基于Wnt/β-catenin信号通路探讨桃红四物汤促进骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的机制研究

Exploration of mechanism of the Taohong Siwu Decoction in promoting proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells based on Wnt/β-catenin signaling pathway

摘要

目的 探讨桃红四物汤（THSWD）含药血清通过Wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖与成骨分化的影响。 方法 体外培养大鼠BMSCs，采用不同浓度THSWD含药血清（2.5%、5%、10%、15%、20%、30%）干预BMSCs，以CCK-8法筛选THSWD含药血清最佳作用浓度。分别设置空白组、模型组、THSWD组以及阳性对照组，观察大鼠BMSCs成骨分化情况，通过碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红（ARS）染色检测骨向分化程度；通过RT-qPCR和Western blot法检测各组细胞成骨关键因子及Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达。 结果 THSWD含药血清可显著提高BMSCs存活率，在10%浓度、作用48 h时效果最显著。ALP、ARS结果显示，THSWD组BMSCs成骨分化能力及钙盐沉积程度高于模型组（P＜0.001）。RT-qPCR和Western blot分析显示，THSWD组Runx2、OCN、Col-1、Wnt1、Wnt3a和β-catenin的mRNA和蛋白表达水平显著高于模型组（P＜0.05）。 结论 THSWD可促进BMSCs的增殖与成骨分化，其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of serum containing Taohong Siwu Decoction (THSWD) on the proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) through the Wnt/β-catenin signalling pathway. Methods Rat BMSCs were cultured in vitro. After intervention of BMSCs with different concentrations of THSWD-containing serum (2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%), the optimal concentration of THSWD-containing serum was determined by CCK-8 assay. The blank control group, the model group, the THSWD group and the positive control group were established to observe osteogenic differentiation of rat BMSCs. The degree of osteogenic differentiation was observed through alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red S (ARS) staining assays. The expression of key osteogenic factors and Wnt/β-catenin pathway proteins in each group was detected by RT-qPCR and Western blot. Results Serum containing THSWD significantly enhanced the survival rate of BMSCs, with the optimal effect observed at 10% concentration after 48 hours of treatment. ALP and ARS results demonstrated that osteogenic differentiation capacity and calcium salt deposition level of BMSCs in the THSWD group were higher than those in the model group (P<0.001). RT-qPCR and Western blot analysis showed that Runx2, OCN, Col-1, Wnt1, Wnt3a, and β-catenin mRNA and protein expression levels in the THSWD group were significantly higher than those in the model group (P<0.05). Conclusion THSWD can promote the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs, and its mechanism may be related to the activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway.

Graphical abstract

关键词

桃红四物汤 / 骨髓间充质干细胞 / 成骨分化 / Wnt/β-catenin信号通路

Key words

Taohong Siwu Decoction / bone marrow mesenchymal stem cells / osteogenic differentiation / Wnt/β-catenin signaling pathway

骨折是全球最常见的创伤性损伤之一，尤其在交通运输和建筑等高风险行业，职业危害显著增加了骨骼损伤的风险^[1-2]。尽管外科手术技术和术后护理有所进步，但延迟愈合和不愈合仍是主要临床难题，影响约10%的骨折病例，导致患者长期残疾、生活质量下降及沉重的社会经济负担^[3-5]。因此，提升骨折修复能力已成为骨科和再生医学领域的重点关注方向，推动着生物干预与药物治疗的协同发展^[6]。

虽然骨再生的形成机制尚不明确，但间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs），尤其是骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），因其独特的自我更新能力和向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化的多能性，在骨骼再生中发挥关键作用^[7-8]。BMSCs的成骨分化是一个受信号通路复杂调控的过程，其中Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路被认为是核心调控通路。研究^[9-10]发现该通路的激活可促进Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）和Osterix等关键成骨转录因子的表达，同时抑制脂肪分化，从而引导BMSCs向成骨细胞谱系定向分化。因此，Wnt/β-catenin信号通路的激活与骨折愈合相关，使其成为增强骨修复的潜在治疗靶点。

既往体内研究^[11-13]表明，中药复方桃红四物汤（Taohong Siwu Decoction，THSWD）能够有效加速大鼠骨折愈合。本研究拟在细胞水平上深入探讨，重点考察THSWD含药血清对大鼠BMSCs增殖及成骨分化的影响，并验证该效应是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现。

1 实验材料

1.1 实验动物与细胞株

30只3月龄SPF级雄性大鼠，体质量200 g左右，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-001。动物自由饮水，正常进食，室温（25±2）℃，相对湿度50%～60%，昼夜光照12 h/12 h。本研究动物实验经本院动物伦理委员会批准，伦理批准号：AHUCM-rats-2023220。实验细胞：OriCell^®Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（赛业生物科技有限公司，RAWMX-01001）。

