电针四关穴对CUMS大鼠前额叶谷氨酸能神经元的调控机制研究

Study on the regulatory mechanism of electroacupuncture at Siguan points on glutamatergic neurons in the prefrontal cortex of chronic unpredictable mild stress rats

摘要

目的 探讨电针四关穴对慢性温和不可预知应激（CUMS）抑郁大鼠前额叶皮层（PFC）谷氨酸能神经元的作用及相关机制。 方法 采用CUMS联合孤养建立大鼠抑郁模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性药组（东莨菪碱）及电针组，另设正常组。模型组腹腔注射生理盐水，阳性药组腹腔注射东莨菪碱，电针组取四关穴予以电针干预，持续干预14 d。干预结束后，采用行为学实验评价大鼠抑郁样行为；检测PFC谷氨酸（Glu）含量；观察神经元树突棘形态，检测PFC内GluN2A、脑源性神经营养因子（BDNF）、雷帕霉素靶蛋白C1（mTORC1）、PSD95蛋白表达水平。 结果 与正常组比较，模型组大鼠体质量、糖水偏好率降低，新环境抑制进食实验（NSFT）进食潜伏期、悬尾实验（TST）及强迫游泳实验（FST）不动时间均显著延长（P＜0.05）。干预后，与模型组比较，电针组各行为学指标均明显改善（P＜0.05）；前额叶皮层内Glu含量显著升高（P＜0.001）；第V层锥体神经元顶树突棘密度及蘑菇型树突棘比例显著增加（P＜0.001）；GluN2A、BDNF、mTORC1及PSD95蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。 结论 电针四关穴可改善CUMS大鼠抑郁样行为，其机制可能与调节PFC谷氨酸水平、促进树突棘成熟、激活BDNF/mTORC1信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of electroacupuncture at the Four Gates ( LI4 and LR3) on prefrontal cortex (PFC) glutamatergic neurons in rats with chronic unpredictable mild stress (CUMS)-induced depression and its related mechanisms. Methods A rat model of depression was established by CUMS combined with solitary housing. Successfully modeled rats were randomly divided into the model group, the positive drug group (scopolamine), and the electroacupuncture group, with an additional normal group also established. The model group received intraperitoneal injection of normal saline, the positive drug group received intraperitoneal injection of scopolamine, and the electroacupuncture group received electroacupuncture intervention at the Four Gates for 14 days. After the intervention, behavioral tests were performed to evaluate depressive-like behaviors; Glutamate (Glu) content in the PFC was measured, neuronal dendritic spine morphology was observed, and the protein expression levels of GluN2A, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), mammalian target of rapamycin (mTORC1）, and PSD95 in the PFC were detected. Results Compared with the normal group, the model group showed decreased body weight and sucrose preference rate, prolonged feeding latency in the novelty-suppressed feeding test (NSFT), and increased immobility time in the tail suspension test (TST) and forced swimming test (FST) (P<0.05). After intervention, compared with the model group, the electroacupuncture group showed significant improvement in all behavioral indices (P<0.05), significantly increased Glu content in the PFC (P<0.001), significantly increased apical dendritic spine density and the proportion of mushroom-type dendritic spines in layer V pyramidal neurons (P<0.001), and significantly elevated protein expression levels of GluN2A, BDNF, mTORC1, and PSD95 (P<0.05). Conclusion Electroacupuncture at the Four Gates can ameliorate depressive-like behaviors in CUMS rats. And its mechanism may be related to the regulation of glutamate levels in the PFC, promotion of dendritic spine maturation, and activation of the BDNF/mTORC1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

抑郁 / 四关穴 / 谷氨酸能神经元 / 前额叶皮层 / BDNF/mTORC1信号通路

Key words

depression / the Four Gates / glutamatergic neurons / prefrontal cortex / brain-derived neurotrophic factor /mammalian target of rapamycin signaling pathway

抑郁症是一种常见的精神障碍，其核心特征包括持续的情绪低落、兴趣或愉悦感丧失、认知功能受损等，对患者的社会功能、工作能力和生活质量均有显著影响^[1]。抑郁症患者自杀率及自残风险较高，尤其在青少年群体中更为突出^[2]。目前临床常用的抗抑郁药物存在缓解率低、起效慢等局限，仅约半数患者可达完全缓解^[3]，且远期治疗疗效呈逐步下降趋势^[4]。

