基于TGF-β₁/Smads通路探讨柔木丹颗粒对肝纤维化大鼠的作用机制

Exploration of mechanism of action of Roumudan granules on rats with liver fibrosis based on the transforming growth factor beta 1/Smads pathway

摘要

目的 观察柔木丹颗粒对四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化模型大鼠的影响，基于转化生长因子β₁（TGF-β₁）/Smads通路探讨其作用机制。 方法 将50只SFP级SD大鼠分为空白组、模型组、柔木丹颗粒高、中、低剂量组，各10只。除空白组外，其他组皮下注射60% CCl₄溶液建立肝纤维化模型。第3周起，分别给于高、中、低剂量的柔木丹颗粒溶液灌胃，持续6周。治疗结束，观察肝脏组织形态变化，检测血清肝功水平；HE染色、Masson染色观察肝脏病理学；检测肝脏TGF-β₁蛋白表达、TGF-β₁ mRNA表达水平；及TGF-β₁、Smad3、Smad4蛋白表达情况。 结果 与模型组比较，治疗组一般状况改善，体质量增加，肝重及肝指数明显下调，以高剂量组最为显著；肝组织质地较光滑且边缘相对完整；大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、单胺氧化酶（MAO）水平均降低，以高剂量组最为显著，透明质酸（HA）水平降低，以中剂量组最为显著；大鼠肝细胞间炎性细胞浸润胶原纤维沉积减轻，以高剂量组最为显著；TGF-β₁ mRNA表达水平降低；TGF-β₁蛋白表达显著降低，以高剂量组最显，Smad4蛋白表达水平在高剂量组轻度上调，Smad3蛋白表达水平轻度下调。 结论 柔木丹颗粒能够显著改善CCl₄诱导的肝纤维化大鼠一般状况、体质量、肝重，可显著降低肝纤维化大鼠肝脏指数，并有效改善肝功能及肝脏组织的病理变化，其核心机制可能与柔木丹颗粒抑制TGF-β₁/Smads信号通路进而发挥抗肝纤维化的作用有关。柔木丹的给药剂量与CCl₄诱导的大鼠肝纤维化改善呈正相关。

Abstract

Objective To observe the effect of Roumudan granules on CC1₄-induced hepatic fibrosis model rats, and to explore the mechanism of action based on the transforming growth factor beta 1 (TGF-β₁)/Smads pathway. Methods 50 SFP-grade SD rats were randomly divided into the blank group, the model group, and the high-dose, medium-dose, and low-dose Roumudan granules groups, with 10 rats in each group. Except for the blank group, the other groups were subcutaneously injected with 60% CC1₄ solution to establish the liver fibrosis model. From the third week, high-dose, medium-dose, and low-dose Roumudan granule solutions were administered by gavage for 6 weeks. At the end of the treatment, liver tissue morphology changes were observed, and serum liver function levels were detected; HE staining and Masson staining were used to observe liver pathology; The protein expression and mRNA expression levels of TGF-β₁ in the liver were detected, and the expression of TGF-β₁, Smad3 and Smad4 proteins was also detected. Results Compared with the model group, in the treatment group, the general condition improved, body weight increased, liver weight and liver index decreased significantly, with the high-dose group being the most significant; The liver tissue texture was smoother and the edge was relatively intact; The levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and monoamine oxidase (MAO) in rat serum decreased, with the high-dose group being the most significant; The level of hyaluronic acid （HA） decreased, with the medium-dose group being the most significant; The infiltration of inflammatory cells and collagen fiber deposition between liver cells were alleviated, with the high-dose group being the most significant; The expression level of TGF-β₁ mRNA decreased; The expression of TGF-β₁ protein decreased significantly, with the high-dose group being the most significant; The expression level of Smad4 protein was slightly upregulated in the high-dose group, and the expression level of Smad3 protein was slightly downregulated. Conclusion Roumudan granules can significantly improve the general condition, body weight and liver weight of rats with CC1₄-induced hepatic fibrosis, significantly reduce the liver index of rats with hepatic fibrosis, and effectively improve the liver function and the pathological changes of liver tissues. And the core mechanism may be related to the inhibition of the TGF-β₁/Smads signaling pathway, thereby exerting the effect of anti- hepatic fibrosis. The administered dose of Roumudan is positively correlated with the improvement of CC1₄-induced liver fibrosis in rats.

