人工合成二聚体运动相关肌因子Irisin-Irisin的表达与功能

Expression and Function of Synthetic Dimeric Exercise-Induced Cytokine Irisin-Irisin

摘要

目的 运动相关肌因子Irisin是以二聚体的形式来发挥功能，故设计串联的Irisin-Irisin模拟二聚体，探讨大肠杆菌表达的重组Irisin-Irisin在活性、对肿瘤细胞功能方面与商品化单体Irisin的异同。 方法 选择BL21（DE3）大肠杆菌表达菌株、pET-30a表达载体，通过异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导，获得大肠杆菌重组蛋白Irisin-Irisin。用镍柱亲和纯化获取高纯度的重组Irisin-Irisin，将重组Irisin-Irisin和单体Irisin分别处理C2C12骨骼肌细胞，观察线粒体相关基因UCP-1的表达来验证活性，并在胃癌、结直肠癌等消化道肿瘤中验证其功能，对比重组Irisin-Irisin和单体Irisin在活性及对肿瘤细胞功能方面的差异。 结果 ① 重组Irisin-Irisin表达、纯化结果：与未诱导的样品比较，IPTG诱导后重组Irisin-Irisin显著表达；通过镍柱亲和纯化法得到大小约27 kDa高纯度的重组Irisin-Irisin。② 重组Irisin-Irisin活性检测结果：与空白对照组比较，重组Irisin-Irisin组和Irisin组处理C2C12细胞均能上调UCP-1的表达（P＜0.05）；相较于Irisin组，重组Irisin-Irisin组诱导UCP-1效果更显著（P＜0.05），活性更强。③ 重组Irisin-Irisin抗肿瘤功能检测结果：与空白对照组比较，100 ng/mL Irisin-Irisin组和200 ng/mL Irisin-Irisin组均能抑制胃癌细胞和结直肠癌细胞的迁移能力（P＜0.05），但对其增殖、克隆形成能力无影响；相较于Irisin组，重组Irisin-Irisin组抑制细胞迁移的效果更显著（P＜0.05）。 结论 大肠杆菌原核系统表达的重组Irisin-Irisin有活性，且活性优于单体Irisin；重组Irisin-Irisin对胃癌细胞、结直肠癌细胞迁移有影响，且效果优于单体Irisin。

Abstract

Objective Studies have shown that the exercise-induced cytokine Irisin functions were as a dimer, so tandem Irisin-Irisin mock dimers were designed to explore the similarities and differences between recombinant Irisin-Irisin expressed by Escherichia coli and commercial Irisin in activity and function on tumor cells. Methods Escherichia coli strain BL21 (DE3) and pET-30a expression vectors were selected to obtain recombinant Irisin-Irisin by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. High purity recombinant Irisin-Irisin was obtained by Ni Sepharose excel. C2C12 skeletal muscle cells were treated with recombinant Irisin-Irisin and monomeric Irisin respectively, and the expressions of mitochondrial related gene UCP-1 were observed to test the activity. The functions were verified in gastric cancer, colorectal cancer and other gastrointestinal tumors, and the activity and function of recombinant Irisin-Irisin and monomeric Irisin on tumor cells were compared. Results (1) Expression and purification of recombinant Irisin-Irisin: compared with the non-induced samples, the recombinant Irisin-Irisin was significantly expressed after IPTG induction; high purity recombinant Irisin-Irisin with a molecular weight of about 27 kDa was obtained by Ni Sepharose excel. (2) Detection of recombinant Irisin-Irisin activity: compared with the blank control group, both the recombinant Irisin-Irisin group and the Irisin group could up-regulate the expression of UCP-1 in C2C12 cells (P<0.05); compared with the Irisin group, the recombinant Irisin-Irisin group had a more significant effect and stronger activity in inducing UCP-1 (P<0.05). (3) Recombinant Irisin-Irisin on tumor function: compared with the blank control group, both the 100 ng/mL and 200 ng/mL Irisin-Irisin groups could inhibit the migration of gastric cancer cells and colorectal cancer cells(P<0.05), but had no effect on their proliferation and clone formation; compared with the Irisin group, the recombinant Irisin-Irisin group had a more significant effect on cell migration inhibition (P<0.05). Conclusion The recombinant Irisin-Irisin expressed by Escherichia coli has activity, and the activity is higher than that of the monomeric Irisin; recombinant Irisin-Irisin has an effect on the migration of gastric cancer cells and colorectal cancer cells, and the effect was better than that of the monomeric Irisin.

