基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨淫羊藿苷对膝骨关节炎的作用机制研究

Exploration of the mechanism of action of icariin on knee osteoarthritis based on TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

摘要

目的 本研究旨在探究淫羊藿苷对膝骨性关节炎（KOA）的调控机制。 方法 选取健康实验兔25只，随机分为空白组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组、淫羊藿苷低剂量组和淫羊藿苷高剂量组，每组5只。除空白组外，其余各组均以0.5 mL·kg^-1木瓜蛋白酶混合液与0.03 mol·L^-1 L-半胱氨酸注射实验兔左膝关节腔，并结合驱赶运动以建立模型。模型构建成功后，将造模成功的实验兔随机分为模型组、硫酸氨基葡萄糖组及淫羊藿苷低、高剂量组，灌胃相应药物28 d。通过HE染色观察软骨病理变化并进行Mankin评分；采用ELISA法测定关节液及血清中白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及前列腺素E2（PGE2）的含量；运用RT-PCR与Western blot法检测关节组织中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA及蛋白表达水平。 结果 与空白组相比，模型组关节间隙狭窄、骨赘生成、软骨损伤，Mankin评分及炎症因子水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，淫羊藿苷组软骨损伤减轻，Mankin评分及炎症因子水平降低（P＜0.05），关节组织中Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）的mRNA与蛋白表达水平均下调。 结论 淫羊藿苷可降低兔早期KOA炎症因子水平，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的活化，提示其可能通过该通路抑制炎症、延缓KOA发展。

Abstract

Objective To investigate the regulatory mechanism of icariin on knee osteoarthritis (KOA). Methods 25 healthy experimental rabbits were selected and randomly divided into the blank group, the model group, the glucosamine sulphate group, the low-dose icariin group, and the high-dose icariin group, with 5 rabbits in each group. Except for the blank group, all other groups received 0.5 mL·kg^-1 papain mixed solution and 0.03 mol·L^-1 L-cysteine injected into the left knee joint cavity, combined with forced locomotion to establish the model. Following successful modelling, the successfully modeled rabbits were randomly divided into the model group, the glucosamine sulphate group, and the low-dose icariin group and the high-dose icariin group, with corresponding drugs administered by gavage for 28 days. Cartilage pathological changes through haematoxylin and eosin (HE) staining were observed and Mankin scoring was performed. The levels of interleukin(IL)-1β, IL-6, tumour necrosis factor-α (TNF-α) and prostaglandin E₂ (PGE₂) in synovial fluid and serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). mRNA and protein expression levels of Toll-like receptor 4 (TLR4), myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and nuclear factor kappa-B (NF-κB) in joint tissues were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis. Results Compared with the blank group, the model group exhibited significantly increased joint space narrowing, osteophyte formation, cartilage damage, Mankin scores, and inflammatory factor levels (P<0.05). Compared with the model group, the icariin group demonstrated reduced cartilage damage, decreased Mankin scores and inflammatory factor levels (P<0.05), and downregulated mRNA and protein expression levels of TLR4, MyD88, NF-κB in joint tissues. Conclusion Icariin can reduce inflammatory factor levels in early-stage KOA in rabbits and inhibit the activation of the TLR4/MyD88/NF-κB pathway, suggesting that it may suppress inflammation and delay KOA progression through this pathway.

Graphical abstract

关键词

淫羊藿苷 / 膝骨关节炎 / Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子-κB信号通路

Key words

icariin / knee osteoarthritis / Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/ nuclear factor- κB signalling pathway