Graphical abstract

关键词

柔木丹颗粒 / 肝纤维化 / 转化生长因子β₁ / 细胞外基质 / smads蛋白

Key words

Roumudan granules / liver fibrosis / transforming growth factor β₁ / extracellular matrix / smad proteins

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）指的是在长期持续的肝脏损伤影响下，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度积累所引发的慢性病理变化过程^[1]。是肝脏在受到多种因素的长期刺激后所启动的一种过度修复机制，且若不加控制，可能进一步恶化成肝硬化，甚至肝癌^[2-3]。研究^[4]发现，HF早期是一个可逆的过程，若这些损伤因素能够及时消除，肝脏有能力恢复正常，已经形成的HF也有可能逆转。但由于HF进展过程中缺乏独特的标志性症状，导致患者在早期阶段未能及时发现并接受治疗，炎症刺激持续存在，ECM过度积累，使得胶原蛋白逐渐替代肝实质，并进一步进展为肝硬化^[5-6]，进一步引发一系列严重并发症，如食管胃底静脉曲张、肝性腹水、肝性脑病和肝细胞癌等，最终使得患者的生存率及生存质量直线下降^[7]。更有甚者最终会发展为肝细胞癌，也成为了慢性肝病患者死亡的首要原因。据估计，全世界每年死于肝硬化和肝细胞癌的患者已超过100万例^[8]。因此，倘若可以及时发现HF并有效干预肝纤维化的进展，就能够预防肝硬化和肝癌的发生。但由于HF发病机制较为庞杂，目前临床上尚无治疗肝纤维化的特异性药物^[9]。近年来，大量研究^[10-11]证实中医药凭借其辨证论治、整体观念和多靶点药理作用，在抗肝纤维化方面显示出其独特的优势。目前以转化生长因子（transforming growth factor-beta 1，TGF-β₁）/Smads信号通路为靶点来实现肝纤维化的逆转，已成为当前研究的经典通路。柔木丹颗粒（zoemudan，RMD）是陕西中医药大学附属医院常占杰教授创制用于防治慢性肝病的一种院内制剂。前期我们团队^[12]对67例乙型肝炎肝纤维化患者进行临床研究，发现柔木丹颗粒治疗乙型肝炎肝纤维化与大黄蛰虫丸疗效相当，值得临床推广。并且研究^[13]证实柔木丹颗粒可通过降低肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原α1链（collagen type I alpha 1 chain，COL1A1）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1）及TGF-β₁的表达而改善CCl₄诱导的小鼠肝纤维化。这一研究为柔木丹颗粒在肝纤维化防治领域的临床应用提供了初步的理论支撑。然而，关于其是否会对TGF-β₁/Smad信号转导通路中的其他信号转导分子产生影响，仍有待进一步深入研究。本研究拟应用四氯化碳（carbon tetrachlorid，CCl₄）建立肝纤维化大鼠模型，予以高、中、低三种不同剂量对于模型大鼠干预及对照，探讨柔木丹颗粒抗肝纤维化的疗效及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

1.1.1 动物饲养、造模及给药

50只SPF级大鼠，实验动物许可证号：SCXK（川）2024-030，饲养于陕西中医药大学实验动物中心，实验环境的相对湿度为60％，大鼠自由进食饮水，室温控制在18~22℃，采用单笼饲养，每笼5只，提供自然光照。饲料购于成达硕生物科技公司（生产批号：20240308）。

50只SPF级SD大鼠进行7 d适应性喂养后，随机分为空白组、模型组及柔木丹颗粒高、中、低剂量组，各10只。除空白组外，其他各组皮下注射60%的CCl₄溶液，首次注射量为5 mL·kg^-1，后续每3天注射1次，每次量为3 mL·kg^-1，持续8周建立肝纤维化模型。从第3周起，柔木丹颗粒低、中、高剂量组分别每天灌胃2、4、8 g·kg^-1·d^-1RMD溶液1次，空白组和模型组则灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液，连续6周。动物试验伦理审批号：SUCMDL20240411001。

1.1.2 实验药物

RMD 10 g×10袋（陕中附院药剂科，批号：Z20240012）。

1.1.3 实验试剂及相关仪器

四氯化碳（CCl₄上海博耀生物，货号ALD2503）、HE染色试剂盒（福建飞净，货号PH4180）；RIPA裂解液（武汉博士德，货号AR0102）；PVDF膜（0.45um）（美国密理博，货号HY-IPVH00010）；Anti-TGF Beta 1/TGFB1 Antibody（武汉博士德，货号BA0290）；Anti-Smad3 Antibody（武汉博士德，货号BA4559）；Anti-Smad4 Antibody（武汉博士德，货号BM3920）；HY-819石蜡切片刀片（德国徕卡，货号HY-819）；PCR仪（东胜创新生物）；水平电泳仪（北京君意东方电泳）；全自动生化分析仪（Chemray240）；病理切片机（德国LeicaRM2016轮转式）；脱水机（武汉俊杰JT-12J）；RM2235石蜡切片机（Leika，德国）；蛋白电泳系统（Bio-rad，美国）。

