酒丹参配方颗粒与标准汤剂成分分析及药效学差异研究

Comparative Analysis of Components and Pharmacodynamics between Jiudanshen Formula Granules and Standard Decoction

摘要

目的 对比分析酒丹参配方颗粒与标准汤剂的主要化学成分，并系统评价两者在脑缺血再灌注损伤模型中的神经保护作用及药效学差异。 方法 采用超高效液相色谱-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术鉴定酒丹参配方颗粒与标准汤剂的化学成分。建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型，随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、酒丹参配方颗粒低/高剂量组、酒丹参标准汤剂低/高剂量组（n = 14）。连续灌胃给药7 d后，通过神经功能评分、脑梗死体积（TTC染色）、脑组织病理形态（HE染色）以及超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平进行药效学评价。 结果 酒丹参配方颗粒与标准汤剂均含有丹参酮IIA、丹酚酸B等核心药效成分，化学成分组成基本一致。在MCAO/R模型小鼠中，两种制剂均能显著改善神经功能缺损、减轻脑梗死体积、缓解脑组织病理损伤，并有效提高SOD活性和GSH含量、降低MDA含量（P＜0.05）。同等剂量下，两者的各项药效学指标均无统计学差异（P＞0.05）。 结论 酒丹参配方颗粒与标准汤剂在化学物质基础上高度相似，在脑缺血再灌注损伤模型中表现出相近的神经保护作用，提示二者药效学等效性，为酒丹参配方颗粒的临床标准化应用提供了实验依据。

Abstract

Objective To compare and analyze the main chemical components of Jiudanshen formula granules and standard decoction, and systematically evaluate their neuroprotective effects and pharmacodynamic differences in cerebral ischemia-reperfusion injury model. Methods UPLC-Q-TOF-MS/MS was used to identify the chemical constituents of Jiudanshen formula granules and standard decoction. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) mouse model was established and randomly divided into sham operation group, model group, positive drug group, low/high dose group of Danshen formula granules and low/high dose group of Danshen standard decoction (n=14). After 7 days of continuous gavage, the pharmacodynamics were evaluated by neurological function score, cerebral infarction volume (TTC staining), pathological morphology of brain tissue (HE staining) and oxidative stress indexes (SOD, GSH, MDA). Results Both Jiudanshen formula granules and standard decoction contain core effective components such as tanshinone ⅡA and salvianolic acid b, and their chemical composition is highly consistent. In MCAO/R model mice, both preparations can significantly improve the neurological deficit, reduce the volume of cerebral infarction, alleviate the pathological damage of brain tissue, effectively increase the activities of SOD and GSH, and reduce the content of MDA (P<0.05). At the same dose, there was no statistical difference in each pharmacodynamic index between them (P>0.05). Conclusion Jiudanshen Formula Granules are highly similar to the standard decoction on the basis of chemical substances, showing similar neuroprotective effect in the model of cerebral ischemia-reperfusion injury, and its pharmacodynamic equivalence has been confirmed, which provides experimental basis for the clinical standardized application of Jiudanshen Formula Granule.

Graphical abstract

关键词

酒丹参 / 配方颗粒 / 传统汤剂 / 缺血性脑卒中 / 超高效液相色谱-飞行时间串联质谱

Key words

Jiudanshen / formula granules / traditional decoction / ischemic stroke / ultra-performance liquid chromatography-quadrupole

脑卒中俗称“中风”，具有高发病率、高病残率和高病死率的特点，是全球残疾的第三大原因、死亡的第二大原因^[1-2]。缺血性脑卒中是由大脑局部血流中断所致，其病理机制复杂，涉及能量代谢障碍、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡等多个环节，临床缺乏特效治疗药物^[3]。丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）作为活血化瘀的核心药物，广泛应用于心脑血管疾病治疗，其酒炙品“酒丹参”传统认为可增强活血通络之功，首载于《本草经集注》，为中医临床常用炮制规格^[4]。

