分析，计算蛋白条带与GAPDH条带的灰度比值，作为目的蛋白相对表达水平。

2.4.3 肺组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达

取约100 mg小鼠肺组织样本，按试剂盒说明书操作步骤，用Trizol方法提取RNA。再将提取的RNA转录为cDNA，逆转录程序设置为25℃ 5 min，45℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min。加入引物后，混匀、离心，于PCR扩增仪进行扩增，采用两步法标准程序。PCR引物序列见表1，由西安擎科生物科技公司合成。最后，采用2^-ΔΔCt方法分析NLRP3、Caspase-1相对于GAPDH基因的mRNA表达量。

2.5 统计学方法

采用统计软件SPSS Statistics 27进行统计分析。各组间指标进行正态性检验，均符合正态分布，计量资料采用均数±标准差（\overline{x}±s）表示；多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验分析，方差不齐时用Dunnett's方法分析。采用GraphPad prism 9.0绘图软件进行绘图。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况观察

实验前各组均精神饱满、被毛光亮、呼吸均匀、摄食饮水及排便正常、对外界刺激反应灵敏。用MP菌液滴鼻造模，造模第6天，可见部分小鼠精神烦躁、抓挠头面部，活动量下降、体态蜷缩，呼吸略有急促，食欲减退，体质量减轻，大便质稀；造模第8天，可见大部分小鼠易激惹，出现寒战竖毛，呼吸急促，伴有轻咳，口鼻周围出现分泌物，被毛暗淡，摄食饮水明显减少，小便颜色较深，不同程度的大便黏滞，气味较臭，体质量减轻；造模第10天，可见小鼠精神萎靡，上述症状逐渐加重，皮毛逐渐枯槁无泽。

经不同药物干预后，空白组一般情况好，食欲良好，体质量增长正常；模型组饮食较之前增加，但其他症状无明显改善；麻杏化瘀汤低剂量组精神一般，呼吸略促，大便质尚可、量较少；麻杏化瘀汤中剂量组整体状态好转，活动量较前明显增大，无明显口鼻分泌物，摄食量增加；麻杏化瘀汤高剂量组及阳性组精神恢复正常，呼吸顺畅，毛色转光泽，摄食量明显增加，体质量逐渐增长趋势恢复，一般体征基本恢复。

3.2 各组血清中IL-1β含量比较

见表2。

3.3 各组肺组织NLRP3炎症小体蛋白表达比较

见表3、图1。

3.4 各组肺组织NLRP3、Caspase-1 mRNA表达比较

见表4、图2。

4 讨论

大环内酯类药物是治疗MPP的一线药物，然而，随着大环内酯类抗生素耐药性的持续上升，尤其是在新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情暴发后^[12]，难治性MPP和重症MPP的病例报道逐渐增多，其发病率呈现上升趋势^[4]。这不仅严重影响了患儿的临床预后和生活质量，也给儿科医师的诊疗工作带来了巨大挑战。因此，探索新的治疗策略以应对耐药性问题已成为当前儿科领域面临的新挑战。

MP入侵机体，黏附在宿主呼吸道上皮细胞上，释放社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（community-acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等物质，诱导分泌促炎因子，产生炎症反应^[13]。CARDS TX是由MP产生的一种独特的外毒素，具有细胞毒性作用，可使气道周围炎性细胞浸润，导致气道功能障碍，产生过敏性炎症和哮喘样改变^[14]。CARDS TX可活化adp-核糖基转移酶（ADP-ribosyl transferase，ART），进而激活NLRP3，使得NLRP3炎症小体的组装、Caspase-1的活化，促进IL-1β成熟并分泌到细胞外。另一方面，MP衍生的脂质可与Toll样受体（Toll-like receptor 4，TLR-4）相互作用，使细胞内ROS水平的上调，进而活化NLRP3炎症小体，产生IL-1β等促炎因子。IL-1β可诱导大量细胞炎性因子的释放，出现炎症反应，引发组织损伤，改变宿主免疫应答^[15]。细胞焦亡是一种细胞程序性、炎性坏死，也是机体重要的天然免疫反应，LIU等^[16]发现，MP是通过激活NLRP3炎症小体途径诱导细胞焦亡。细胞焦亡在抗击感染中发挥重要作用，辅助清除体内受损或死亡的炎性细胞；然而细胞焦亡后使细胞内大量炎症因子的释放，又进一步引发炎症级联反应^[17]。