1.1.4 标本处理和肝脏指数计算

药物干预周期结束后，采用腹腔注射2%的戊巴比妥钠（40 mg·kg^-1）进行麻醉，随后收集腹主动脉血液和肝脏组织。血液静置后，分离出血清并低温分装保存。肝脏组织经过漂洗处理，吸干水分后，称量其重量。部分肝脏样本被固定在甲醛溶液中保存，剩余部分则分装并储存于-80℃的环境中。肝脏指数=肝脏湿重/体质量×100%。

1.1.5 一般状况观察

每日监测大鼠的生长状况、精神状态，以及它们的饮食、饮水、毛发、活动和死亡情况。每周对大鼠的体质量进行测量并记录。

1.2 指标检测

1.2.1 各组血清生化指标检测

从腹腔动脉采集血液样本，以3 000 r·min^-1的速度离心15 min，分离出血清后，采用Chemray240全自动生化分析仪对各组血清样本进行指标检测：丙氨酸氨基转移酶（ alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）。

1.2.2 HE染色和Masson染色观察大鼠肝脏病理形态学变化

1）HE染色：将经过4%多聚甲醛液固定的肝组织取出，进行逐级梯度酒精脱水处理后，用二甲苯透明化样本，再进行浸蜡和石蜡包埋。接着，切片并脱蜡，使用苏木精-伊红染液进行染色，苏木精使细胞核呈蓝色，伊红则使细胞质和胞浆呈红色。脱水后，用中性树脂封片，通过光学显微镜观察大鼠肝脏的病理形态学变化。2）Masson染色：取一定量的肝组织，保存在10%多聚甲醛中。经过24 h后，按照试剂盒说明书中的步骤操作，依次滴加染色剂，进行脱水处理、二甲苯透明化，并使用中性树胶进行封片。然后，使用显微镜观察肝组织的病理变化，并拍照记录。重点观察染成蓝色的胶原纤维分布情况，胶原纤维通常呈蓝色染色。

1.2.3 Real-time PCR检测肝组织中TGF-β₁ mRNA的表达

使用Trizol法按照说明书从组织中提取RNA，并通过逆转录合成cDNA，遵循试剂盒说明书中的操作步骤。实验使用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪进行定量分析。选用β-actin作为内参基因，采用目的基因与内参基因的比值法进行数据分析，以评估基因表达水平。PCR引物序列见表1。

1.2.4 免疫组织化学法检测肝脏组织TGF-β₁蛋白表达

使用免疫组化法检测肝组织中的TGF-β₁蛋白。首先，对切片进行常规脱蜡处理，直至样本回到水相。接着，按照标准程序依次加入一抗和生物素化二抗进行孵育，随后使用DAB显色剂进行显色反应。显色完成后，使用苏木素进行复染，并最终用中性树胶封片以保持切片的稳定性。为了量化TGF-β₁蛋白的表达水平，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对每个组织切片中的TGF-β₁蛋白进行定量分析，计算其平均光密度值。同时，使用100倍显微镜观察组织切片，拍摄照片并进行定性分析，以评估TGF-β₁蛋白的分布和表达情况。

1.2.5 Western blot法检测TGF-β₁、Smad3、Smad4蛋白表达

取100 mg肝组织，剪碎后加入RIPA裂解液，冰上研磨，制备10%的肝组织匀浆。将匀浆分离后提取蛋白，备用。随后，进行SDS-PAGE电泳，并通过转膜、封闭处理后进行免疫反应。TGF-β₁、Smad3和Smad4的抗体稀释比例分别为1:1 000。将膜在4℃下孵育过夜。第2天，使用5%脱脂牛奶稀释二抗（羊抗兔-HRP，稀释比例1:5 000），在常温下孵育1 h。最后，对膜进行扫洗，并进行密度分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 21.0统计分析软件进行数据处理，结果以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。2组样本间的均值比较采用独立样本t检验，并进行方差齐性检验；对于2组以上的均值比较，采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 柔木丹颗粒对CC1₄诱导的肝纤维化大鼠一般状况的影响

