天降血栓通丸对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体能量代谢的影响

Effects of Tianjiang Xueshuantong pills on mitochondrial energy metabolism in rats with cerebral ischemia–reperfusion injury

摘要

目的 观察天降血栓通丸对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及对线粒体能量代谢的影响。 方法 将30只SD大鼠分为假手术组、模型组、天降血栓通丸组、胞磷胆碱组，采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，假手术组与模型组每天给予生理盐水灌胃，天降血栓通丸组给予天降血栓通丸浓缩液灌胃，胞磷胆碱组给予胞磷胆碱片灌胃，每组均干预3 d，采用改良神经功能缺损评分评估大鼠神经功能缺损情况，测量大鼠脑梗死面积，运用尼氏染色和TUNEL染色检测神经细胞损伤程度及凋亡率，利用生物发光法检测大鼠脑组织ATP含量，酶化学法检测Na⁺-K⁺-ATP酶活性、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性，荧光探针法检测ROS水平。 结果 与模型组比较，天降血栓通丸组与胞磷胆碱组神经功能缺损评分、脑梗死面积均得到有效改善（P＜0.05，P＜0.01）；天降血栓通丸组脑皮质神经细胞尼氏体数量增加，神经细胞凋亡率降低（P＜0.01）；模型组脑组织中ATP含量显著下降，而ROS含量显著上升，天降血栓通丸组脑组织中ATP含量增加，ROS水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，天降血栓通丸组及胞磷胆碱组脑组织中Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性、Na⁺-K⁺-ATP酶活性均显著提升（P＜0.01）。 结论 天降血栓通丸可有效调节MCAO/R模型大鼠脑线粒体能量代谢并发挥脑保护作用。

Abstract

Objective To observe the neuroprotective effect of Tianjiang Xueshuantong pills on rats with cerebral ischemia– reperfusion injury and their impact on mitochondrial energy metabolism. Methods 30 Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham-operation group, the model group, the Tianjiang Xueshuantong pill group, and the citicoline group. The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established using the intraluminal filament method. The sham-operation group and the model group received intragastric administration of normal saline daily, while the Tianjiang Xueshuantong pill group was given concentrated Tianjiang Xueshuantong pill solution by gavage, and the citicoline group received citicoline tablets by gavage. All groups were treated for three consecutive days. Modified neurological deficit score was used to assess neurological deficit in rats. Cerebral infarct volume was measured. Nissl staining and TUNEL staining were used to detect the degree of neuronal damage and apoptosis rate. ATP content in rat brain tissue was detected using the bioluminescence assay. Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase activities were determined by enzymatic colorimetric methods, and ROS levels were detected using fluorescent probes method. Results Compared with the model group, the Tianjiang Xueshuantong pill group and the citicoline group showed effective improvement in neurological deficit scores and cerebral infarct volume (P<0.05, P<0.01). The number of Nissl bodies in cortical neurons increased and the apoptosis rate of neurons decreased in the Tianjiang Xueshuantong pill group (P<0.01). In the model group, ATP content in brain tissue decreased significantly, while ROS levels increased markedly; After intervention, the Tianjiang Xueshuantong pill group showed increased ATP content and decreased ROS levels in brain tissue (P<0.05, P<0.01). Compared with the model group, both the Tianjiang Xueshuantong pill group and the citicoline group showed significant increases in Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase activity and Na⁺-K⁺-ATPase activity in brain tissue (P<0.01). Conclusion Tianjiang Xueshuantong pills can effectively regulate mitochondrial energy metabolism and exert neuroprotective effects in MCAO/R model rats.

