金钱白花蛇蛇油优选炼制工艺及对浅二度烫伤的促愈合效果研究

Study on optimal refining process of Bungarus parvus snake oil and its promoting wound healing efficacy of superficial second-degree scald

摘要

目的 优选金钱白花蛇蛇油的最佳炼制工艺并研究其对浅二度烫伤的促愈合药效。 方法 采用正交试验（提取时间、提取功率、提取次数）优选金钱白花蛇蛇油的炼制工艺，并进一步优选抗氧化剂（种类、用量）以提高稳定性和出油率。建立小鼠浅二度烫伤模型，分组给药，持续15 d。每天记录小鼠创面愈合情况，计算创面愈合率并做皮肤病理学观察；测定转化生长因子TGF-β₁/Smad3蛋白及mRNA的表达。 结果 正交试验优选炼制工艺为200 W功率，提取1次，提取时间20 min；提取时间延长至40 min，添加0.5%茶多酚和0.05%维生素E复配抗氧化剂，可实现蛇油出油率＞40%，过氧化值＜5 mmol·kg^-1；在小鼠浅二度烫伤模型实验中，精制金钱白花蛇蛇油干预后，与麻油组及模型组相比，创面愈合率显著升高（P＜0.001），皮肤恢复状态更好，与京万红软膏组相接近，烫伤区域皮肤的转化生长因子β₁（TGF-β₁）、Smad家族成员3（Smad3）蛋白及mRNA表达量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。 结论 本研究通过优选炼制工艺，添加复配抗氧化剂，实现了高效稳定的蛇油炼制，且获得的精制蛇油对小鼠的浅二度烫伤模型具有良好促愈合效果，其作用机制可能与抑制TGF-β₁/Smad3信号通路有关。

Abstract

Objective To optimize the refining process of Bungarus parvus snake oil and study its promoting wound healing efficacy of superficial second-degree scalds. Methods Orthogonal experimental design (extraction time, extraction power, and extraction frequency) was used to optimize the refining process of Bungarus parvus snake oil, and further optimize the antioxidants (types and concentrations) to enhance oxidative stability and oil yield. A murine superficial second-degree scald model was established, with drugs administered in groups for 15 consecutive days. The wound healing status of mice was recorded every day, wound closure rate was calculated daily, and dermatopathology was observed. Protein and mRNA expression levels of transforming growth factor beta1 (TGF-β）/mothers against decapentaplegic homolog 3 (Smad3） were measured. Results The optimized protocol involved single-cycle extraction at 200 W for 20 minutes. Extension to 40 minutes extraction with 0.5% tea polyphenols and 0.05% vitamin E co-antioxidants achieved the snake oil yield of > 40% with the peroxide value not exceeding 5 mmol·kg^-1. In the mouse model of superficial second-degree scald experiment, intervention with refined Bungarus parvus snake oil significantly increased the wound healing rate compared to the sesame oil group and the model group (P<0.001), with better skin recovery status, exhibiting comparable efficacy to Jing Wan Hong ointment group, and TGF-β₁/Smad3 protein and mRNA expression levels in the scalded skin area were markedly reduced (P<0.05 or P<0.01). Conclusion This study achieves efficient production of stable Bungarus multicinctus oil by optimizing refining process with dual antioxidants. The refined snake oil obtained demonstrates significant wound-healing effects on the mouse model of superficial second-degree scald, with its mechanism potentially related to the inhibition of the TGF-β₁/Smad3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

金钱白花蛇 / 蛇油 / 抗氧化 / 转化生长因子 / 浅二度烫伤

Key words

Bungarus parvus / snake oil / antioxidant / transforming growth factor / superficial second-degree scald

烧烫伤是一种常见的创伤，由热力、化学物质、电流或放射线等因素引起，可导致皮肤甚至深层组织的损伤。烫伤不仅给患者带来身体上的痛苦，还可能造成心理上的创伤和生活上的不便。因此，深入研究烫伤的治疗方法和药物，对于减轻患者痛苦、促进创面愈合具有重要意义^[1-2]。

金钱白花蛇，为眼镜蛇科动物银环蛇的幼蛇干燥体^[3]。金钱白花蛇被取完蛇毒蛇胆后，其脂肪组织还可进一步加工炼制成蛇油。现代药理研究^[4-5]表明，蛇油具有抗炎、抗过敏等作用。金钱白花蛇作为我国珍稀药用动物资源，具有较大的药用价值。目前，蛇油工业提取侧重使用正己烷等有机溶剂提取，生产过程污染大，且易存在有机溶剂残留等问题，传统高温炼制法具备低成本，无污染等优势，但通常所炼蛇油氧化程度高、腥味重。

