基于UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定温胆宁心颗粒的化学成分研究

Study on the identification of chemical constituents of Wendan Ningxin Granules based on UPLC-Q-TOF-MS/MS

摘要

目的 采用多反应监测模式的超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）法对温胆宁心颗粒的化学成分进行快速识别和鉴定。 方法 以Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）为色谱柱，超纯水-0.1%甲酸（A）、乙腈-0.1%甲酸（B）为流动相进行梯度洗脱；柱温：40 ℃，流速：0.35 mL·min^-1。质谱采用电喷雾离子源（ESI）正、负离子模式，扫描范围m/z 100～1 500，利用Analyst 1.6.3处理质谱采集数据，然后基于MWDB数据库、HIT数据库、BATMAN数据库及相关文献共分析。 结果 通过与对照品比对，同时依据相对分子量、保留时间和质谱特征碎片离子信息及物质成分特定靶标生物的活性水平（level）对化合物进行综合鉴定，其中在10味植物类中药中鉴定出136个化学成分，包括62个黄酮类、13个生物碱类、22个萜类、20个酚酸类、8个木脂素和香豆素类、1个醌类及10个其他类化合物，2味矿物类中药鉴定出13个化学成分，合并去重后得到温胆宁心颗粒的147个化学成分。 结论 构建的UPLC-Q-TOF-MS/MS能快速、准确、较全面地鉴定温胆宁心颗粒的化学成分，为其药效物质基础的深入阐释提供了重要依据。

Abstract

Objective To rapidly identify and characterize the chemical constituents of Wendan Ningxin Granules (WDNX) using ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS/MS) in multiple reaction monitoring mode. Methods The separation was performed on an Agilent SB-C18 column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) with ultra-pure water containing 0.1% formic acid (A) and acetonitrile containing 0.1% formic acid (B) as the mobile phase for gradient elution. The column temperature was set at 40 ℃ , and the flow rate was 0.35 mL·min⁻¹. Mass spectrometry was performed using an electrospray ionization (ESI) source in both positive and negative ion modes, with a scan range of m/z 100-1,500. The data from mass spectrometry were processed using Analyst 1.6.3 software, followed by comprehensive analysis based on the MWDB, HIT, and BATMAN databases as well as relevant literature. Results Compounds were comprehensively identified by comparison with reference standards, and based on relative molecular weight, retention time(RT), characteristic fragment ions, and the activity levels of specific target organisms for the constituent components. A total of 136 chemical constituents were identified in the 10 herbal medicines, including 62 flavonoids, 13 alkaloids, 22 terpenoids, 20 phenolic acids, 8 lignans and coumarins, 1 quinone, and 10 other compounds. Additionally, 13 chemical constituents were identified in the 2 mineral-based traditional Chinese medicines. After merging and removing duplicates, 147 chemical constituents of WDNX were obtained. Conclusion The established UPLC-Q-TOF-MS/MS method can rapidly, accurately, and comprehensively identify the chemical constituents of WDNX, providing an important basis for the indepth elucidation of its pharmacodynamic material basis.

Graphical abstract

关键词

温胆宁心颗粒 / 多反应监测模式 / 超高效液相色谱-串联质谱联用技术 / 化学成分

Key words

Wendan Ningxin Granules / multiple reaction monitoring mode / ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry / chemical components

温胆宁心颗粒（Wendan Ningxin Granules，WDNX）是广安门医院的著名院内制剂之一，由高荣林教授所创，对缓解失眠、焦虑症及冠心病伴抑郁障碍具有良好的治疗效果^[1-3]。WDNX由酸枣仁、党参、半夏、陈皮、竹茹、枳实、茯苓、石菖蒲、远志、龙骨、牡蛎、炙甘草等组成。课题组既往已探究WDNX对心肌梗死伴抑郁症模型大鼠的疗效及其对心肌和脑组织共保护的作用机制^[3]，WDNX作为一种有前景的替代药物已经开始受到广泛关注，但WDNX的药效成分尚未明确。近年来，探索中药活性成分已成为中医药现代化研究的重要方向。在这一背景下，超高效液相色谱-串联质谱联用技术（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）凭借其高效分离能力和强大的结构表征能力，为植物提取物成分的快速、准确鉴定提供了可靠的高通量平台^[4]。该技术也能为系统药理学研究提供关键数据支持。综上，本研究为探索WDNX治疗冠心病合并抑郁症的可靠药理作用和潜在机制提供了必要的数据支持，也为中药现代化研究提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