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨科临床常见的退行性关节病变，其核心病理特征表现为关节软骨渐进性退化与丢失、软骨下骨硬化及骨赘形成，并伴随关节功能异常，严重影响患者运动功能及生活质量^[1-3]。流行病学调查^[4-6]显示，我国KOA总体患病率约为18%，且随年龄增长显著递增。现有研究^[7-10]证实，KOA的发生发展是慢性炎症反应、软骨细胞退行性改变及机械负荷等多种内外源性因素共同作用的结果，其中炎症反应的异常激活是驱动疾病进展的关键病理环节之一。具体而言，在KOA病理进程中，白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）及前列腺素E₂（prostaglandin E₂，PGE₂）等炎症因子对关节软骨降解、滑膜炎症反应及软骨下骨重塑等关键病理环节发挥重要调控作用，其表达水平与疾病严重程度呈正相关^[11-14]。同时，这些炎症因子可通过上调基质金属蛋白酶家族（matrix metall-oproteinases，MMPs）的表达，协同加速软骨基质中Ⅱ型胶原与蛋白多糖的不可逆降解^[15]。

临床治疗方面，西医目前仍以非甾体抗炎药为主要干预手段。该类药通过减少PGE ₂ 合成可在短期内缓解疼痛，但长期应用易引发胃肠道黏膜损伤等不良反应，且无法阻断软骨基质破坏进程，临床应用受限^[16]。因此，探寻安全有效的治疗手段已成为优化KOA治疗策略的关键。中医药在KOA治疗中具有整体调节、多靶点干预的优势，临床实践证实其疗效显著且安全性较高^[17]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，属于类黄酮化合物^[18]。现代药理学研究^[19]表明，其在调节炎症微环境、抑制炎症因子释放、促进软骨细胞修复及延缓软骨退变方面具有显著作用。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路在KOA病理进程中发挥关键调控作用；该通路异常激活可促进炎症因子释放、加速软骨下骨硬化与软骨退变，而抑制其活性可降低膝关节局部炎症水平，缓解软骨及软骨下骨损伤^[20-21]。淫羊藿苷作为天然抗炎活性成分，可多靶点、多途径调控炎症反应，显著下调炎症微环境中促炎细胞因子的释放水平^[22]。在脂多糖、TNF-α等诱导的细胞模型中，淫羊藿苷能以剂量依赖性方式抑制IL-6、IL-1β等关键促炎因子的转录与分泌，减少炎性细胞浸润，减轻局部炎症组织损伤，从而阻断炎症信号的起始与传导^[23]。

目前，淫羊藿苷是否通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导其对KOA的具体作用机制，尚缺乏系统性研究报道。本研究拟通过构建KOA动物模型，系统探讨淫羊藿苷干预KOA的作用机制。

1 实验动物与材料

1.1 实验动物

25只雄性新西兰大白兔，体质量2.0～2.3 kg，购自哈尔滨市道里区骏琦养殖场，生产许可证号：SCXK（黑）2021-004，经黑龙江省实验动物质量检测机构检测合格。实验于长春中医药大学动物实验中心进行，饲养室温度16～26℃，相对湿度40%～70%。本研究已通过长春中医药大学动物伦理委员会审核批准（审批号：2024234）。

1.2 药物及主要试剂

淫羊藿苷（西安齐岳生物，489-32-7，纯度≥98%）；木瓜蛋白酶（上海麦克林生化科技有限公司，P6321-100 g）；L-半胱氨酸（上海麦克林生化科技有限公司，L804954-25 g）；硫酸氨基葡萄糖胶囊（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20041316）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京百奥思科生物医学技术有限公司，MD913053）；SDS-PAGE预制胶套装试剂盒（北京百奥思科生物医学技术有限公司，MD911919）；HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（北京百奥思科生物医学技术有限公司，MD912565）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技术股份有限公司，P0013），β-actin抗体（澳大利亚Affinity公司，AF7018y）；TLR4抗体（澳大利亚Affinity公司，AF7017）；MyD88抗体（澳大利亚Affinity公司，AF5195）；p-NF-κB抗体（澳大利亚Affinity公司，AF2006）；NF-κB抗体（澳大利亚Affinity公司，AF5006）抗体。ELISA试剂盒：IL-1β（武汉赛培生物科技有限公司，SP25549）、IL-6（武汉赛培生物科技有限公司，SP25495）、TNF-α（武汉赛培生物科技有限公司，SP25520）；TRIZOL试剂（北京艾德莱生物科技有限公司，RN0102）；SuperScript Ⅲ逆转录酶试剂盒（成都市蓉为基因生物科技有限公司，A502）；苏木素-伊红染液（武汉百仟度生物科技有限公司，B1002）。