本研究衔接古代传统炼制工艺，通过优化传统蛇油炼制工艺，并优选天然抗氧化剂配方，得到的粗油再进行精制脱酸脱腥工艺优化，制备得低过氧化值、低酸值、低腥味的蛇油；以小鼠浅二度烫伤模型研究精制金钱白花蛇蛇油促愈合的药效，进一步探讨金钱白花蛇蛇油的实际应用价值，为其相关制剂产品的开发提供基础。

1 材料

1.1 仪器

赛多利斯BSA 223S电子分析天平、MC京制0000026号电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；10 g标准砝码（底部圆形，直径0.9 cm）；HT165R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机、JB-L5冻台、KD-P组织摊片机（武汉俊杰电子有限公司）；、RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；GFL-230烤箱（天津市莱玻瑞仪器设备有限公司）；Nikon Eclipse ci正置光学显微镜（日本尼康）；NIKON DS-U3成像系统（日本尼康）；Quantagene q900荧光定量PCR检测系统（酷搏科技）。

1.2 试药

新鲜金钱白花蛇蛇脂肉（北京建生药业有限公司）；硫代硫酸钠滴定液（c = 0.009 9 mol·L^-1，上海源叶生物科技有限公司）；茶多酚（北京迈瑞达科技有限公司，货号M049039）；维生素E（上海吉至生化科技有限公司，货号D95610）；鼠尾草酸（上海新铂化学技术有限公司，货号LB839635）；可溶性淀粉（上海源叶生物科技有限公司）；麻油（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号C16040386）；京万红软膏（天津达仁堂京万红药业有限公司，批号270183）；苏木素-伊红染液（武汉百仟度生物科技有限公司，货号B1001）；BSA牛血清白蛋白（DAKO；货号BIOFROXX）；DAB显色试剂盒（江苏世泰实验器材有限公司，货号2005289）；柠檬酸（武汉百仟度生物科技有限公司，货号B2010，pH=6.0）；PBS缓冲液（武汉百仟度生物科技有限公司，货号B0002）；一抗转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）（seivicebio公司，货号GB11179，稀释比1:200）；一抗Smad家族成员3（mothers against decapentaplegic homolog 3，Smad3）（seivicebio公司，货号GB111844，稀释比1:200）；二抗HRP标记山羊抗兔（SeraCare公司，货号5220-0336，稀释比1:500；TRIZOL（Servicebio公司，货号G3013）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 动物

40只SPF级Balb/c健康雄性小鼠，6～8周龄，体质量19～21 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。本实验经北京中医药大学动物实验伦理委员会批准（伦理编号：BUCM-2024070306-3016）。

2 实验方法

2.1 蛇油炼制工艺参数正交试验研究

2.1.1 正交试验设计

设计三因素三水平L₉（3⁴）正交试验，考察提取时间、提取功率、提取次数对得到粗油过氧化值的影响，其中一因素为空白列保证自由度＞0，以便进行方差分析。根据前期预实验经验，设计正交因素水平表见表1。

2.1.2 蛇油炼制

每组取蛇脂肉100 g，放入不锈钢锅中采用电陶炉炼制，经300目尼龙布过滤，即得粗油，测定粗油过氧化值及出油率。其中过氧化值测定依照中华人民共和国药典（2020版）油脂过氧化值测定法，出油率测定按下式计算，其中V为蛇油体积，M为蛇脂肉质量，Y为出油率。Y=V/M×100%。

2.2 单因素实验研究茶多酚及维生素E不同添加量及复配效果

2.2.1 抗氧化剂抗氧化效果单因素试验

以过氧化值及出油率为指标，考察添加不同种类抗氧化剂茶多酚、维生素E的抗氧化效果及对出油率的影响，每种抗氧化剂依据预实验结果选择3个剂量水平考察（茶多酚选择重量分数0.1%、0.3%、0.5%，维生素E选择重量分数0.05%、0.1%、0.15%），采用2.1正交试验的优选工艺，实验组加入抗氧化剂混合均匀，空白对照组不加抗氧化剂，每组平行做3份。