WDNX包括酸枣仁（批号：25010021）、党参（批号：25030026）、半夏（批号：25100259）、陈皮（批号：25030022）、竹茹（批号：24120025）、枳实（批号：25010226）、茯苓（批号：25010160）、石菖蒲（批号：24120030）、远志（批号：24110125）、龙骨（批号：24090012）、牡蛎（批号：24080135）、炙甘草（批号：24090243）免煎颗粒均购于四川新绿色药业科技发展有限公司。甲醇（货号：1.06007.4008）购自德国Merck公司；乙腈（货号：5011403）购自上海星可高纯溶剂有限公司；（货号：695076）甲酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要仪器

ExionLC™ AD超高效液相色谱仪-QTRAP 6500⁺质谱系统、Triple Q-TOF 6600质谱系统（美国AB SCIEX公司）；5424R型离心机、Research plus型移液器（德国Eppendorf公司）；MU-G02-0448型恒温金属混匀仪（杭州米欧仪器有限公司）；MS105DM型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；CentriVap型离心浓缩仪（美国Labconco公司）；VORTEX-5型涡旋混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ5200E型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Biomek i5型自动化工作站（美国贝Beckman Coulter公司）；Mini HES型封膜仪（莫纳生物科技有限公司）。

1.3 WDNX化合物组成的信息数据库

WDNX组分的鉴定首先依托自建MWDB（metware database）数据库，基于二级质谱信息获取化学名称、结构式、分子量及保留时间（retention time，RT），并剔除了同位素信号、Na⁺、K⁺、NH₄⁺等加合物及高分子碎片离子干扰。与此同时，利用BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）和HIT（http://www.badd-cao.net:2345/）数据库收集了龙骨、牡蛎等矿物药对应成分。在本研究中，于BATMAN-TCM数据库中选取Cut off值＞20作为筛选标准，并在HIT数据库平台通过化合物名称检索获得目标化合物的信息。另外，如果相关文献中报道该化合物为WDNX的生物活性成分，则补充纳入本研究，包括中国知网、维普、万方、PubMed等数据库及相关文献报道的。

1.4 样品和标准溶液的制备

WDNX颗粒剂样品溶解后置于-80℃冰箱保存，取出全解冻后且无冰晶，旋涡混匀10 s。取200 μL样品于1.5 mL离心管中编号，加入等体积（200 μL）70%甲醇内标提取液，若体积不足则按1:1比例补足。内标提取液由1 mg对照品溶解于1 mL 70%甲醇制备1 000 μg·mL^-1母液，继而稀释至250 μg·mL^-1。混合液旋涡混匀15 min，4℃、16 000×g离心3 min。取60 μL上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后收集于进样瓶，待LC-MS/MS分析。

1.5 LC-MS/MS采集条件

样品在Triple Q-TOF 6600进行定性分析，并在ExionLC™ AD超高液相色谱仪-QTRAP 6500⁺质谱系统上开展定量分析。

液相条件：Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流动相：超纯水-0.1%甲酸（A）、乙腈-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 min，5% B；0～9 min，5%～95% B；9～10 min，95% B；10～11 min，95%～5% B；11～14 min，5% B）；柱温：40℃，流速：0.35 mL·min^-1，进样量：2 µL。

质谱条件：1）Q-TOF 6600 数据收集采用信息相关采集模式。质谱源参数为：GAS1 50 psi、GAS2 50 psi、气帘气25 psi，源温500℃；去簇电压正/负模式分别为+60 V/-60 V；喷雾电压正/负模式分别为+5 500 V/-45 00 V。MS1（TOF-MS）扫描设置为质量范围100～1 250 Da，累积时间200 ms，并启用动态背景排除；MS2（子离子）扫描质量范围50～1 250 Da，累积时间50 ms，碰撞能量正/负模式分别为±30 V，碰撞能量分布15 V，二级谱采集强度阈值100 cps，排除4 Da内的同位素干扰，质量偏差设为50 ppm；每循环最多采集10个二级谱，对同一目标离子在连续出现两次后实施4 s的动态排除。2）QTRAP 6500⁺采用高分辨质谱对色谱柱洗脱下来的小分子进行正、负离子模式采集。电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）的参数设置如下：毛细管温度，500°C；喷雾电压，5 kV（正离子模式）/-4.5 kV（负离子模式）；离子源气体I、气体II和气帘气分别设置为50、60和25（磅力/平方英寸），设置高的碰撞诱导电离参数。三重四极杆扫描采用多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM），并将碰撞气体（氮气）设置为中等。通过去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）的进一步优化，完成所有MRM离子对的DP和CE。最后根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。