随着中药现代化进程，中药配方颗粒因便于携带、服用及标准化生产等优点，已成为传统汤剂的重要补充形式。酒丹参配方颗粒是以标准炮制饮片为原料，经现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成。然而，其经现代工艺制成后，化学成分与药效是否与传统水煎标准汤剂等效，是关乎临床疗效的核心问题，亦是当前研究的热点与难点^[5-8]。文献研究^[9]虽证实酒丹参在心脑血管疾病中的药理活性，但其配方颗粒与标准汤剂在化学成分上的系统性对比研究尚显不足，二者在脑缺血损伤模型中的药效等效性亦有待确证。因此，本研究拟采用超高效液相色谱-飞行时间串联质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，系统分析酒丹参配方颗粒与标准汤剂的化学成分；结合大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）小鼠模型，从行为学、脑梗死体积、组织病理及氧化应激等多维度综合评价两者的体内神经保护作用，为酒丹参配方颗粒的临床应用与质量标准制定提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性昆明小鼠（KM）98只，体质量（25±3）g，由广东实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2019-0202。动物饲养于广州中医药大学SPF级动物房，室内温度（23±2）℃、相对湿度（55±5）%，自由饮食饮水。实验方案经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：ZYD-2023-205），所有操作均遵循实验动物福利伦理审查指南。

1.2 药品与试剂

酒丹参配方颗粒、酒丹参饮片（一方颗粒制剂科技有限公司，A2065222、A2023041）；尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司，H14022821）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）试剂（北京索莱宝科技有限公司，G3005）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，S0101M）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，S0131S）；谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，S0053）；戊巴比妥钠（广州中医药大学药理教研室提供，20230216）；多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，80096628）；乙腈、甲醇为色谱纯（美国赛默飞世尔科技公司，A955-4）。

1.3 实验仪器

超高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司，UltiMate 3000）；高分辨质谱仪（美国SCIEX公司，Triple TOF 6600+）；激光散斑血流成像系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，RFLSI III）；病理切片机（德国徕卡公司，RM2016）；多功能真彩病理图像分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司，CMIAS-98A）；酶标仪（美国珀金埃尔默公司，EnVision 2105）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex XB-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～6 min，5% B；6～16 min，5%→95% B；16～20 min，95% B；20～34 min，95%→5% B；34～38 min，5% B）；流速：0.4 mL·min^-1；柱温：35℃；进样量：1 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式分别扫描；离子源温度：550℃；离子喷雾电压：±4.5 kV；气帘气：35 psi；雾化气与辅助气均为高纯氮气；去簇电压：80 V；碰撞能量：35±15 eV；质谱扫描范围：m/z 50-1500。

2.3 样品溶液制备

精密称取酒丹参配方颗粒粉末1.0 g及酒丹参饮片粉末2.5 g，分别置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率600 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 数据处理

采用SCIEX Analyst TF 1.7软件采集数据，通过PeakView 2.2软件及SCIEX自建中药成分数据库（含12 000余个化合物），结合PubChem、HMDB等公共数据库，根据精确分子量（质量偏差＜5 ppm）及二级碎片离子信息进行化合物鉴定。

2.5 酒丹参标准汤剂的制备

取酒丹参饮片，参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》制备标准汤剂。精密称定酒丹参饮片2.5 g，加10倍量蒸馏水浸泡30 min，加热回流提取30 min，过滤；药渣再加8倍量水，继续回流提取20 min，合并两次滤液，浓缩，定容至25 mL，即得酒丹参标准汤剂（每1 mL相当于0.1 g生药），备用。

2.6 分组与给药

将98只小鼠适应性喂养1周后，随机分为7组（n=14）：假手术组、模型组、尼莫地平组（尼莫地平为临床治疗缺血性脑卒中的常用钙通道阻滞剂^[10]）、酒丹参配方颗粒低剂量组（Jiu Danshen dispensing granule low-dose，JDSDG-L）、酒丹参配方颗粒高剂量组（Jiu Danshen dispensing granule high-dose，JDSDG-H）、酒丹参标准汤剂低剂量组（Jiu Danshen standardized decoction low-dose，JDSSD-L）及酒丹参标准汤剂高剂量组（Jiu Danshen standardized decoction high-dose，JDSSD-H）。

各给药组于造模再灌注24 h后开始灌胃给药，每日1次，连续7 d。假手术组与模型组灌胃等体积蒸馏水（7.5 mL·kg^-1·d^-1）。尼莫地平组灌胃尼莫地平20 mg·kg^-1·d^-1。酒丹参配方颗粒低/高剂量组（JDSDG-L/H）分别灌胃酒丹参配方颗粒溶液0.5、1.5 g·kg^-1·d^-1（剂量以生药量计，颗粒已按得率折算为等效生药剂量）。酒丹参标准汤剂低/高剂量组（JDSSD-L/H）分别灌胃酒丹参标准汤剂0.5、1.5 g·kg^-1·d^-1（以生药量计）。