电针作为针灸与电刺激相结合的方法，其抗抑郁疗效与药物相当^[5]。电针可以显著改善抑郁症相关症状，同时减少药物所致的毒副作用^[6]。其抗抑郁作用机制涉及调节神经肽与神经递质^[7]、恢复海马突触可塑性^[8]，以及预防星形胶质细胞萎缩^[9]等多个环节。电针四关穴的相关研究已日趋成熟，单用该法可通过上调海马脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表达，显著改善卒中后抑郁大鼠行为学指标^[10]；联合药物治疗中重度抑郁症患者，可显著改善抑郁症状并减少不良反应^[11]。本课题组在长期临床实践中确立了“疏肝调神”电针治疗方案，运用以四关穴（太冲、合谷）为主的特色疗法干预抑郁，疗效显著。在理论层面，该方案突破传统单一从“疏肝”论治抑郁的局限认知，强调脑与肝在抑郁发病过程中的关键作用，明确其发病机理为“脑神失和，肝失疏泄”^[12]。

前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）位于多模态感觉网络的交汇处，主要负责调节情绪和记忆功能^[13]。PFC连接的完整性及其所在回路功能连通性的改变，与内隐情绪调节及奖赏反应（抑郁的重要成因）的变化密切相关^[14]。抑郁患者面对负性情绪刺激时，杏仁核等脑区静息态活动增强^[15]，且PFC突触减少程度与抑郁病程及严重程度呈正相关^[16]。动物实验^[17-18]表明，抑郁会引发PFC、海马区神经元及胶质细胞萎缩，而针刺能够保护慢性温和不可预知应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠PFC和海马内神经细胞与胶质细胞的结构功能完整性，从而改善大鼠抑郁状态^[19]。针刺还可提升海马突触间隙谷氨酸转运效率，提高突触蛋白表达水平，促进齿状回神经细胞增殖与分化^[20]。PFC谷氨酸能神经元的功能异常与抑郁密切相关，其机制涉及抑制突触可塑性^[21]、降低神经元兴奋性^[22]及与γ-氨基丁酸能神经元的相互作用^[23]。本研究拟观察电针四关穴对CUMS抑郁模型大鼠PFC谷氨酸能神经元及BDNF/雷帕霉素靶蛋白C1（mammalian target of rapamycin C1，mTORC1）信号通路的影响，通过行为学及分子层面指标探索电针治疗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

55只SPF级SD大鼠，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006，饲养于天津津科博纳生物科技有限公司实验动物中心SPF级标准实验室，环境温度22～25℃、湿度50%～70%，12 h光暗循环，自由饮食饮水。本实验经动物实验伦理审查委员会审核批准（伦理编号：GENINK-20230050）。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 药物及试剂

东莨菪碱氢溴酸盐（上海麦克林生化科技有限公司，S860151，纯度＞99%）；RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂（R0020）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（P1200）、彩虹180广谱蛋白Marker（PR1910）均购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0011）、5×蛋白上样缓冲液（P0015L）、ECL Plus超敏发光液（P0018M）、脱脂奶粉（P0216-1500g）均购自上海碧云天生物技术有限公司；BDNF抗体（DF6387）、GluN2A抗体（DF7955）、mTOR抗体（AF6308）、PSD95抗体（AF5283）、羊抗兔IgG-HRP（S0001）、羊抗小鼠IgG-HRP（S0002）均购自美国Affinity Biosciences公司；高尔基染色固定液（G1069-15ML）、高尔基染液（G1069-1）、高尔基显影液（G1069-2）、组织处理液（G1069-3）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；纯净水（W6-4）、甲醇（A456-4）、乙腈（A955-4）、甲酸（A117-50）均购自美国Fisher Scientific公司。

1.2.2 仪器

华佗牌一次性针灸针（苏州华佗医疗器械有限公司，0.25 mm×13 mm）；电针仪（北京华卫产业开发有限公司，Hans-LH202H）；超高效液相色谱仪（美国沃特世公司，UPLC I-Class）；串联四极杆质谱仪（美国沃特世公司，XEVO TQ-S Micro）；震荡混匀器（杭州米欧仪器有限公司，Mix-3000）；台式高速冷冻离心机（赫蒂奇实验室技术公司，Mikro 220R）；电子天平（赛多利斯集团，BS-224S）；高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，KZ-5F-3D）；低温高速离心机（艾本德公司，5417R）；电泳仪（伯乐生命医学产品有限公司，PowerPac HC）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司，M5）；转膜仪（伯乐生命医学产品有限公司，Trans-Blot SD）；脱色摇床（其林贝尔仪器制造有限公司，TS-200）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司，Tanon 5200）。