这一系列炎症反应导致炎症细胞浸润，导致平滑肌痉挛和血管通透性增加，引起管壁水肿，黏膜水肿和黏液分泌增多；又作用于血管内皮细胞，加剧损伤，加速凝血^[18-19]；炎症介质促进血小板活化，聚集释放促凝物质，亦可促进血栓形成^[20-21]。炎症和凝血系统的相互作用形成恶性循环，加重炎症反应、组织损伤。由此可见，NLRP3炎症小体作为先天免疫的关键枢纽，其过度激活可以是连接“炎症反应”与“高凝状态”的核心桥梁，进一步驱动“痰浊”与“瘀血”生成并相互胶结，形成“痰瘀互结”病理状态，并与中医理论相符。该机制与中医对MPP病机的认识高度吻合。

中医药治疗MPP有着多靶点、多效应的特点，研究^[22]表明，中医药在本病早期干预、急性期治疗及后期康复方面具有独特的优势。麻杏化瘀汤是甘肃省中医院著名儿科专家韩芳林教授基于“痰瘀同治”理论治疗MPP的经验方，清热化痰，活血通络之效，药物组成：蜜麻黄、杏仁、水蛭、败酱草、鱼腥草、甘草等。蜜麻黄，有宣肺平喘、解表散邪之功，杏仁，肃降肺气，为止咳平喘之专药，与蜜麻黄相配，一辛一苦，一开一降，一散一收，宣降相因，二者共为君；水蛭，善行走窜，具有活血化瘀，逐瘀通络的功效，为臣药；败酱草、鱼腥草，增强清热解毒祛瘀之功，为佐药；甘草味甘，性平，为使药调和诸药。研究^[23-24]表明，麻黄可松弛组织胺所致的气管平滑肌痉挛，起到平喘作用；作用于交感神经，具有发汗作用；其提取液在一定浓度下，具有抗病毒的作用。苦杏仁可抑制肺组织炎症反应，减少黏蛋白分泌及肺间质内炎症细胞浸^[25]；其主要活性成分苦杏仁苷可分解成能抑制呼吸中枢的氢氧酸，起到宣肺平喘作用^[26]。蜜麻黄与苦杏仁二者相配伍，既能增强药理作用，又能降低对身体的不良反应^[27]。水蛭的蛋白多肽类成分为主要活性成分，能延长凝血酶、凝血酶原时间，抑制凝血因子活性，发挥抗血栓、抗凝血和抑制血小板聚集的作用；其提取物组胺样物质具有抗炎作用，可抑制炎症因子的表达及阻断炎症相关信号通路^[28-29]。张士卿教授在治疗小儿肺炎时常选用水蛭促进肺部啰音吸收，改善肺部微循环，以缩短病程，提高疗效^[30]。败酱草、鱼腥草及甘草均有抗菌、抑制炎症因子的过度释放的作用^[31-33]。由此可见，本方化痰祛瘀以清除病理产物，抗炎通络以改善微循环，体现了中医理论与西医理论相结合的特点，具有明确的科学依据。

本实验结果显示，与空白相比，MPP模型组肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白及mRNA表达明显增高，说明在MP感染过程中，其致病因子可激活模式识别受体，触发NLRP3炎症小体复合物的组装，募集接头蛋白ASC，与NLRP3受体蛋白N端相互作用，招募并活化Caspase-1前体，激活NLRP3炎症小体^[34]。模型组血清中IL-1β含量明显高于空白组，表明MP感染激活NLRP3炎性小体后，进一步激活下游的炎性细胞因子IL-1β。IL-1β是IL-1细胞因子家族中研究最广泛的细胞因子，作为一种关键的先天细胞因子，IL-1β对于免疫激活和促进炎症过程至关重要^[35]。麻杏化瘀汤和小儿肺热咳喘口服液干预后，麻杏化瘀汤高剂量组及阳性组能显著下调Caspase-1、NLRP3及IL-1β的表达，提示麻杏化瘀汤能够抑制肺组织中NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表达，减少NLRP3炎性小体的合成，抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路，进而减少IL-1β的释放，抑制MP侵袭诱导的炎症反应。

本实验研究初步证实了MP感染诱导NLRP3炎症小体活化，进而释放IL-1β，引发炎症级联反应。麻杏化瘀汤可对NLRP3炎症小体所介导的NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路具有显著的抑制作用，以减少炎症因子的释放，降低机体炎症反应，改善微循环障碍，可能是麻杏化瘀汤防治MPP机制之一。本实验为麻杏化瘀汤治疗MPP提供了新的实验依据，同时也为中药复方治疗MPP提供了新的靶点和思路，但其如何激活NLRP3炎症小体尚未可知，还有待进一步深入研究作用。

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基金资助

甘肃省中医药科研课题(GZKP-2023-12)

甘肃省自然科学基金项目(25JRRA776)