Graphical abstract

关键词

重组Irisin-Irisin / 运动相关肌因子 / 原核表达 / 生物学功能

Key words

recombinant Irisin-Irisin / exercise-induced cytokine / prokaryotic expression / biological function

Irisin是Spiegelman实验室于2012年发现的一种运动诱导的肌因子^［1］，由含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，FNDC5）在过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator-1 alpha，PGC-1α）作用下被蛋白酶水解产生^［2］，其前体FNDC5由209个氨基酸组成，从N端到C端分别是信号肽、含Ⅲ型纤连蛋白结构域、疏水结构域和C末端结构域^［3］（蛋白结构见图1）。Irisin是含112个氨基酸、相对分子质量为2.2×10⁴的糖基化蛋白，有2个糖基化位点，脱糖后相对分子质量约1.5×10^4［4］。Irisin在人体中广泛分布，真核生物中几乎所有器官和组织都有表达^［5］。

Irisin在调节能量代谢、改善认知功能和胰岛素抵抗、调节骨代谢以及抗癌方面发挥功能^［6］。Irisin能将白色脂肪转变为棕色脂肪，促进机体能量代谢^［7-8］，也能通过改善老年痴呆模型大鼠的突触可塑性和记忆障碍来提高认知功能^［9-12］，还能改善2型糖尿病的胰岛素抵抗水平促进糖尿病患者的恢复^［13-15］。此外，有报道发现Irisin能通过αV类整合素受体促进骨骼重塑以调节骨代谢^［16］。除了上述功能，Irisin在肿瘤中的作用也常被报道。NOWINSKA等^［17］用不同浓度Irisin处理人肺癌细胞，发现Irisin对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭均有明显的抑制作用，且呈时间相关性。SHAO等^［18］推测Irisin水平与乳腺癌的发生密切相关，是乳腺癌的独立预测因子。SHI等^［19］探讨Irisin通过PI3K-AKT途径抑制HepG2肝癌细胞的增殖迁移能力。也有1项研究通过病例对照研究发现，胃癌患者血清中Irisin水平低于健康人群，推测Irisin可以作为胃癌早期诊断的血清标志物^［20］。LIU等^［21］在胰腺癌细胞MIA PaCa-2中发现Irisin可以抑制该细胞的增殖迁移等功能，但具体机制不清。虽然研究Irisin对肿瘤功能影响的工作越来越多，但Irisin干预肿瘤的机制尚无定论，腺苷磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）被报道是介导Irisin干预肿瘤功能的下游信号通路之一^［22］。

虽然已知Irisin是通过二聚体的形式发挥作用，但目前研究都集中在纯化单体Irisin的功能，一个稳定的二聚体Irisin-Irisin是否比单体Irisin的活性更高，未见相关研究。因此，本研究设计2个串联的重组Irisin-Irisin以模拟二聚体的形式，探究重组Irisin-Irisin融合蛋白的活性及其在消化道肿瘤中的生物学功能是否优于单体Irisin。

1 材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　实验细胞

本实验室涉及的AGS胃癌细胞（ATCC，CRL-1739）、DLD-1结直肠癌细胞（ATCC，CCL-221）及C2C12骨骼肌细胞（ATCC，CRL-1772）均购自ATCC，细胞接种至T₂₅培养瓶中培养，肿瘤细胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在5% CO₂、37 ℃培养箱中培养，C2C12细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5% CO₂、37 ℃培养箱中培养。