2.7 MCAO/R模型建立

采用改良线栓法建立小鼠MCAO/R。小鼠用2%戊巴比妥钠（40 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。结扎ECA和CCA近心端，用动脉夹暂时夹闭ICA，在CCA距分叉处约3 mm剪一“V”形小口，将直径0.22 mm的硅胶涂层线栓插入ICA，进栓深度约（10±0.5）mm至大脑中动脉起始部，遇轻微阻力后停止，结扎固定。栓塞1 h后，轻轻拔出线栓以实现再灌注。假手术组仅分离血管，不插入线栓。术后保温至苏醒。造模成功后，依据Zea-Longa 5分制评分法^[11]进行神经功能缺损评分，1～3分者纳入实验。

2.8 激光散斑血流成像观察

于术前、线栓阻塞即刻及再灌注1 h后，采用激光散斑血流成像系统监测小鼠大脑皮层血流动态变化。以缺血侧脑血流灌注量下降≥80%作为模型成功的血流动力学标准^[12]。

2.9 神经功能评分与体质量检测

于造模后24 h（给药前）及末次给药后，对所有小鼠进行Zea-Longa神经功能评分，并记录体质量。

2.10 TTC染色测定脑梗死体积

末次给药后，每组随机取6只小鼠，脱颈处死，迅速取脑，于-20℃速冻15 min。从额极向后连续制作5片2 mm厚冠状脑切片，置于2% TTC溶液^[13]中，37℃避光孵育15 min。4%多聚甲醛固定后拍照。采用Image J软件分析，梗死区域呈白色，正常脑组织呈红色。计算脑梗死体积百分比：梗死体积百分比=（右侧梗死区面积/全脑切片总面积）×100%。

2.11 HE染色观察脑组织病理形态

取经4%多聚甲醛固定后的脑组织，常规石蜡包埋，切片（厚度5 μm），进行苏木精-伊红（HE）染色，于光学显微镜下观察缺血侧海马CA1区神经元的形态结构变化。

2.12 氧化应激指标检测

末次给药后，每组取6只小鼠，取缺血侧脑组织，制备10%组织匀浆，严格按照试剂盒说明书操作，检测脑组织中SOD活性、MDA及GSH含量。

2.13 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较若方差齐采用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett's T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 酒丹参配方颗粒与标准汤剂之间的化学成分比较

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对酒丹参配方颗粒（JDSDG）与标准汤剂（JDSSD）进行全扫描分析，通过高精度质谱数据与数据库比对，从酒丹参配方颗粒中鉴定出27个化学成分，包括酚酸类8个（如迷迭香酸、丹酚酸B）、二萜类15个（如丹参酮IIA、隐丹参酮）及黄酮类等其他成分。从酒丹参标准汤剂中鉴定出36个化学成分，包括酚酸类11个、二萜类20个等。两者均含有丹参酮IIA、丹酚酸B等核心药效成分，化学成分组成基本一致。见表1。

3.2 激光散斑血流成像评价MCAO/R小鼠模型

结果显示，假手术组小鼠双侧大脑皮层血流对称分布。模型组小鼠插入线栓阻塞大脑中动脉后，缺血侧脑区血流信号较术前基线值显著下降（下降幅度＞80%），且对侧脑区出现代偿性血流增加。再灌注60 min后，缺血区血流部分恢复，约为基线值的70%，但残留明显低灌注区域，表明MCAO/R模型建立成功且稳定。见图1。

3.3 酒丹参配方颗粒与标准汤剂对MCAO/R模型小鼠神经功能的影响

见表2。

3.4 酒丹参配方颗粒与标准汤剂对MCAO/R模型小鼠脑梗死体积的影响

见图2。

3.5 酒丹参配方颗粒与标准汤剂对MCAO/R模型小鼠脑组织病理形态的影响

HE染色结果显示，假手术组小鼠海马CA1区神经元结构完整，细胞排列紧密有序、形态规则，胞核清晰可见，未见明显病理损伤；模型组小鼠海马CA1区神经元排列稀疏、结构紊乱，细胞体积明显缩小，出现核固缩、深染现象，间质水肿显著，可见大量空泡样改变，提示脑组织出现严重的缺血性病理损伤。与模型组相比，尼莫地平组、酒丹参配方颗粒高剂量组与酒丹参标准汤剂高剂量组小鼠海马CA1区神经元病理损伤均明显减轻，细胞排列趋于整齐，核固缩、空泡样改变及间质水肿情况显著缓解；酒丹参配方颗粒低剂量组与酒丹参标准汤剂低剂量组神经元的缺血性病理损伤也有一定改善，但改善效果弱于同制剂的高剂量组。同等给药剂量下，酒丹参配方颗粒与标准汤剂对小鼠缺血后脑组织病理形态的改善程度相近，无明显差异。见图3。