1.3 造模方法

SD大鼠采用CUMS联合孤养方式单笼建立抑郁模型。孤养处理：造模期间，每笼1只饲养。CUMS：根据实验室条件，选取禁水、禁食、倾笼、夹尾、昼夜颠倒、冰水游泳、垫料浸湿等刺激方式^[24-25]。为防止大鼠对应激刺激产生耐受，确保模型稳定性，造模期间采用随机数字表法，每日随机施加一种刺激，同种刺激不连续使用，造模持续至行为学检测前。造模结束次日开展行为学检测，判断抑郁模型是否建立成功^[26]。模型成功标准：体质量增长减缓、糖水偏好率降低、新环境抑制进食实验（novelty-suppressed feeding test，NSFT）进食潜伏期延长、悬尾实验（tail suspension test，TST）及强迫游泳实验（forced swimming test，FST）不动时间延长。上述指标提示大鼠出现体质量增长减缓、快感缺失和行为绝望等抑郁样状态，则判定为造模成功。

1.4 干预方法

1.4.1 处理方法

适应性饲养7 d后，随机取10只大鼠设为正常组；其余45只大鼠采用CUMS联合孤养造模。造模第28天进行行为学评价，筛选造模成功大鼠30只，按随机数字表法分为模型组、阳性药组和电针组，每组10只。自第29天起，各组分别给予相应干预：正常组群居饲养（每笼5只），正常饮食饮水，实验期间仅给予同等量抓取与固定操作；模型组继续CUMS联合孤养，腹腔注射等量生理盐水，每48 h 1次；阳性药组持续CUMS联合孤养，腹腔注射东莨菪碱（25 μg·kg^-1），每48 h 1次；电针组持续CUMS联合孤养，针刺四关穴后连接Hans-LH202H电针仪干预20 min，参数为2/100 Hz、1～1.2 mA，每日1次。各组按上述方案连续干预14 d，干预结束后进行行为学实验，随后取材。除正常组外，其余各组干预期间持续给予CUMS联合孤养刺激至实验结束。

1.4.2 针刺方法

取双侧合谷、太冲穴进行针刺。各组大鼠每日采取相同抓取方式、相同时间固定。大鼠穴位定位参照《实验针灸学》^[27]，合谷、太冲用0.25 mm×13 mm毫针直刺，深度约2 mm；大鼠经异氟烷吸入麻醉后行针刺，针刺后行平补平泻行针，以大鼠无明显挣扎为度。针刺后将同侧穴位连接Hans-LH202H电针治疗仪，采用疏密波，参数为2/100 Hz，1～1.2 mA，刺激强度以大鼠肢体轻微颤动为准。每次干预20 min，每日1次，连续干预14 d。

1.5 行为学观察

1.5.1 糖水偏好实验

采用糖水偏好实验（sucrose preference test，SPT）检测大鼠快感缺失行为。检测前大鼠禁水24 h，每笼放置200 mL 1%蔗糖溶液及200 mL纯净水，1 h后调换两侧位置，继续检测1 h。糖水偏好率/%=糖水消耗量/液体总消耗量×100%。

1.5.2 新环境抑制进食实验

大鼠禁食18 h后，置于40 cm×40 cm×25 cm昏暗盒子中，盒中间放有食物，记录大鼠首次进食潜伏期。

1.5.3 悬尾实验

使用悬尾测定仪将大鼠尾端1 cm固定在仪器的挂钩上，挡板隔离视野。观察6 min，剔除前2 min，记录后4 min大鼠不动时间。

1.5.4 强迫游泳实验

大鼠提前适应性训练30 min，将大鼠放入高50 cm、直径20 cm玻璃缸中，水深35 cm，水温（25±2）℃，视频记录整个过程，记录大鼠漂浮不动时间。

1.6 大鼠PFC谷氨酸含量的检测

实验结束后取脑组织，分离PFC组织，称重后加入含蛋白酶抑制剂的缓冲液冰浴匀浆。匀浆液离心后取上清，加入乙腈沉淀蛋白，再次离心后取上清，采用HPLC-MS/MS法检测谷氨酸。

1.7 高尔基染色及形态学分析

大鼠麻醉后心脏灌注固定。全脑置于高尔基染液中避光浸染2～3周，制作50～100 μm厚的切片。于光学显微镜下定位PFC第V层区域，再换高倍镜观察顶树突棘形态数量、密度、长度、分支以及与其他神经元的连接等，评估神经元形态复杂程度。

1.8 Western Blot检测PFC皮质中相关蛋白表达

取PFC组织，加入含PMSF的RIPA裂解液匀浆，4℃裂解后离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白变性后行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜。封闭后依次孵育一抗、二抗，ECL化学发光法显色。并用Gelpro 32软件分析条带灰度值。检测GluN2A、BDNF、mTORC1及PSD95蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法