1.1.2　主要实验试剂

DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基（BI，XP2069）；胰蛋白酶（Sigma，T4049）；RIPA蛋白裂解液（Boster，AR0102-100）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（雅酶，PG213）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Thermo，23227）；胎牛血清（Sigma，F8318）；CCK-8试剂盒（Sangon，E606335）；结晶紫染色液（Beyotime，C0121）；Anti-His antibody（Proteintech，66005-1-Ig）；Anti-UCP-1 antibody（Sigma，U6382）；GAPDH蛋白抗体（Proteintech，60004-1-Ig）；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（ImmunoReseach，115-001-003）；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（ImmunoReseach，111-001-003）；超敏ECL化学发光即用型底物（Boster，AR1172）；无血清细胞冻存液（新赛美，C40100）；Irisin（Enzo，ADI-908-307-0010）。

1.2　实验方法

1.2.1　菌体培养

表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）、表达载体pET-30a为本实验室保存。将BL21（DE3）接种至LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇床培养过夜。

1.2.2　重组表达载体及菌株构建

Irisin［Genbank：NM_153756.3（260～595 bp）］通过密码子分析软件EMBOSS优化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将目的基因Irisin-Irisin构建至pET-30a质粒中（具体质粒图谱如图2），并转化至BL21（DE3）大肠杆菌表达菌株，测序验证序列正确后，命名为BL21（DE3）-Irisin-Irisin，于-80 ℃保存。

1.2.3　重组Irisin-Irisin的表达和纯化

1.2.3.1　大肠杆菌中表达重组Irisin-Irisin

挑取BL21（DE3）-Irisin-Irisin单克隆于10 mL含卡那霉素（50 μg/μL）LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇床过夜。按照1%的接种量，将过夜培养的菌液接种到1 L含卡那霉素（50 μg/mL）LB液体基中，220 r/min、37 ℃摇至菌液OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度0.5 mmol/L的异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，37 ℃、220 r/min诱导4 h，15 000 r/min、4 ℃离心15 min收集菌体。

1.2.3.2　包涵体溶解

菌体加入Lysis buffer （20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1%（V/V）TritonX-100）重悬，超声波细胞破碎仪（JY92-IIN，Scientz）裂菌，工作5 s，休息5 s，55 W功率破碎30 min，菌液于15 000 r/min、4 ℃离心15 min后弃上清，沉淀加入包涵体洗涤液［50 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.5（V/V）TritonX-100、8 mol/L Urea、5 mmol/L DTT］重悬，15 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集上清。

1.2.3.3　镍柱亲和纯化

AKTA蛋白纯化仪（AKTA prime plus，GE）纯化重组Irisin-Irisin。Binding Buffer（50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、8 mmol/L Urea）平衡镍柱后将蛋白挂柱，收集柱后上清液。分别用含8、6、4、2、0 mol/L Urea平衡液在镍柱上梯度复性，每个梯度结束后暂停1 h，用洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl）洗脱蛋白，收集洗脱峰。将纯化所得的溶液过Sepharose G 50分子筛以去除其中的咪唑并将Tris-HCl缓冲液更换为PBS缓冲液。

1.2.4　重组Irisin-Irisin的鉴定与浓度检测

样品经10 %SDS-PAGE电泳，电泳后将胶转至NC膜，置于冰上300 mA转膜1 h。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Anti-His-antibody一抗室温孵育2.5 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。二抗Goat Anti-Mouse IgG（H+L）室温孵育1 h后用1×TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL化学发光底物在Bio-Rad凝胶成像仪显影。

蛋白样品用BCA法检测浓度，具体方法参考BCA试剂盒说明书。经纯化和分子筛的重组Irisin-Irisin的蛋白浓度为0.214 mg/mL。

1.2.5　重组Irisin-Irisin活性检测

C2C12骨骼肌细胞用含10% FBS的DMEM培养基贴壁培养，按3×10⁵个/mL密度接种至6孔板，待细胞长至70%左右，重组Irisin-Irisin组用重组Irisin-Irisin处理2 d，Irisin组用单体Irisin处理2 d，另设1个空白对照组，Western blot法检测UCP-1蛋白表达量来验证重组Irisin-Irisin的生物活性。