1.3 主要仪器

动物跑步机（宇晟，YS-J100）；电子秤（宇恒，SF-400）；摇床（海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS-100）；染色机（DIAPA，THTHGiotto）；荧光定量PCR仪（朗基，Q2000B）；脱水机（武汉俊杰电子有限公司，JJ-12J）；组织包埋中心（武汉俊杰电子有限公司，JB-P5）；正置光学显微镜（日本尼康，NikonEclipse CI）；电泳仪（北京百晶生物技术有限公司，BG-subMIDI）；台式高速冷冻离心机（赛默飞，CF1524R）；化学发光成像系统（勤翔，Chemi Scope 6100）。

2 实验方法

2.1 分组及模型建立

25只新西兰大白兔在正常饮水和标准饲料适应7 d后，随机分为空白组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组、淫羊藿苷低剂量组和淫羊藿苷高剂量组，每组5只。除空白组外，其余各组参照文献[24]方法建立KOA模型：实验兔仰卧位固定，剔除左膝关节周围被毛，依次以碘伏、75%乙醇对局部皮肤消毒，屈曲膝关节至75°，于髌韧带中点外上方进针，注入0.5 mL·kg^-1木瓜蛋白酶与0.03 mol·L^-1 L-半胱氨酸的混合液。于第1、3、7天各注射1次。同时，每日固定时间驱赶实验兔在跑步机上运动，每日2次，每次15 min，连续14 d。造模14 d后，对所有造模兔进行模型验证。模型成功判定标准为：左侧膝关节出现明显肿胀，伴屈伸活动受限；X线影像学检查显示膝关节解剖结构特征性改变。

2.2 给药方法

淫羊藿苷高剂量组给药剂量为0.046 g·kg^-1，以10 mL纯净水溶解；淫羊藿苷低剂量组剂量为0.023 g·kg^-1，按同法配制；硫酸氨基葡萄糖组剂量为0.077 g·kg^-1，去除胶囊壳后以10 mL纯净水溶解药粉。以上各组每日灌胃1次，连续28 d。模型组与空白组每日灌胃等体积生理盐水，连续28 d。

2.3 样品采集

末次给药后，于兔右后肢肌肉注射麻醉剂（舒泰50和速眠新Ⅱ按6:1比例混合）；向左膝关节腔注入0.8 mL无菌生理盐水，被动屈伸15次，抽取0.5 mL关节液；同时经耳缘静脉采血5 mL。室温静置30 min后，3 000 r·min^-1离心10 min，吸取上清液分装，-20℃冻存备用。打开左侧膝关节腔，用咬骨钳取股骨远端及胫骨近端组织，立即投入4%多聚甲醛中固定，再放入脱钙机处理4 h。

2.4 检测指标

2.4.1 X线影像学检查

将实验兔置于专用动物固定器，用眼罩遮蔽双眼以减少应激。待其呼吸平稳后，被动伸展双后肢进行拍摄准备。拍摄正位片时，实验兔取仰卧位，髋关节屈曲30°，同时保持15°髋外展，膝关节充分伸展并确保髌骨朝向正前方；球管与后肢拍摄区域的垂直距离设定为110 mm。侧位片拍摄时，实验兔取右侧卧位，左侧后肢伸直并置于身体前侧，右侧后肢被动屈曲髋关节70°、膝关节30°，并置于身体后侧；球管与拍摄部位的距离仍维持110 mm，以保证影像比例一致。所有拍摄参数均统一：工作电压45 kVp，照射电流160 mA，照射量5.02 mAs，曝光时间31 ms。

2.4.2 软骨组织病理观察

给药结束后，取所有实验兔左侧胫骨关节面软骨组织。用锋利骨刀切取软骨组织，将获取的软骨组织修剪成适宜尺寸的组织块，立即置于4%多聚甲醛中固定。经脱水、脱钙等系列处理后，进行HE染色，于光学显微镜下观察软骨形态并拍照。