2.2.2 联合抗氧化剂抗氧化效果考察

选择茶多酚及维生素E的最优用量进行复配，测定粗油的过氧化值和出油率，平行重复3次。

2.3 联合抗氧化剂条件下最佳炼制时间考察

炼制不同时间对出油率影响较大，在联合抗氧剂条件下，对炼制时间进行考察，测定炼制过程中不同时间（20、30、40、50、60 min）的出油率及过氧化值，平行重复5次。

2.4 精制蛇油的制备

按上述优选出的方法炼制蛇油，再进一步加碱脱酸，水蒸气蒸馏法脱腥^[6]，制备得到低过氧化值、低酸值、低腥味的精制蛇油。

2.5 精制蛇油对浅二度烫伤的促愈合效果

2.5.1 分组

Balb/c健康雄性小鼠40只，随机分为5组，其中空白组4只，模型组、京万红组（阳性药组）、麻油组（阳性油组）及精制蛇油组（实验组）均为9只。

2.5.2 造模与给药

参考文献[7-9]方法造模：实验前24 h，采用脱毛膏对小鼠背部的皮肤进行脱毛，脱毛面积均为3 cm×3 cm；脱毛后，采用水合氯醛对小鼠进行麻醉，将直径为0.9 cm的砝码置于100℃的恒温热水中加热10 min后取出，迅速擦干砝码上的水分，然后紧贴小鼠右侧脱毛部位皮肤5 s（经前期预实验发现，烧烫的砝码紧贴小鼠背部皮肤5 s即可达到造模效果）。当小鼠右侧脱毛部位皮肤发白，且次日可见烫伤区域皮肤硬化、结痂，则表明浅Ⅱ度烫伤模型复制成功。造模后在各组创面上使用无菌棉棒连续涂抹对应药物，早晚各1次，每次给药0.2 g（剂量根据预实验结果设置），持续15 d，空白组及模型组不给药。

2.5.3 小鼠皮肤创面愈合率统计

采用描记法，于给药第3天、第6天、第9天、第12天、第15天用半透明硫酸纸紧贴小鼠皮肤画下每只小鼠的烫伤创面轮廓，用图像处理软件ImageJ统计分析描记面积。为记录各组皮肤创面的外观特征，同时在与烧伤创面成直角等距离处拍摄光学照片。创面愈合率=（初始烫伤面积-未愈合创面面积）/初始烫伤面积×100%。

2.5.4 小鼠皮肤组织病理学分析

实验结束后处死动物，切取每组第3天、第9天、第15天时创面皮肤组织的创面核心处进行HE染色（苏木素染细胞核，伊红染细胞质），在显微镜下观察组织病理变化。

2.6 愈合末期各组皮肤纤维化相关蛋白及mRNA表达分析

2.6.1 小鼠皮肤纤维化相关蛋白免疫组织化学分析

末次给药后第2天处死小鼠取创面皮肤组织，均分2份冻存。取1份石蜡包埋切片，脱蜡至水后，用EDTA抗原修复缓冲液微波修复抗原。再经3%双氧水阻断，封闭内源性过氧化物酶。随后使用免疫组化笔沿组织外围构建疏水屏障，滴加3%BSA孵育30 min。滴加一抗4℃孵育过夜，复温后加二抗避光孵育50 min。采用DAB显色统进行可视化反应，梯度乙醇脱水处理，中性树脂进行封片，最后进行显微图像采集。

2.6.2 小鼠皮肤相关蛋白mRNA的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析

取上述2.6.1中剩下的另1份冻存皮肤组织，采用Trizol法提取总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度。将总RNA反转录为cDNA，反转录体系：5×Reaction Buffer 4 μL，Oligo（dT）18 Primer（50 μm）1 μL，ServicebioRT^®Enzyme Mix 1 μL，mRNA 2 μL，RNase free water补足体系至20 μL；反应条件：25 ℃反应5 min，42 ℃反应30 min，最后85 ℃加热5 s终止反应。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物5’-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3’，反向引物5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3’；TGF-β₁正向引物5’-ACGTGGAAATCAACGGGATCA-3’，反向引物5’-GTTGGTATCCAGGGCTCTCC-3’；Smad3正向引物5’-CTTCACCCTGGGATGTAGGA-3’，反向引物5’-GCGATCCTGTGTACCCTGTT-3’。引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，反应体系：2×SYBR Gree qPCR Master Mix 5 μL，正反向引物各0.2 μL，cDNA 2 μL，Nuclease-Free Water补足体系至10 μL；反应条件：95℃预变性30 s，然后进行95℃变性15 s，60℃退火/延伸30 s，循环40次。TGF-β₁、Smad3以GAPDH为内参，采用ΔΔCt法计算TGF-β₁、Smad3 mRNA的表达量。