1.2 药品与试剂

桃仁、当归、白芍、红花、川芎、熟地黄（安徽中医药大学门诊部国医堂，20250201、250201、2025010、250208、250203、2412063）；麝香接骨胶囊（南京医药合肥大药房连锁有限公司，20231201）；CCK-8试剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司，24134864）；茜红素染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，240009006）；碱性磷酸酶染色试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司，G0904W48&2024）；细胞裂解液（合肥白鲨生物科技有限公司，23143679）；5×SDS缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司，CR2209004）；山羊抗小鼠IgG（249760203）、山羊抗兔IgG（247860216）、ECL化学发光检测试剂盒（GLPBIO）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；β-actin（240090602）、显色液（GLPBIO）、Runx2（27c2645）、OCN（85n2245）、Col-1（26u3150）、Wnt1（8k8623）、Wnt3α（3f54869）、β-catenin（82i7934）抗体均购自江苏亲科生物研究中心有限公司。

1.3 实验仪器

离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-1024）；数显水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司，HH-4）；电泳仪（上海天能科技有限公司，EPS300）；转膜仪（上海天能科技有限公司，VE-186）；水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，TS-1000）；自动曝光仪（上海培清科技有限公司，JS-M6P）。

2 实验方法

2.1 药物制备及细胞培养

桃红四物汤按《中国药典》（2020年版）处方：桃仁、当归、白芍各9 g，红花、川芎各6 g，熟地黄12 g，以3:3:3:2:2:4比例称取，经中药学专家鉴定为合格药材。饮片浸泡30 min，煎煮2次，纱布过滤，合并滤液，旋蒸浓缩至浓度为生药0.9 g·mL^-1的提取液，4℃冷藏备用。细胞培养与复苏参照OriCell^®Wistar大鼠骨髓间充质干细胞说明书步骤规范操作。

2.2 含药血清的制备

将大鼠随机分为3组：正常组（0.9%生理盐水）、THSWD组（桃红四物汤）、阳性对照组（麝香接骨胶囊），每组10只。给药剂量按60 kg成人每日用量体表面积折算法折算，大鼠给药剂量为0.6 g·kg^-1；灌胃前将胶囊内容物用蒸馏水配成0.06 g·mL^-1的混悬液^[14]。适应性饲养7 d后，连续灌胃14 d，每日1次；各组大鼠末次灌胃1～2 h后，以2%戊巴比妥钠（30 mg·kg^-1）麻醉，于给药后1 h经腹主动脉无菌采血。室温静置2 h，2 500 rpm低温离心10 min，吸取上层血清，用0.22 μm滤膜过滤除菌，56℃水浴40 min灭活，制备含药血清，-80℃冰箱中保存备用。

2.3 分组及给药

将BMSCs置于完全培养基中，37℃、5% CO₂培养箱中培养。取状态良好的BMSCs，随机分为4组：空白组、模型组、THSWD组、阳性对照组。各组细胞给药方法：成骨诱导液（osteogenic induction MEM，OIM）配置（DMEM、10%FBS、1%青-链霉素、L-抗坏血酸-2-磷酸钠50 μM、β-甘油磷酸钠10 mM、地塞米松100 nM）；待细胞融合2 d后，加入含药血清进行干预。空白组：完全培养基+正常血清；模型组：完全培养基+正常血清+OIM；THSWD组：完全培养基+THSWD含药血清+OIM；阳性对照组：完全培养基+麝香接骨胶囊含药血清+OIM。

2.4 CCK-8筛选桃红四物汤最佳浓度

细胞消化后，加入培养基重悬，每孔细胞浓度为5×10³个。将细胞悬液制备好后轻轻混匀，每孔加入100 μL，边缘孔用无菌PBS填充。将接种好的细胞培养板放入培养箱中过夜培养，37℃、5% CO₂孵育。设置空白血清组，THSWD组分别配制2.5%、5%、10%、15%、20%、30%浓度的含药血清培养基进行换液。培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，孵育1～4 h，采用酶标仪检测450 nm波长下吸光度值。

2.5 碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力

各组经含药血清成骨诱导14 d后，弃去培养基，PBS冲洗2次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗3次，室温孵育30 min，于显微镜下观察，若胞浆内可见较多棕红色颗粒，则判定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）呈阳性表达。采用酶标仪测定520 nm波长下吸光度值。

2.6 茜素红染色检测成骨矿化结节

各组经含药血清成骨诱导14 d后，弃去细胞培养液，PBS清洗2次；4%多聚甲醛固定15 min，吸去固定液，PBS冲洗3次，加入0.1%茜素红（alizarin red S，ARS）红染色30 min，PBS冲洗2次，高倍显微镜下观察，钙结节沉积阳性细胞呈橘红色。PBS缓冲液冲洗后，加入10%氯化十六烷基吡啶，室温放置30 min，采用酶标仪测定562 nm波长下吸光度值。

2.7 RT‐qPCR法检测成骨及Wnt/β-catenin相关基因的表达

使用试剂盒提取细胞总RNA并测其纯度和浓度，去除基因组DNA污染后，将RNA模板逆转录为cDNA；以β-actin为内参，按照试剂盒说明书设置PCR反应程序：预变性95℃，30 s；变性95℃，10 s，退火60℃，30 s，共45个循环。结果采用2^‐ΔΔCt法分析，比较各组mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