2 结果

2.1 LC-MS/MS条件的优化

为获得理想的色谱分离与电离效率，本研究对UPLC-MS条件进行了系统优化。色谱方面，选用Agilent SB-C18色谱柱（1.8 μm），并以含0.1%甲酸的乙腈/水为流动相，此条件下峰形良好、分离度最高。质谱方面，在三重四极杆上首先锁定母离子，排除其他离子干扰；经碰撞诱导裂解后，筛选特征碎片离子进行二次过滤，从而提升定量的精准度和重现性。所得各样本代谢物图谱经峰面积积分，并对不同样本中共有代谢物进行校正^[5]。

2.2 WDNX主要成分的定性定量分析

采用“1.5”中灵敏、可靠且高通量的质谱采集方案，快速鉴定WDNX的主要成分。借助Analyst 1.6.3软件处理质谱数据，获得混合质控样本的总离子流图（total ions current，TIC）和MRM检测信息。TIC曲线以RT为横坐标、总离子强度为纵坐标。基于MWDB数据库，对MRM检测到的化合物进行质谱定性；三重四极杆筛选特征离子并记录其CPS。最后，使用MultiQuant软件对所有色谱峰进行积分与校正，峰面积即对应物质的相对含量，并导出保存数据^[6]。

2.3 WDNX主要成分的鉴定

数据预处理方面，先按所得化学成分最小值的1/5对缺失值进行填充，再计算质控样本的变异系数（coefficient of variation，CV），仅保留CV＜0.5的成分用于后续分析。化合物鉴定综合考虑分子量、同位素峰、RT和质荷比（m/z）值；代谢物鉴定基于精确质量、MS2碎片及其同位素分布和RT，并采用迈维代谢研发的智能二级谱匹配方法，将样品中每一代谢物的二级质谱与公司数据库中的二级谱及RT逐一比对，MS和MS2容差均设为20 ppm，RT容差为0.2 min。同时结合物质的定性等级（level）与CAS号进行确认。

经上述流程与优化计算，本研究在10味中药中鉴定出136个主要化学成分，按类别包括：黄酮类62个、生物碱13个、萜类22个、酚酸类20个、木脂素及香豆素类8个、醌类1个及其他10个。

另对2味矿物药通过“1.3”公共数据库筛选并去重后共鉴定13个成分。考虑到金丝桃苷（Hyperoside）和芦丁（Rutin）在网络药理学筛选与LC-MS分析中均被检出，通过将两部分候选化合物列表进行交叉比对并剔除冗余，最终获得了准确且唯一的WDNX复方成分信息，共计147个化合物，具体鉴定结果见文献[7]。本研究以二级质谱信息、RT与数据库匹配得分≥0.5为筛选依据；亦可依据主要碎片离子、RT、DP、CE与数据库记录完全一致的化合物进行遴选。依据上述标准，表1列出了本次分析中最具代表性的30种化合物。表2为WDNX中矿物药的成分筛选。TIC见图1。

2.4 化合物结构

2.4.1 黄酮类化合物

本次研究共鉴定出62个黄酮类成分，黄酮类成分主要包括游离黄酮和黄酮醇，以及少量的二氢黄酮、异黄酮和查尔酮，包括儿茶素、山柰苷、芦丁、南酸枣苷、木犀草素、夏佛塔苷、芸香柚皮苷、异甘草素、柚皮素、淫羊藿苷、芒柄花苷、忍冬苷、枸橘苷、毛蕊异黄酮、美迪紫檀素等。大部分来源于陈皮、枳实和甘草，少数来源于半夏、竹茹和酸枣仁。多个黄酮类成分存在同分异构体，如芸香柚皮苷、金圣草黄素7-O-新橙皮苷和枸橘苷等。

黄酮类化合物在正、负离子模式下响应均较好。以化合物（14）为例，RT=5.1 min，在UPLC-MS中，相邻时间段出现了m/z Q1（Da）271.06、Q3（Da）151，Q1（Da）283.06、Q3（Da）268.04，Q1（Da）593.19、Q3（Da）285.08等碎片离子，对应离子峰均为[M-H]^-，与文献[8]的离子碎片以及标准品对比，推测化合物（14）为毛蕊异黄酮，其二级质谱图及裂解途径见图2。可能的裂解规律：毛蕊异黄酮在A、B环存在甲氧基时，易失去甲基自由基（-·CH3），从而生成特征碎片离子m/z 268.039 5。同时，C环则倾向于发生中性丢失，脱去CO或CO₂。