2.7 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 20统计软件进行数据的统计分析。所得数据用均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），当总体方差齐时选择LSD法分析，当方差不齐时选择Dunnet C法分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 正交试验结果分析

对过氧化值结果进行极差分析，各因素重要程度提取次数＞提取功率＞提取时间，最优实验为A2B2C1，即提取20 min，提取功率200 W，提取次数1次。见表2。

根据正交试验法优选出的最佳工艺条件进行验证试验，平行操作2份，测定粗油过氧化值。结果分别为6.67 mmol·kg^-1和6.82 mmol·kg^-1，验证实验结果表明优选最佳工艺可靠。

3.2 单因素实验研究茶多酚及维生素E不同添加量的抗氧化效果

测定结果显示，茶多酚最优用量为0.5%，维生素E最优用量为0.05%。见图1，图2。

3.3 联合抗氧化剂抗氧化效果考察

由3.2可知，茶多酚能够辅助出油率提升，维生素E抗氧化效果较好。故选择茶多酚及维生素E的最优用量进行复配。与茶多酚最优剂量组（0.5%）及维生素E最优剂量组（0.05%）相比，抗氧化剂复配组别过氧化值有所降低，复配抗氧化剂组既能达到低过氧化值，又能有较高出油率，兼顾低成本，此复配组合性价比最高。见表3。

3.4 联合抗氧化剂条件下最佳炼制时间考察

由结果可知，随着煎煮时间的增加，出油率刚开始迅速增加，至50%左右趋于平稳，表明蛇脂肉的极限出油率大致在50%左右，过氧化值刚开始增加较为缓慢后面增加速率逐渐提升，在第40分钟时出油率＞40%，过氧化值＜5 mmol·kg^-1。在40 min往后，出油率曲线的斜率明显降低，而过氧化值曲线的斜率却有明显增加，这表明进一步增加炼制时间获得的出油率提升并不大，而过氧化值却上升迅速。综合考虑，为尽量获得高出油率的同时保持较低过氧化值，最终选择煎煮时间40 min作为最佳提取工艺。炼制时间考察结果见图3。

3.5 各组创面愈合率比较

由创面状态可看出各组的实际愈合效果，从第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天，各组烫伤创面愈合速度存在明显差异。见图4。第3天、第6天、第9天、第12天、第15天，各组创面愈合率统计分析结果见图5。

3.6 各组烫伤区域皮肤愈合过程病理学变化

第3天各组皮肤组织均重度异常，视野内均未见清晰表皮层结构，可见大量细胞坏死真皮层胶原纤维排列紧密，组织可见炎症细胞浸润。第9天模型组及麻油组皮肤组织中度异常，表皮层结构完整但与结痂连成一块有所脱落，真皮层胶原纤维排列紧密。京万红组及精制蛇油组皮肤组织轻度异常，表皮层结构完整，京万红组结痂附在表皮层上即将脱落，真皮层胶原纤维排列紧密。第15天各组表皮结构均恢复完整，模型组和麻油组在创面核心处没有成型的毛囊和皮脂腺等皮肤附属器，可见少许炎症细胞浸润，京万红组及精制蛇油组皮肤附属器基本恢复完整，无明显炎症细胞浸润。见图6。

3.7 各组烫伤皮肤免疫组织化学分析

分析各组烫伤区域皮肤TGF-β₁蛋白表达，切片染色结果显示，棕色为蛋白着色，蓝色为细胞核着色。可见空白组切片表皮厚度正常，模型组切片棕色深染，蛋白表达主要位于表皮部分，表皮较厚；京万红组及精制蛇油组切片棕色浅染，覆盖面积较小，主要表达于表皮以及毛囊、皮脂腺等皮肤附属器部分；麻油组与模型组状态类似，棕色浅染。各组烫伤区域皮肤蛋白表达量经ImageJ软件半定量统计结果，模型组TGF-β₁蛋白表达量显著高于空白对照组，京万红组及精制蛇油组显著下调了模型组TGF-β₁蛋白的高表达。见图7、图8。

Smad3蛋白表达定位及表达量各组差异与TGF-β₁类似，蛋白表达主要定位于表皮、毛囊、皮脂腺等部位，京万红组与精制蛇油组均显著下调了模型组Smad3蛋白的高表达。见图9、图10。