用SPSS 19.0软件分析数据。计量资料采用Shapiro-Wilk正态性检验，正态分布资料统计描述用均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐用LSD检测法；方差不齐用Dunnett's T3检测。非正态分布以中位数（四分位数间距）[M（P₂₅，P₇₅）]表示，采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 电针四关穴对CUMS大鼠体质量的影响

见图1。

2.2 电针四关穴对CUMS大鼠糖水偏好率、进食潜伏期及不动时间的影响

见图2。

2.3 电针四关穴对CUMS大鼠PFC谷氨酸含量的影响

见图3。

2.4 电针四关穴对CUMS大鼠PFC第V层锥体神经元树突棘形态及密度的影响

见图4、图5。

2.5 电针四关穴对CUMS大鼠PFC皮层相关蛋白表达的影响

见图6。

3 讨论

抑郁可归属于中医学“郁证”范畴，主要临床表现为情绪抑郁、思绪不宁、悲忧善哭、胸胁胀痛，以及咽中如有异物梗塞等^[28]。其病机可归结为肝失疏泄、脑神不调。《医碥·郁》提出：“百病皆生于郁，郁而不舒，则皆肝木之病矣”，强调郁是诸多病症的根源，而肝郁又是各类郁证的主导因素。肝气调畅、气血调和，则脑神清明、精神聪慧；若肝失疏泄，气机失调，气血运行不畅，可致脏腑功能紊乱，脑神失于内守，进而发为郁证，治以疏肝调神为法。本实验选取双侧合谷、太冲穴干预。合谷为手阳明大肠经原穴，《针灸大成·卷六》载其主治伤寒发热、面肿头痛等症，具疏风解表、行气活血之效。手阳明经与手太阴肺经相表里，肺主气、司呼吸，气血运行有赖肺气推动；阳明经多气多血，针刺合谷可激发经气，促进全身气血向头面部输注。太冲为足厥阴肝经原穴，既可疏肝理气以解郁行滞，又能协同调节营血。基于气血互根理论，气能行血、血能载气，二者配伍即为“四关穴”，可在调节气机运行基础上，辅以养血活血之法而平衡阴阳，共奏调达肝气、调和脏腑气血之功^[29]。现代研究^[30]表明，针刺合谷穴可调节头面部微循环，为PFC神经元提供代谢支持，间接促进谷氨酸（glutamate，Glu）合成与释放；针刺太冲穴可激活海马、颞中回等边缘脑区，从而缓解抑郁情绪^[31]。针刺合谷、太冲穴治疗郁证类精神系统疾病疗效确切^[32]。

CUMS模型是目前公认的抑郁造模方法，广泛应用于抗抑郁药物筛选与抑郁症机制研究^[33]。本实验中，模型大鼠表现出明显的快感缺失、绝望及焦虑样行为。电针干预后，大鼠糖水偏好率显著升高，不动时间及进食潜伏期均缩短，提示电针四关穴具有抗抑郁及抗焦虑样作用，其效应可能与减轻慢性应激所致中枢损伤相关。PFC神经元形态与递质传递对情绪调控至关重要。研究表明，Glu含量、树突棘形态、神经元活性之间存在密切关联。模型大鼠PFC区Glu含量显著下降，同时，随着第V层锥体神经元顶树突棘密度下降及成熟蘑菇型树突棘占比减少。电针干预可使Glu含量上调，并显著增加成熟树突棘数量。从中医理论分析，四关穴具有调和气血、疏调气机的作用，其改善抑郁样行为及神经形态损伤的作用，与其整体调节作用相符。Glu可能通过调控NMDA受体及PSD95相关通路参与树突棘成熟与突触可塑性调节，电针可能通过提升Glu水平激活突触可塑性，通过合谷的血供支持与太冲的气机调畅协同作用，最终改善大鼠抑郁样行为。在分子通路层面，树突棘成熟受蛋白级联信号调控。Western blot结果显示，电针干预后大鼠PFC中GluN2A、BDNF、mTORC1及PSD95蛋白表达上调。综上所述，电针四关穴可有效改善模型大鼠的抑郁样行为，其机制可能与调节PFC谷氨酸能系统功能相关。电针可升高PFC内Glu含量，增加PFC第V层锥体神经元顶树突棘密度及蘑菇型树突棘比例，并上调GluN2A、BDNF、mTORC1及PSD95蛋白表达，提示电针四关穴可能通过激活谷氨酸能神经元，促进树突棘成熟与突触可塑性重塑发挥抗抑郁作用，该机制可能依赖Glu-GluN2A-BDNF/mTORC1通路协同调控。

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基金资助

天津市教委科研计划项目(2021ZD022)