2.4.2 生物碱类

在温胆宁心颗粒中，共鉴定出13个生物碱类成分，如党参碱、党参次碱、辛弗林、葫芦巴碱和胆碱等，主要来自党参、枳实和半夏。酚酸类在正、负离子模式下响应均较好，以正离子模式下响应为例，化合物（1）RT=0.8 min，[M+H]⁺，其m/z Q1（Da）138.06、Q3（Da）94.07；而化合物（2），RT=2.3 min，[M+H]⁺，其m/z Q1（Da）268.15、Q3（Da）88.09，两者均属于吡咯类生物碱，与文献[9-10]的离子碎片以及标准品对比，推测化合物（1）为葫芦巴碱，化合物（2）为党参碱。其裂解规律见图3、图4。

党参碱的质谱分析显示，苯环上的甲氧基同样易于脱去甲基自由基，而吡咯环则经历开环重排反应，伴随氢迁移和电子重排，形成特征碎片离子m/z 161.059 1。进一步地，苯环与吡咯环之间的C-C键断裂后，生成m/z 118.085 1的碎片离子，该离子经过吡咯环的开环重排，最终形成m/z 88.075 2的碎片。葫芦巴碱则易发生脱羧反应，失去CO₂（44 Da），其余部分重新组合为N-甲基吡啶衍生物，生成m/z 94.064 5。随后，脱甲基和吡啶环的氢重排进一步导致更稳定的m/z 78.034 2的碎片离子生成，最后脱去氮（N）形成m/z 65.039 1的碎片。

2.4.3 萜类化合物

在温胆宁心颗粒中萜类化合物主要来源于酸枣仁和甘草，少部分来源于茯苓、远志和石菖蒲，共鉴定出22个萜类成分，包括酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、细叶远志皂苷、茯苓新酸AM、异水菖蒲酮、Licoricesaponin P2、yunganoside M和甘草酸等，萜类化合物以三萜、倍半萜及三萜皂苷等形式存在，以倍半萜和三萜皂苷形式存在的化合物多具有同分异构的现象，如菖蒲烯二醇和去氧甘草酸苷，萜类通常在负离子模式下响应较好，母离子主要以[M-H]^-，或以[M+H]⁺形式存在时多为正离子模式。如化合物（7），RT=4.5 min，在UPLC-MS中，其m/z Q1（Da）1 045.56、Q3（Da）455.35；此外，如化合物（11），RT=9.3 min，其m/z Q1（Da）513.36、Q3（Da）295.24，与文献[11-12]的离子碎片以及标准品对比，推测化合物（7）为酸枣仁皂苷B，化合物（11）为茯苓新酸AM。

2.4.4 酚酸类化合物

共鉴定出20个酚酸类成分，分别为党参苷Ⅴ、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、远志糖苷A、[6]-姜酚及西伯利亚远志糖A3等，主要来源党参和远志，酚酸类在正、负离子模式下响应均较好。如化合物（1），[M-H]^-，RT=2.5 min，在UPLC-MS中，其m/z Q1（Da）153.02、Q3（Da）109.03；此外，如化合物（6），[M-H]^-，RT=3.9 min，其m/z Q1（Da）469.14、Q3（Da）119.05，与文献[13]的离子碎片以及标准品对比，推测化合物（1）为原儿茶酸，结合碎片裂解信息及相关文献数据[14-15]比较，推测化合物（6）为党参苷Ⅴ。

2.4.5 木脂素和香豆素类化合物

共鉴定出8个木脂素和香豆素类成分，包括橙皮内酯、佛手酚和佛手柑内酯等，主要来自陈皮和枳实。木脂素和香豆素类化合物在正、负离子模式下均有响应。如化合物（3），RT=7.3 min，[M-H]⁺，在UPLC-MS中，其m/z Q1（Da）261.11、Q3（Da）189.07；此外，如化合物（6），RT=3.9 min，[M-H]⁺，其m/z Q1（Da）217.04、Q3（Da）202.03，两者均属于香豆素，与文献[16]的离子碎片以及标准品对比，推测化合物（3）为橙皮内酯，化合物（6）可能为佛手柑内酯，两者也均具有同分异构的现象。

2.4.6 其他类化合物

共鉴定出10个其他类化合物，包括党参苷I、松柏醛和菖蒲酮等，主要来自陈皮、竹茹和石菖蒲。这些化合物在正、负离子模式下均有响应。根据化合物（8），RT=4.5 min，在UPLC-MS中，其m/z Q1（Da）179.07、Q3（Da）91.06，[M-H]⁺；同理，化合物（4），RT=3.3 min，在UPLC-MS中，其m/z Q1（Da）677.23、Q3（Da）261.11，[M-H]^-。与文献[15，17]的离子碎片以及标准品对比，推测化合物（8）为松柏醛，化合物（4）可能为党参苷I。

