hsa＿circ＿0036287通过靶向EIF4A3调控胃癌细胞的增殖、侵袭和转移

摘要

目的：胃癌是全球发病率和病死率均居前列的消化道恶性肿瘤，早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，预后不佳。环状RNA（circular RNA,circRNA）作为一类具有共价闭合环状结构的内源性非编码RNA，因其高度的结构稳定性和组织表达特异性，在肿瘤的发生、发展中的调控作用日益受到关注。基于基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库差异表达谱分析的前期研究发现，hsa＿circ＿0036287在胃癌组织及血浆中显著下调，但其生物学功能与调控机制尚不明确。本研究旨在探究hsa＿circ＿0036287在胃癌组织中的表达特征，明确其对胃癌细胞增殖、侵袭转移等生物学行为的调控作用，并揭示其潜在的分子机制，为胃癌的早期诊断与靶向治疗提供新的生物标志物及理论依据。方法：收集20例胃癌患者的胃癌组织及配对癌旁组织，采用反转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）检测hsa＿circ＿0036287的表达水平，并分析其与患者临床病理特征的关系。通过慢病毒转染技术构建hsa＿circ＿0036287稳定沉默及过表达胃癌细胞株，采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞的增殖活性，采用Transwell小室实验评估细胞的侵袭能力，采用流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期各时相分布情况。构建裸鼠皮下移植瘤模型，从体内层面观察hsa＿circ＿0036287对胃癌肿瘤生长的调控作用。利用肿瘤特异性circRNA数据库（Cancer-Specific CircRNA Database, CSCD）、 CircInteractome、 CircFunbase三大生物信息学数据库预测hsa＿circ＿0036287的潜在结合蛋白质，通过RNA牵拉沉淀（pull-down）实验联合蛋白质印迹法（Western blotting,WB）验证其与候选靶蛋白人真核翻译起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3,EIF4A3）的相互作用。结果：RT-PCR检测结果显示，hsa＿circ＿0036287在胃癌组织中的表达水平显著低于配对癌旁组织（P<0.001）；临床病理特征分析表明，其低表达与胃癌组织低分化及较晚TNM分期均密切相关（均P<0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小无显著相关性。体外功能实验结果表明，沉默hsa＿circ＿0036287可显著增强胃癌细胞增殖与侵袭能力，降低细胞凋亡率，解除G₀/G₁期细胞周期阻滞，使S期细胞比例显著升高；而过表达hsa＿circ＿0036287则呈现相反的生物学效应，可显著抑制细胞增殖与侵袭，诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期于G₀/G₁期（均P<0.05）。裸鼠移植瘤实验进一步证实，沉默hsa＿circ＿0036287可显著促进体内肿瘤生长，表现为肿瘤体积和重量均显著增大；过表达hsa＿circ＿0036287则显著抑制移植瘤的生长（均P<0.05）。三大数据库交叉预测筛选出EIF4A3为hsa＿circ＿0036287的候选结合蛋白质，RNA pull-down实验联合WB证实二者存在特异性结合；此外，过表达hsa＿circ＿0036287可在转录后水平显著下调胃癌细胞中EIF4A3蛋白的表达（P<0.01），而EIF4A3的mRNA水平无显著变化。结论：hsa＿circ＿0036287在胃癌组织中呈低表达状态，其表达水平与胃癌的恶性程度密切相关。功能上，hsa＿circ＿0036287通过抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移，促进细胞凋亡及诱导细胞周期阻滞，发挥抑癌作用。机制上，hsa＿circ＿0036287可能通过与EIF4A3蛋白特异性结合并下调其转录后表达水平，从而抑制胃癌进展。hsa＿circ＿0036287有望成为胃癌早期诊断、预后评估的新型生物标志物及靶向治疗的潜在靶点。

关键词

胃癌 / 环状RNA / hsa＿circ＿0036287 / 人真核翻译起始因子4A3 / 细胞增殖 / 侵袭 / 转移

基金资助

福建省自然科学基金(2023J05234)