2.4.3 Mankin评分标准

根据HE染色切片，由病理学专业人员参照Mankin评分标准对软骨退变程度进行评估。评分标准见表1。

2.4.4 关节液和血清中炎症因子水平测定

采用ELISA法测定关节液和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE₂的水平，具体操作严格按各试剂盒说明书进行。

2.4.5 RT-PCR检测关节组织中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达

取适量膝关节软骨组织，采用Trizol法提取总RNA，按试剂盒反应体系逆转录为cDNA后进行PCR扩增。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA相对表达量。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共35个循环。引物信息见表2。

2.4.6 Western blot法检测关节组织中TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达

取适量膝关节组织，液氮研磨后加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取总蛋白；BCA法测定蛋白浓度。将等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，随后电转移至聚偏氟乙烯膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入TLR4、MyD88、NF-κB p65及磷酸化NF-κB（p-NF-κB）p65一抗，4℃孵育过夜；次日加对应种属二抗，室温孵育1 h。ECL化学发光显色，采用化学发光成像系统采集图像，使用Image J软件分析目的蛋白与内参灰度值，计算相对表达量。

2.5 统计学方法

所有数据采用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。多组间比较采用One-Way ANOVA，方差齐者用LSD法进行组间比较。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 膝骨关节炎模型建立的X线影像学验证

为验证兔KOA模型是否成功，于造模后进行X线片检查，结果显示：空白组左膝关节间隙对称、胫骨平台轮廓规整，未见骨赘形成；模型组关节间隙显著缩窄，胫骨平台关节面粗糙且不规整，髁间隆起变锐，并出现软骨下骨骨质硬化及骨赘形成。见图1。

3.2 各组膝关节软骨组织HE染色

HE染色结果显示：空白组关节软骨结构完整、厚度正常、表面光滑，软骨细胞充足且分布均匀，无明显退变；模型组呈典型KOA病理改变，表现为软骨细胞大量缺失、软骨层变薄、残存细胞排列紊乱，软骨表面可见纤维组织增生、炎症细胞浸润及血管翳形成，表明模型构建成功。各组给药干预28 d后，硫酸氨基葡萄糖组关节损伤较模型组减轻，软骨层仍较薄、细胞数量减少且排列紊乱，纤维组织增生及炎症细胞浸润减少；淫羊藿苷低剂量组损伤进一步减轻，软骨层增厚、表面覆盖少量纤维组织，细胞数量增多但排列紊乱；淫羊藿苷高剂量组病变改善最为显著，软骨表面无纤维组织，软骨层较厚、细胞分布较均匀，仅表面稍不平滑。见图2。

3.3 各组膝关节软骨Mankin评分比较

见表3。

3.4 各组膝关节软骨组织中炎症因子水平比较

见图3。

3.5 各组膝关节软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平比较

见图4。

3.6 各组膝关节软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白水平比较

见图5。

4 讨论

膝骨关节炎是临床常见的慢性骨关节疾病，以高发病率、高致残率为显著特征^[25-26]。该疾病不仅严重损害患者身心健康，导致生活质量大幅下降，还会给患者及其家庭造成沉重的经济负担^[27]。在中医理论体系中，KOA归属于“痹证”范畴，其病机总属本虚标实，即肝肾亏虚为发病之本，风寒湿等外邪乘虚侵袭为发病之标，加之气血亏虚日久成瘀，共同导致关节筋骨失养、疼痛畸形，推动疾病发生发展^[28]。正如《张氏医通》所述：“膝为筋之府，膝痛无有不因肝肾虚者……”因此，补益肝肾、强筋健骨成为临床治疗KOA的核心治则。淫羊藿是临床补益肝肾的经典常用药，其性温味辛甘，入肝肾二经，常以复方形式高频率用于治疗KOA，疗效得到临床实践与基础研究的双重佐证^[29-30]。淫羊藿苷是从淫羊藿中提取的异戊二烯类黄酮衍生物，具有抗炎、抗氧化、调节骨代谢及保护软骨细胞等多重药理活性^[31]。既往研究^[32]证实，淫羊藿苷能够降低膝关节局部的炎症反应、延缓膝关节软骨退变进程、改善软骨下骨硬化。本研究以木瓜蛋白酶联合L-半胱氨酸构建的KOA模型兔为研究对象，通过不同剂量淫羊藿苷干预，旨在观察其治疗效果。研究结合影像学表现与HE染色结果判定KOA模型的成功构建，并从软骨组织形态结构、炎症因子含量变化及信号通路相关分子表达等方面，系统阐释了淫羊藿苷的治疗作用及其潜在分子机制。