2.4.7 其他矿物类

其他龙骨、牡蛎的主要化学成分为氨基酸、无机元素等。例如：碳酸钙、硫酸钙、磷酸钙、三氧化二铁、氧化镁、铝、镁等。

3 讨论

本研究基于UPLC-MS技术系统鉴定出WDNX中的136种化学成分，并从公共数据库筛选出11种化合物。结果显示，本品主要成分为黄酮类，其次依次为生物碱、酚酸类和萜类化合物。黄酮含量最高，主要来源于陈皮、枳实和甘草。鉴定过程中发现同分异构体，如枸橘苷、橙皮内酯及木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等，需通过与对照品、文献数据比较等方法进一步确认。

本研究还强调了UPLC-MS质谱法在快速、灵敏和有效地识别复杂植物样本中次要或不稳定生物活性成分方面的优势。这些化学物质的鉴定和结构阐明为WDNX的植物化学研究、质量控制和药理学研究提供了必要数据支持。

参考文献

[1] 史华伟，郭蓉娟，耿东，等.温胆宁心颗粒联合心理疗法治疗心胆气虚型广泛性焦虑症的随机对照临床研究［J］.环球中医药，2013，6（10）：728-732.

[2] 李桂侠，刘艳娇，洪兰，等.温胆宁心颗粒治疗原发性失眠症的临床研究［J］.北京中医药，2013，32（10）：775-777.

[3] 吕李飞，朱婷婷，陈琛，等.温胆宁心颗粒对心肌梗死合并抑郁大鼠BDNF/TrkB/PI3K/Akt信号通路的影响研究［J］.海南医学院学报，2024，30（11）：824-832.

[4] WANG S S， XU H Y， MA Y，et al. Characterization and rapid identification of chemical constituents of NaoXinTong capsules by UHPLC-linear ion trap/Orbitrap mass spectrometry［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015，111：104-118.

[5] CHEN W， GONG L， GUO Z L，et al. A novel integrated method for large-scale detection， identification， and quantification of widely targeted metabolites： application in the study of rice metabolomics［J］. Molecular Plant，2013，6（6）：1769-1780.

[6] FRAGA C G， CLOWERS B H， MOORE R J，et al. Signature-discovery approach for sample matching of a nerve-agent precursor using liquid chromatography-mass spectrometry， XCMS， and chemometrics［J］. Analytical Chemistry，2010，82（10）：4165-4173.

[7] 吕李飞.基于BDNF/TrkB/NLRP3通路探究温胆宁心颗粒治疗冠心病合并焦虑抑郁状态的机制及临床疗效［D］.北京：中国中医科学院，2025.

[8] 周伟娥.中药复方糖肾方的化学成分分析及其体内作用过程的研究［D］.北京：北京协和医学院，2021.

[9] 朱琳，侯丽华，任健，等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS及网络药理学探究生脉饮（党参方）抗慢性心衰的药效物质基础及作用机制［J］.中国医院药学杂志，2025，45（11）：1282-1289.

[10] 杨琼梁，孔祥柏，张小娟，等.UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法分析健脾扶正颗粒化学成分及入血成分［J］.中成药，2025，47（6）：2078-2089.

[11] 杨慧敏，杨彪，胡玉梅，等.基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技术的桂枝茯苓胶囊化学成分分析［J］.中国中药杂志，2020，45（4）：861-877.

[12] 李静，陈伟燕，李松，等.基于体内化学成分及网络药理学的经典名方酸枣仁汤质量标志物预测分析［J］.中国药学杂志，2024，59（22）：2140-2147.

[13] 张安娜，陈森杰，周晨阳，等.基于UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS分析柴胡清肝汤的物质基础及其体内分布特征［J］.中草药，2025，56（14）：4947-4965.

[14] 安太勇，陈晓虎，张梅，等.UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用快速分析川党参的化学成分［J］.中草药，2018，49（7）：1533-1542.

[15] 张靖，徐筱杰，徐文，等.HPLC-LTQ-Orbitrap-MSⁿ快速鉴别党参药材中化学成分［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（9）：59-63.

[16] 罗思妮，彭致铖，范倩，等.经典名方小承气汤中化学成分的UPLC-Q-Orbitrap-MS分析［J］.中国实验方剂学杂志，2021，27（23）：1-10.

[17] 潘龙祥，高喜梅，乔萍，等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合化学模式识别分析温胆汤不同工艺的差异性成分［J］.中草药，2025，56（8）：2811-2828.

基金资助

国家自然科学基金项目(82305016)

中国中医科学院优秀青年科技人才培养专项(ZZ18-YQ-015)