3.6 酒丹参配方颗粒与标准汤剂对MCAO/R模型小鼠脑组织氧化应激指标的影响

见图4。

4 讨论

脑卒中是目前造成人类死亡与致残的主要原因之一，酒丹参为活血化瘀的常用中药，在临床广泛应用于心脑血管疾病防治^[14-15]。JDSDG作为传统JDSSD的现代化制剂，二者化学成分与体内药效是否一致，是评价其临床价值的关键问题^[16]。本研究通过整合UPLC-Q-TOF-MS/MS化学成分分析与MCAO/R模型药效评价，系统对比酒丹参配方颗粒与酒丹参标准汤剂的物质基础，并验证二者具有相近的神经保护作用。

本研究化学成分结果显示，UPLC-Q-TOF-MS/MS分析表明，JDSDG与JDSSD均含有丹参酮IIA、隐丹参酮、丹酚酸B等《中国药典》规定的质控成分及多种酚酸类与二萜类化合物^[17]。尽管JDSSD检出的成分总量多于JDSDG，差异都集中于水溶性酚酸及其异构体上，推测可能与配方颗粒制备过程中的高温干燥等环节有关^[18]。核心的二萜醌类成分在配方颗粒中得到了保留，说明现代制备工艺在稳定核心脂溶性活性成分方面具有可靠性^[19]。整体药效学结果表明，酒丹参配方颗粒与传统标准汤剂可明显改善脑缺血再灌注损伤。MCAO/R模型是模拟缺血性脑卒中的经典模型，结合激光散斑血流成像技术进行实时监测，结果显示模型小鼠缺血侧脑血流显著下降，再灌注后部分恢复。本研究从多方面进行验证，结果提示，JDSDG与JDSSD在同等生药剂量下，均能显著改善小鼠神经功能缺损，减小脑梗死体积，减轻脑组织病理损伤。这些结果与前期关于酒丹参改善脑循环、保护神经元的研究结论相吻合^[20-21]。且在所有评价指标上，JDSDG与JDSSD均未表现出统计学差异，提示二者整体药效等效。

氧化应激调控失衡可能是其发挥神经保护效应的核心环节。脑缺血再灌注损伤过程中，能量代谢崩溃与氧化应激爆发是导致神经元死亡的关键通路。在缺氧缺糖的短时间内，线粒体功能障碍导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，引发脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。本研究结果表明，模型组小鼠脑内SOD活性与GSH含量显著降低，而脂质过氧化终产物MDA含量急剧升高。经JDSDG与JDSSD干预后，两者均能显著逆转这一趋势，有效提升内源性抗氧化酶SOD的活力及抗氧化物质GSH的水平，同时降低MDA含量。酒丹参中的丹酚酸B已被证实是强大的天然抗氧化剂，其作用强度优于维生素C和维生素E，它不仅能直接清除自由基，还能通过激活核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件（nuclear factor erythroid 2-related factor 2/Antioxidant response element，Nrf2/ARE）信号通路上调多种抗氧化酶的表达^[22]。另一方面，丹参酮IIA则被证明可通过抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的活性，从源头上减少ROS的生成，并同时减轻由此触发的炎症反应^[23]。因此，本研究推测酒丹参配方颗粒与标准汤剂通过其共有的多酚酸类和二萜醌类成分，多靶点协同调控氧化应激相关信号通路，抑制脑缺血再灌注后的氧化应激损伤，从而发挥神经保护作用。

综上所述，酒丹参配方颗粒在保留标准汤剂核心药效成分的基础上，在整体动物模型上展现出与之等效的神经保护作用，其机制与增强机体抗氧化防御能力、缓解氧化应激损伤密切相关。本研究从“化学成分-体内药效”关联的角度，为酒丹参配方颗粒的临床推广应用提供了科学依据。

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基金资助

广东省基础与应用基础研究项目(2022A1515220078)