2.8 Western blot法检测成骨及Wnt/β-catenin相关蛋白的表达

将BMSCs消化收集后，使用BCA法进行蛋白浓度定量，在蛋白样品中加入适量5×SDS蛋白上样缓冲液，95～100℃沸水浴10 min；制备PAGE凝胶，上样后以浓缩胶50 V、分离胶120 V恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿时停止电泳。将PAGE凝胶转移至PVDF膜，100 V恒压转膜90 min。将转印完成的膜加入封闭液中室温封闭1 h；除去封闭液，加入稀释后的一抗4℃孵育过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min；加入稀释后的二抗室温孵育30 min，用TBST室温摇床洗膜4次，每次5 min。最后进行化学发光检测，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

2.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 7软件进行统计学分析，所有实验数据均以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey's多重比较检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度桃红四物汤对骨髓间充质干细胞存活率的影响

结果显示，在一定浓度范围内，THSWD含药血清可显著提高BMSCs存活率；10%浓度THSWD含药血清作用48 h时细胞活性达到峰值（P＜0.01）。后续实验均采用10%浓度THSWD含药血清进行。见图1。

3.2 桃红四物汤对骨髓间充质干细胞骨向分化程度的影响

ALP结果显示，THSWD组与阳性对照组染色区域显著多于模型组（P＜0.001）。ARS结果显示，与模型组相比，THSWD组与阳性对照组染色面积更大（P＜0.001）。综上，THSWD含药血清可促进BMSCs向成骨细胞分化，其作用效果与阳性对照组相近。见图2。

3.3 桃红四物汤对骨髓间充质干细胞成骨分化相关及Wnt/β-catenin通路mRNA表达的影响

见图3。

3.4 桃红四物汤对骨髓间充质干细胞成骨分化相关及Wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响

见图4。

4 讨论

传统中医在治疗骨折修复和骨不连方面应用历史悠久^[15]。THSWD作为经典中药方剂，多用于妇科和内科，活血化瘀疗效显著^[16-17]。其由桃仁、红花、白芍、当归、川芎和熟地黄六味药材组成，体现“多药协同”理念，通过多种活性成分的协同作用实现整体疗效^[18]。现代药理学研究^[19-21]指出，方中当归多糖可激活Wnt/β-catenin通路，川芎中活性成分能增强BMSCs的成骨活性，而桃仁与红花则分别通过上调Runx2和调控MAPK/ERK通路促进成骨，从多成分角度验证了其协同作用。研究^[22-23]进一步发现，THSWD可促进下游成骨标志物Runx2、OCN和Col-1的表达。这一发现不仅与THSWD上调ALP、OCN、Runx2的研究^[24]一致，还将机制上游精确定位于Wnt/β-catenin通路的激活，从而在“中药复方成分-信号通路-细胞功能”之间建立了更直接的联系。

Wnt/β-catenin通路是调控BMSCs成骨分化的关键通路^[10]。在该通路中，Wnt1/Wnt3a等配体与细胞膜上的Frizzled受体及LRP5/6共受体结合，通过稳定细胞质内β-catenin并促进其核转位，进而激活Runx2、ALP、OCN等关键成骨基因的表达，最终驱动成骨分化与骨折愈合^[25-26]。骨折愈合涉及BMSCs的增殖和成骨分化，成骨细胞在骨形成、细胞外基质矿化的诱导与调控以及骨重塑调控中发挥关键作用。在骨形成过程中，成熟成骨细胞通过精确调控的生物学机制合成并分泌大量Col-1及关键非胶原蛋白（如OCN和OPN），这些蛋白共同构成骨骼组织的有机基质框架^[27]。基于先前研究，本研究证实，THSWD的促成骨效应与激活Wnt/β-catenin信号通路密切相关。实验结果显示，THSWD处理可上调关键配体Wnt1/Wnt3a的表达，促进β-catenin在细胞质中的积累及其向细胞核的转位。该过程启动了成骨基因表达程序，表现为ALP、Runx2、OCN及Col-1等标志物表达显著上调，揭示了THSWD通过调控经典Wnt通路促进BMSCs成骨分化的机制。

然而，BMSCs具有多向分化潜能，本研究仅聚焦于其成骨分化，未探究THSWD对其向脂肪细胞、软骨细胞乃至血管内皮细胞分化的影响。其次，尽管本研究证实桃红四物汤可激活Wnt/β-catenin通路，但中药复方“多成分、多靶点”的特性表明，方中直接调控该信号通路的具体活性成分单体仍有待进一步分离与鉴定。

综上所述，本研究表明THSWD能提高骨髓间充质干细胞的存活率、ALP活性及矿化结节形成能力。此外，THSWD可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，并激活细胞内Wnt/β-catenin信号通路，该通路可能参与调控THSWD对大鼠骨髓间充质干细胞的促成骨作用。

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基金资助

安徽省高校自然科学研究项目(2023AH050772)