观察发现，空白组的生长状况良好，食量饮水正常，毛质光滑有光泽感，精神状态充沛；而模型组精神状态不佳且明显缺乏活力，食量及饮水量减少，体质量减轻，毛色暗淡无光泽；高、中、低剂量组健康状况各方面较模型组明显改善，其中尤以柔木丹高、中剂量组改善突出。以上结果说明柔木丹可以明显改善纤维化大鼠的生存质量及生存状态。

2.2 柔木丹颗粒对CC1₄诱导的肝纤维化大鼠体质量、肝重、肝指数的影响

见表2。

2.3 柔木丹颗粒对CC1₄诱导的肝纤维化大鼠肝脏肉眼观的影响

药物干预周期结束后取大鼠肝组织标本，肉眼观察可见空白组肝脏大小正常，颜色呈红褐色且有光泽，质地光滑有弹性。模型组肝脏大小较空白组稍偏大，肝脏颜色较空白组偏苍白且无光泽，质地粗糙无弹性，个别模型组肝脏组织出现小结节及肿块。柔木丹中、高剂量组肝脏组织大小、颜色、质地都介于空白组与模型组之间，整体更接近空白组，柔木丹低剂量组肝脏组织整体状态、大小、颜色、质地更趋近于模型组。与模型组比较，治疗组的肝脏组织表面相对光滑且有光泽，呈淡红浅褐色，组织边缘相对完整，质地较有弹性，以高剂量组改善最为明显。见图1。

2.4 柔木丹颗粒对CC1₄诱导的肝纤维化大鼠血清肝功水平的影响

见图2。

2.5 柔木丹颗粒对CC1₄诱导的肝纤维化大鼠肝脏病理形态学变化

HE染色结果显示，空白组肝脏呈正常小叶结构，肝小叶结构清晰完整，肝细胞排列紧凑，形状均匀，肝小叶无明显损伤，蓝色细胞核基本居中，核膜无缺损，无明显异型核出现，胞质染色均匀，未见明显脂肪空泡及炎性细胞浸润。模型组肝细胞间存在明显炎性细胞浸润。给药组均有模型组病理样改变，但程度较轻，尤以高剂量组改善最明显。见图3。

Masson染色镜下显示，空白组未见明显胶原纤维沉积，模型组胶原纤维大量存在，给药组胶原纤维均有不同程度改善，其中以高剂量组最为明显，低剂量组、中剂量组较模型组稍有改善，胶原纤维稍有减少。见图4。

2.6 大鼠肝组织TGF-β₁蛋白表达的免疫组化检测

结果显示，与空白组相比，模型组TGF-β₁阳性表达量明显增多。与模型组相比，柔木丹不同剂量给药组TGF-β₁阳性表达明显呈减少趋势，且中、高剂量组阳性表达减少更为明显，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）。见图5、图6。

2.7 柔木丹颗粒对大鼠肝组织中TGF-β₁ mRNA表达水平的影响

根据荧光PCR结果分析显示，与空白组比较，模型组肝组织中TGF-β₁ mRNA的表达水平明显增加（P＜0.000 1）；与模型组比较，不同剂量柔木丹干预后TGF-β₁ mRNA的表达水平均下降，但程度有所不同，其中以柔木丹高剂量组的下降幅度尤为显著（P＜0.001）。见图7。

2.8 柔木丹颗粒对肝纤维化大鼠肝脏TGF-β₁、Smad3、Smad4蛋白表达的影响

见图8、图9。

3 讨论

HF发生在肝细胞受损后的愈合反应中，是一个长期、慢性且可逆的病理过程^[14]。既往研究表明，肝细胞外基质合成与降解之间的平衡失调是肝纤维化的主要病理基础。这种平衡失调会导致肝脏淋巴细胞的生长和炎症浸润，同时促进肝细胞的坏死和变性。在长期作用下，这些病理过程可能导致纤维隔和再生结节的形成，进而诱发肝纤维化^[15]。常占杰教授认为肝炎肝纤维化是由肝炎病毒感染引起的，然肝炎病毒作为病因，与中医所述的湿热疫毒因素相符。湿热和疫毒互结难去，导致疾病迁延不愈。因此，湿热疫毒是肝炎肝纤维化的主要发病因子，正气虚弱则为内因。柔木丹颗粒是由其由黄芪、皂刺、鳖甲、枳壳、柴胡、赤芍、丹参、川芎、汉防己等药材组成，主治气虚血瘀型肝纤维化，该方的主要作用是软坚散结、益气化瘀。方中，黄芪具有甘温补气、行滞通痹的作用；皂刺和鳖甲能滋阴清热、软坚散结；柴胡可疏解肝气，枳壳能行气宽中，两者合用，增强了疏肝理气的功效；赤芍、丹参、川芎共奏活血化瘀之功；汉防己则利湿消肿。各药相辅相成，体现“气行则血行，血行则瘀散”的治疗原理，旨在补气活血、散结排毒，调和气血，改善肝脏功能。