Graphical abstract

关键词

天降血栓通丸 / 脑缺血再灌注损伤 / 神经保护 / ATP酶活性

Key words

Tianjiang Xueshuantong pills / cerebral ischemia–reperfusion injury / neuroprotection / ATPase activity

缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，是威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。及时恢复血流灌注是当前最有效的治疗策略，然而血供的恢复本身可能引发脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI），这一矛盾现象极大地限制了再灌注治疗的临床获益。研究^[1]表明，线粒体功能障碍是脑缺血再灌注诱导神经元死亡的关键环节之一，保护线粒体能量代谢是改善CIRI的核心机制。因此，探索减轻CIRI对脑线粒体能量代谢影响的新策略，有效挽救更多的神经元细胞具有重要临床价值。

天降血栓通丸是本院院内制剂，前期临床研究证实，该药在改善急性缺血性脑卒中患者神经功能缺损及日常生活能力方面具有良好疗效^[2-4]，并能通过调节血脂、抑制炎症反应等途径发挥保护血管内皮功能的作用^[5-6]。课题组预实验结果表明，天降血栓通丸能有效减少脑缺血模型大鼠的神经元细胞变性坏死。基于此，本研究旨在进一步探讨天降血栓通丸对大脑中动脉闭塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠线粒体能量代谢的影响及其潜在脑保护机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

7～8周龄清洁及健康SD雄性大鼠30只，体质量（230±10）g，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供（实验动物合格证号：110324251107058147）。饲养于SPF级动物房[使用许可证：SYXK（津）2024-0016]，环境温度20～26℃，湿度40%～70%，12 h光照循环，给予标准饲料及灭菌洁净水，每日更换垫料。本研究通过了天津新瑞生物科技有限公司实验动物伦理委员会审核（审批号：2025026）。

1.2 实验药品与试剂

天降血栓通丸（本院制剂，每丸6 g，批号：Z2010938），胞磷胆碱钠片（华润双鹤，每片0.1 g，批号：H20080745）。ATP检测试剂盒（碧云天，S0026），Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性检测试剂盒（索莱宝，BC0960），Na⁺-K⁺-ATP酶活性检测试剂盒（索莱宝，BC0065），活性氧检测试剂盒（碧云天，S0033S）。

1.3 实验仪器

多功能酶标仪（Tecan，InfiniteM200），组织脱水机（武汉俊杰，JT-12J），组织包埋机（武汉俊杰，JB-18），病理切片机（Leica，RW2945），电子显微镜（OLYMPUS，DP26）。

2 实验方法

2.1 模型建立

将30只大鼠随机分为：假手术组（6只）、造模组（24只），运用线栓法建立MCAO/R模型，使用Zea-Longa's评分法来判定造模是否成功（1～3分为造模成功）。假手术组不插入线栓阻断脑血供，其余操作同造模组。

2.2 分组与给药

将成功造模的24只大鼠随机分为：模型组、天降血栓通丸组、胞磷胆碱组，各8只。天降血栓通丸组根据人类和大鼠用药比例换算（结果与预实验相符），给予1.2 g·kg^-1·d^-1天降血栓通丸浓缩液灌胃，胞磷胆碱组根据人类和大鼠用药比例换算，给予0.062 5 g·kg^-1·d^-1胞磷胆碱钠片灌胃，各组药物均采用0.9%氯化钠溶液制备，假手术组和模型组仅给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，每日1次，灌胃3 d。

2.3 检测指标

2.3.1 神经功能评分

运用改良神经功能缺损评分法评估各组干预前后的神经功能缺损情况。

2.3.2 脑梗死面积测定

大鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，迅速断头取出全脑。将脑组织置于-20℃冰箱冷冻30 min，随后用脑切片模具沿冠状面连续切割成5片2 mm厚组织切片。将切片浸入TTC染液，于37℃恒温箱中避光染色15 min，后用PBS溶液终止染色。染色完毕的切片移至10%中性福尔马林液中固定，待组织硬化后取出，按顺序晾干并排列，最终使用相机进行图像采集。应用Image J软件计算脑梗死面积百分率。脑梗死面积百分率=白色脑梗死面积/红色正常全脑总面积×100%。