在KOA的病理进程中，炎症反应扮演着至关重要的角色。其中，IL-1β被认为是驱动KOA进展的关键因子，可促进细胞外基质降解及软骨细胞损伤，并能与IL-6等其他炎性介质协同发挥促炎作用^[33]。IL-6作为由软骨细胞等合成并释放的细胞因子，不仅通过多条途径参与机体免疫应答，更是介导软骨损伤、诱发炎症反应并推动KOA病情进展的关键介质^[34-35]。TNF-α是另一个能够参与软骨基质合成和软骨退变等病理过程的炎性介质。此外，IL-1β还可诱导软骨细胞及滑膜组织产生PGE2，MMPs与PGE₂的协同作用会进一步加剧软骨破坏，最终推动KOA的发生与进展^[36-37]。TNF-α可通过自分泌或旁分泌途径刺激软骨降解酶的表达，并促进PGE₂生成，进而导致软骨损伤。

既往研究^[38]表明，通过注射木瓜蛋白酶构建KOA模型后，大鼠关节液及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE₂的表达水平显著升高。本研究结果显示，与模型组相比，不同剂量淫羊藿苷组兔关节液及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE₂的表达水平均显著降低，且以淫羊藿苷高剂量组的下调效果最为明显；同时，HE染色结果证实，各剂量淫羊藿苷组的软骨组织损伤程度均较模型组减轻，炎性细胞浸润也呈减少趋势，其中高剂量组的改善作用最为突出。上述结果提示，淫羊藿苷可通过降低兔软骨组织中IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE₂的表达水平，有效延缓KOA的病理进展。

TLR4是先天免疫的关键受体，作为NF-κB信号通路的上游启动因子，在KOA的病理进程中同样发挥着至关重要的作用。TLR4首先与适配蛋白MyD88结合，继而激活TRAF6，进而可触发NF-κB信号通路的活化，其中p-NF-κB是NF-κB激活后的主要存在形式^[39]。NF-κB作为经典的炎症相关信号通路，在炎症反应调控中占据核心地位。当其被激活时，会促进IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE₂的转录水平升高，引起膝关节局部的炎症反应^[40]。因此，抑制软骨细胞中TLR4和下游信号通路的激活可以减少相应炎症因子的释放，并减缓软骨变性及KOA的进展。既往研究表明栀子苷能够通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善IL-1β、IL-6、TNF-α诱导的软骨细胞凋亡和炎症反应，最终有效延缓膝关节软骨的损伤及退化^[41]。本研究中，与模型组相比，各剂量淫羊藿苷组的TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白和mRNA表达水平均显著下降，且以高剂量淫羊藿苷组下降最为显著。这一结果表明，淫羊藿苷对TLR4的抑制可减少其与适配蛋白MyD88的结合，进而降低NF-κB的磷酸化水平（p-NF-κB/NF-κB比值下降）。这一过程直接减少了IL-1β、IL-6等促炎因子的转录启动，提示淫羊藿苷可能通过阻断TLR4/MyD88/NF-κB级联反应，实现对KOA炎症反应的抑制。

综上所述，淫羊藿苷对KOA具有显著治疗效果，能够有效抑制KOA引发的膝关节局部炎症反应，降低促炎因子的释放水平，并能减轻炎症介导的关节软骨损伤，发挥软骨保护作用。其治疗作用可能是通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路实现的。

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基金资助

吉林省自然科学基金(20210101189JC)