肝纤维化早期往往没有明显的特异性症状，而肝活检作为一种有创检查方法，其应用受到一定限制且较为不便。随着无创检测技术的不断进步，发现当肝脏遭到重创后，肝细胞会发生破裂，导致细胞内的各种酶迅速释放到血液中，其中AST和ALT的变化尤为显著^[16]。因此，通常通过检测AST和ALT的水平来评估肝脏损伤的程度。而血清中的HA、MAO等指标与肝纤维化密切相关，这些指标可用于评估患者的肝纤维化程度及预测后期治疗效果^[17]。在模型组中发现大鼠血清ALT、AST、HA、MAO水平均显著增加，在RMD药物治疗组中，ALT、AST、HA、MAO水平相对模型组来说下降，但各组程度有所不同，尤以高剂量组最为显著。同时发现经过RMD治疗后，各组肝脏的颜色改善，质地和色泽改善肝功能都与RMD的给药剂量呈正相关。因此，研究得出高剂量的RMD可显著改善CCl₄诱导的肝纤维化大鼠的肝功能，发挥保肝护肝的作用。

作为TGF-β家族的重要成员，TGF-β₁在这些因素中扮演着核心的角色。它是一种重要的纤维化因子，通过激活其下游的胞内效应分子蛋白Smad信号通路，大量促进肌成纤维细胞的聚集，并诱导凋亡蛋白的表达^[18]。这些过程不仅导致造血干细胞 （hematopoietic stem cells，HSCs）的活化增殖，还进一步推动它们向肌成纤维细胞（myofibroblast, MFBs）转化，深度参与EMT过程。在HF的背景下，TGF-β₁通过与肝细胞表面的特定受体结合，调控Smads蛋白转导通路，进而诱导细胞凋亡，促进ECM的合成，并抑制其降解，这些作用共同加剧了肝纤维化的进程^[19]。Smads蛋白家族在TGF-β信号转导过程中扮演核心角色，其中受体调控型Smad2、Smad3负责介导TGF-β的信号传导，通用型Smad4则是TGF-β信号传导不可或缺的分子，而抑制型Smad7则负责抑制TGF-β的信号传导^[20]。因此，阻断TGF-β₁/Smads信号通路不仅能够有效减少ECM的形成，更能显著降低肝纤维化的程度。基于此本实验中，挑选了HSC活化途径上的2个信号点：诱发信号TGF-β₁及效应信号Smad4、Smad3作为观察指标，旨在检测不同剂量的RMD对肝纤维化大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响。在模型组中，发现TGF-β₁、Smad3、Smad4的蛋白表达水平显著上升，在RMD药物治疗各组中TGF-β₁、Smad3、Smad4的蛋白表达水平显著下降，尤以高剂量组下降明显，说明高剂量的RMD药物干预下，大鼠HSC的异常激活和增生得到了显著的抑制，胶原的生成减少，肝脏ECM的积累降低，肝脏功能得到改善，进而有效减缓了CCl₄所致的肝损伤和肝纤维的进程。同时，大鼠肝组织TGF-β₁表达水平明显减少，且肝脏组织中的TGF-β₁ mRNA阳性区域表达面积在各治疗组中显著减少，尤以高剂量组最为显著，表明TGF-β₁/Smads信号通路受到抑制，同时也说明高剂量的RMD可以较显著的抑制肝纤维化组织内TGF-β₁/Smads通路的传导。

综上所述，本研究通过RMD高、中、低三种不同剂量来干预CCl₄诱导的肝纤维化模型大鼠以观察RMD对肝纤维化大鼠的影响作用，发现RMD可能通过抑制TGF-β₁通路信号转导，进一步诱导肝脏中Smad3、Smad4的表达下降，从而减少肝细胞中的炎性浸润及减少胶原沉积，改善肝脏功能，进而发挥抗CCl₄所诱导的大鼠肝纤维化的作用。并且，柔木丹的给药剂量与CCl₄诱导的大鼠肝纤维化改善呈正相关。但因为HF的病理机制复杂，且RMD由多味中药共组而成，考虑是否可通过优化方剂中的方药或寻找其他更优信号通路来验证RMD治疗HF的作用有待进一步研究。

参考文献

[1] 徐列明，刘平，沈锡中，等.肝纤维化中西医结合诊疗指南（2019年版）［J］. 临床肝胆病杂志，2019，35（7）：1444-1449.