2.3.3 脑组织病理学观察

将新鲜脑组织固定、脱水、包埋、切片，制备成厚度约5 μm的石蜡切片备用。1）取出切片脱蜡，按照尼氏染色法进行染色后，使用光学显微镜对皮质神经细胞的形态进行观察并采集图像，判断细胞损伤程度，运用Image J软件对尼氏体数量进行定量统计。2）取出切片脱蜡、水化，按照TUNEL染色法进行染色，用光学显微镜拍照，采用Image J软件分析计算细胞凋亡率，取均值。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

2.3.4 脑组织ATP、ROS含量及ATP酶活性检测

脑组织样品（200 mg）经裂解液超声匀浆后，通过差速离心法分离线粒体。首先在4℃以2 000 r·min^-1离心5 min，取上清后，再于4℃以12 000 r·min^-离心15 min，沉淀即为线粒体。ATP含量采用比色法测定，Na⁺-K⁺-ATP酶与Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性通过酶化学法检测，具体步骤均遵循试剂盒说明书。ROS水平的测定：取190 μL上清液加入96孔板，与10 μL DCFH-DA探针于37℃共同孵育30 min，随后使用酶标仪在488 nm激发光和525 nm发射光下检测荧光强度，并据此计算相对ROS含量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 25.0进行数据分析，结果以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，经检验，所有数据资料均符合正态分布，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠神经功能评分的影响

见表1。

3.2 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠脑梗死面积的影响

TTC染色后，大鼠脑切片非梗死区呈红色，梗死区呈白色。与假手术组比较，模型组脑切片梗死面积明显增大（P＜0.01）；与模型组比较，天降血栓通丸组和胞磷胆碱组脑切片梗死面积均有所减小（P＜0.05）。见图1。

3.3 天降血栓通丸对MCAO/R脑组织神经细胞的影响

尼氏染色结果显示，假手术组大鼠脑皮质神经元形态结构完整，尼氏体丰富，未见明显病理变化；与之相比，模型组皮质神经元的尼氏体数量显著减少（P＜0.01），并出现空泡样变性及核固缩等病理改变。经药物干预后，天降血栓通丸组与胞磷胆碱组的神经元尼氏体数量均较模型组显著增加（P＜0.01），细胞损伤程度减轻。组间比较表明，在增加尼氏体数量方面，天降血栓通丸组的效果优于胞磷胆碱组（P＜0.01）。见图2。

3.4 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠脑组织神经细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果表明，模型组脑神经细胞凋亡率较假手术组显著增加（P＜0.01）。天降血栓通丸与胞磷胆碱治疗均能显著抑制凋亡过程（与模型组比，均P＜0.01）。组间比较显示，天降血栓通丸降低凋亡率的效果优于胞磷胆碱（P＜0.01）。见图3。

3.5 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠脑组织ATP含量和ATP酶活性的影响

3.5.1 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠脑组织ATP含量的影响

与假手术组相比，模型组ATP水平显著下降（P＜0.01）。经药物干预后，天降血栓通丸组与胞磷胆碱组均能有效提升脑内ATP含量，与模型组比较差异显著（P＜0.01）。组间比较进一步表明，天降血栓通丸在促进ATP生成方面效果优于胞磷胆碱（P＜0.01）。见图4。

3.5.2 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠脑组织ATP酶活性的影响

模型组的Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶与Na⁺-K⁺-ATP酶活性，较假手术组均呈现明显下降（P＜0.01）；天降血栓通丸与胞磷胆碱干预后，两种酶的活性较模型组均得到显著提升（P＜0.01），两种给药方案在提升酶活性方面的效果相当，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

3.6 天降血栓通丸对MCAO/R大鼠脑组织ROS的影响

模型组脑内ROS含量显著升高，呈现过量积聚状态（P＜0.01）。干预后天降血栓通丸组与胞磷胆碱组均能有效降低ROS水平，与模型组相比差异显著（P＜0.05）。天降血栓通丸在清除ROS方面的效果优于胞磷胆碱（P＜0.05）。见图6。