3.8 各组烫伤皮肤TGF-β₁、Smad3基因的mRNA相对表达量分析

进一步分析各组烫伤区域皮肤TGF-β₁、Smad3的mRNA相对表达量，模型组显示出TGF-β₁、Smad3的mRNA高表达；而京万红与精制蛇油对烫伤创面的治疗均能显著抑制它们的过高表达；麻油的处理则收效甚微，与模型组差异无统计学意义。见图11。

4 讨论

本研究采用正交试验优化炼制参数条件，得到最佳炼制条件为电陶炉炼制功率200 W，提取时间20 min，提取次数1次，所得炼制蛇油过氧化值最低。为进一步降低过氧化值，同时尽可能提高出油率，采用单因素实验优选最佳抗氧化剂用量，并进行抗氧化剂复配，最佳抗氧化剂及复配添加量为0.5%茶多酚与0.05%维生素E，延长提取时间至40 min，可实现出油率＞40%，接近煎煮法炼制蛇油的极限出油率（50%左右），而过氧化值不超过5 mmol·kg^-1，氧化程度较低。

在抗氧化剂筛选实验中发现茶多酚可以增加出油率（图1），而维生素E不可以，另外随着维生素E添加量增加，蛇油的过氧化值却进一步上升（图2），分析认为茶多酚可能通过其强效自由基清除能力和可能的界面活性共同作用，保护油脂并促进释放^[10-11]。维生素E则可能因其脂溶性、依赖再生系统以及在较高浓度加热条件下潜在的促氧化倾向^[12]，导致了相反的实验结果。

伤口的修复过程可分为四个重叠的阶段：止血阶段、炎症阶段、增殖阶段、组织重塑以及疤痕成熟阶段^[13-14]。烫伤创面愈合涉及一系列分子和细胞事件，包括炎症、细胞迁移、血管生成、细胞外基质合成和上皮再生^[15]。对于日常小面积浅度烫伤的治疗，除了关注加速烫伤创面愈合，更重要的是关注愈合后毛囊、皮脂腺等皮肤附属器的恢复情况，尽量减少疤痕组织的形成，使皮肤状态尽可能恢复至烫伤前具备完整功能状态。京万红软膏为临床常用烫伤膏^[16]，疗效确切，在本研究中作为阳性药；麻油在《日华子本草》记载：“陈油煎膏，生肌长肉，止痛，消痈肿，补皮裂”。许多烧烫伤中药复方制剂中添加麻油^[17]，起到润滑保湿作用，在本研究中作为阳性油，与精制蛇油进行对比研究。本研究结果显示，精制金钱白花蛇蛇油的促烫伤愈合效果优于模型组及麻油组，与京万红软膏组相接近，HE染色切片表明创面愈合过程中京万红组及精制蛇油组恢复较快，在第15天时毛囊皮脂腺等皮肤附属器均已恢复完备，效果优于模型组及麻油组。

伤口愈合机制错综复杂，许多细胞因子参与了伤口愈合的进程^[18]，TGF-β被认为是一种强有力的刺激物，可刺激结缔组织的生长。在修复方面，已知TGF-β₁和TGF-β₂促进瘢痕组织形成，而TGF-β₃可能减少瘢痕形成^[19]。Smad信号转导通路在成纤维细胞中介导多种TGF-β反应中起着至关重要的作用，如刺激胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白，Smad3是促纤维化TGF-β反应的关键细胞内信号转导子^[20]。研究^[21]发现，靶向破坏TGF-β/Smad3信号可以调节皮肤纤维化，减少疤痕形成。本研究结果显示，经精制金钱白花蛇蛇油干预后，小鼠烫伤区域皮肤的TGF-β₁、Smad3蛋白及mRNA表达量均显著低于模型组。这提示在烫伤创面愈合末期，精制金钱白花蛇蛇油可能通过调控TGF-β₁/Smad3信号通路，减少过量成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，减轻纤维化胶原沉积，从而使得毛囊和皮脂腺等皮肤附属器能够更快速的生长恢复。

综上所述，本研究通过优选炼制工艺，添加复配抗氧化剂，实现了高效稳定的金钱白花蛇蛇油炼制，且获得的精制蛇油对小鼠的浅二度烫伤模型具有良好促愈合效果，其作用机制可能与抑制TGF-β₁/Smad3信号通路有关。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(82173989)