[2] DHAR D， BAGLIERI J， KISSELEVA T，et al. Mechanisms of liver fibrosis and its role in liver cancer［J］. Experimental Biology and Medicine， 2020， 245（2）：96-108.

[3] REHAM M， DAWOOD M，MAI A，et al. Key players of hepatic fibrosis［J］. Journal of Interferon and Cytokine Research，2020，40（6）：472-489.

[4] AHMAD W， IJAZ B， GULL S，et al. A brief review on molecular， genetic and imaging techniques for hcv fibrosis evaluation［J］. Virology Journal，2011，8（1）：1-16.

[5] CALIGIURI A， GENTILINI A， PASTORE M，et al. Cellular and molecular mechanisms underlying liver fibrosis regression［J］. Cells，2021，10（10）：2759.

[6] CHANG M L， YANG S S. Metabolic signature of hepatic fibrosis： from individual pathways to systems biology［J］. Cells，2019，8（11）：1423.

[7] WENDY C， SPEARMAN G M， DUSHEIKO M，et al. Hepatitis c［J］. The Lancet，2019，394（10206）：1451-1466.

[8] MOON A M， SINGAL A G， TAPPER E B. Contemporary epidemiology of chronic liver disease and cirrhosis［J］. Clinical Gastroenterology and Hepatology，2020，18（12）：2650-2666.

[9] ROEHLEN N， CROUCHET E， BAUMERT T F. Liver fibrosis： mechanistic concepts and therapeutic perspectives［J］. Cells，2020，9（4）：875.

[10] 徐列明，刘平，沈锡中，等.肝纤维化中西医结合诊疗指南（2019年版）［J］.中国中西医结合杂志，2019，39（11）：1286-1295.

[11] LI H. Advances in anti hepatic fibrotic therapy with traditional chinese medicine herbal formula［J］. Journal of Ethnopharmacology，2019，251：112442.

[12] 席奇，刘宝咸，刘亚珠，等.柔木丹颗粒治疗乙型肝炎肝纤维化随机对照研究［J］.现代中西医结合杂志，2016，25（36）：3991-3993.

[13] 史晓燕，许小凡，宋亮，等.柔木丹颗粒对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的治疗作用［J］.新乡医学院学报，2019，36（1）：1-6.

[14] HUANG H M， ZHOU X R， LIU Y J，et al. Histone deacetylase inhibitor givinostat alleviates liver fibrosis by regulating hepatic stellate cell activation［J］. Molecular Medicine Reports，2021，23（5）：305.

[15] STALLA F， ARMANDI A， MARINONI C，et al. Chronic hepatitis B virus infection and fibrosis： novel non-invasive approaches for diagnosis and risk stratification［J］. Minerva Gastroenterologica e Dietologica，2022，68（3）：306-318.

[16] AGBIM U， ASRANI S K. Non-invasive assessment of liver fibrosis and prognosis： an update on serum and elastography markers［J］. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology，2019，13（4）：361-374.

[17] NIU A R， QI T G. Diagnostic significance of serum type iv collagen（IVC） combined with aspartate aminotransferase （AST）/ alanine aminotransferase （ALT） ratio in liver fibrosis［J］. Annals of Translational Medicine，2022，10（24）：1310.

[18] 陈勇，吴瑞胜，王竟静，等.非编码RNA介导TGF-β₁/Smads信号通路与肝纤维化及中药活性成分干预研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2023，29（7）：252-261.

[19] 封莉，吴敏娟，徐俊驰，等.慢性乙型肝炎患者血清肝纤维化指标水平及检测意义［J］.中国卫生检验杂志，2019，29（2）：199-201.

[20] TZAVLAKI K， MOUSTAKAS A. TGF-β signaling［J］. Biomolecules，2020，10（3）：487.

基金资助

陕西省自然科学基础研究计划(2025JC-YBMS-910)

咸阳市二O二O年重点研发计划(2020K02-116)