4 讨论

本研究运用天降血栓通丸对MCAO/R模型大鼠进行干预，研究结果表明，天降血栓通丸能显著改善MCAO/R模型大鼠的神经功能缺损评分、减小脑梗死体积、增加皮质神经元尼氏体数量并降低细胞凋亡率，证实了其明确的神经保护作用。更为重要的是，本研究从能量代谢角度揭示了其部分作用机制：天降血栓通丸能有效提升脑组织ATP含量，增强Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的活性，并显著抑制ROS的过度生成。

脑组织能量代谢紊乱被认为是缺血性脑卒中的始动环节^[7]，线粒体功能异常，供能障碍是关键因素，可直接引起神经元死亡^[8]。CIRI可导致线粒体功能严重障碍，其核心表现为ATP生成急剧减少，继而引发依赖ATP的酶活性降低与离子泵功能障碍，细胞膜因此发生去极化，这一系列变化最终致使细胞能量耗竭、代谢网络紊乱及病理产物蓄积^[9]；同时，血供的突然恢复会造成胞内ROS爆发性产生，加剧细胞氧化应激和炎性反应^[10]，从而触发级联反应，导致神经元细胞死亡。

Na⁺-K⁺-ATP酶与Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶是广泛存在于生物膜上的关键酶，对于维持细胞内外离子动态平衡及能量代谢稳态至关重要。在CIRI过程中，神经元内ATP水平下降，致使这两种酶的生理功能难以维系，依赖ATP的离子泵活动因此受阻，无法将胞内过多的Na⁺和Ca²⁺主动转运至细胞外，造成Na⁺、Ca²⁺潴留，使细胞内渗透压升高，引发细胞毒性水肿，最终破坏神经细胞。能量代谢障碍、氧化应激反应、胞内离子失衡均参与到CIRI过程中，可激活凋亡、程序性死亡、自噬等多种细胞死亡途径^[11]。本研究中，模型大鼠表现出典型的ATP耗竭、ATP酶活性下降及ROS升高，而天降血栓通丸干预后上述指标均得到显著逆转，提示其保护作用与改善线粒体能量代谢和减轻氧化应激密切相关。

天降血栓通丸由中介蝮蛇、地龙、人参、黄芪、丹参、赤芍、川芎、山楂、水蛭、葛根、降香、天麻、石菖蒲、安息香组成，以上药物蜜制成丸，其中中介蝮蛇能袪风通络，具有降解纤维蛋白的作用^[12]；地龙、川芎、丹参、山楂能通经活络、行气、活血化瘀，具有抗凝、抗炎、促进神经再生的作用^[13-15]；人参、黄芪可大补元气，具有促进脑损伤修复、保护线粒体、抑制细胞凋亡、抗氧化损伤的作用^[16-17]；水蛭能通经破血、逐瘀消癥，具有抗凝作用^[18]；赤芍清热凉血、散瘀止痛，具有抑制神经元细胞凋亡的作用^[19]；天麻、石菖蒲、降香、安息香能够理气活血，诸药合用，可发挥益气活血、化瘀通络的功效。全方可能通过多成分、多靶点的协同作用，共同促进了缺血后脑组织能量代谢的恢复，维持了细胞内离子稳态，并抑制了氧化应激诱导的细胞凋亡，从而发挥综合性的脑保护效应。

综上所述，本研究证实天降血栓通丸可通过调节线粒体能量代谢、缓解氧化应激及抑制细胞凋亡等多途径，对CIRI发挥保护作用。这为天降血栓通丸的临床应用提供了坚实的实验依据。其作用的具体分子机制，如对线粒体动力学、生物合成及相关信号通路的调控，仍有待于后续深入研究，从而为缺血性脑卒中的治疗策略提供新的理论视角与靶点。

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基金资助

天津市教委科研计划项目(2024KJ051)

天津市北辰区科技计划项目(SHGY-2023015)