1.2.6　重组Irisin-Irisin肿瘤功能检测

用重组Irisin-Irisin处理AGS胃癌细胞、DLD-1结直肠癌细胞，检测重组Irisin-Irisin在不同肿瘤细胞的功能。

1.2.6.1　细胞增殖实验

待细胞长满后按照4×10³个/mL密度接种至96孔板做CCK8细胞增殖实验，设置空白对照组、100 ng/mL Irisin-Irisin组和200 ng/mL Irisin-Irisin组，每组设置6个复孔，另外，设置0、24、48、72 h 4块板，检测不同时间段细胞增殖能力。

1.2.6.2　细胞迁移划痕实验

细胞长满时，按照1×10⁶个/mL接种至6孔板做划痕实验检测细胞迁移能力，组别设置与增殖实验一致，每组3个复孔，在细胞长至80%密度时用10 µL的枪头划痕，空白对照组换成无血清培养基继续培养48 h，其余2组分别换成含有100、200 ng/mL重组Irisin-Irisin的无血清培养基继续培养，按时拍摄细胞迁移图片，采用Image J计算迁移面积。

1.2.6.3　克隆形成实验

细胞长至80%密度时按10³个/mL接种至6孔板，组别设置如前所述，每组设置3个复孔，在观察到明显集落形成时，吸弃旧液，PBS清洗2遍，70 %甲醇固定20 min，PBS清洗2遍，每孔加入200 µL结晶紫染液室温染色30 min，纯水清洗3遍，自然晾干后拍摄图像。

1.3　统计学方法

本研究中涉及图片分析均采用Image J软件，数据分析采用GraphPad Prism 7；实验过程重复至少3次，并采用SPSS 26.0软件进行统计分析，结果均服从正态分布，数据用（\overline{x}±s）来表示。多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，则采用LSD-t方法两两比较，若方差不齐，采用Games-Howell法两两比较。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1　重组Irisin-Irisin表达、纯化与鉴定

通过构建最终获得pET-30a-Irisin-Irisin，质粒图谱如图2所示。对重组Irisin-Irisin表达和纯化情况进行鉴定，如图3所示，与未诱导的样品比较，IPTG诱导后在27 kDa处显现出单一条带，与预期的重组Irisin-Irisin大小一致（图3A）。为进一步验证条带是否正确，采用Western blot法进行鉴定。镍柱亲和纯化法纯化重组Irisin-Irisin，见图3B。将所得蛋白过Sepharose G 50分子筛脱盐纯化，见图3C。

2.2　重组Irisin-Irisin活性鉴定

采用Western blot法鉴定UCP-1蛋白表达量，见图4。与空白对照组比较，Irisin组和重组Irisin-Irisin组均上调UCP-1的相对表达量（P＜0.05），证明大肠杆菌表达的重组Irisin-Irisin有活性且活性优于单体Irisin（P＜0.05）。

2.3　重组Irisin-Irisin抗肿瘤功能检测

用不同浓度的重组Irisin-Irisin处理AGS胃癌细胞以及DLD-1结直肠癌细胞，检测细胞增殖、迁移能力，见图5。如图5D、图5E所示，重组Irisin-Irisin能抑制DLD-1结直肠癌细胞的迁移能力（P＜0.05），但对细胞的增殖（图5C）和克隆形成（图5A、图5B）无影响（P＞0.05）。如图6D、图6E所示，重组Irisin-Irisin可以抑制AGS胃癌细胞迁移（P＜0.05），但对细胞增殖（图6C）和克隆形成（图6A、图6B）无明显影响（P＞0.05）。为探讨二聚体Irisin-Irisin和单体Irisin的区别，用相同浓度的重组Irisin-Irisin和单体Irisin处理AGS胃癌细胞及DLD-1结直肠癌细胞，如图7所示，重组Irisin-Irisin和单体Irisin均能抑制AGS胃癌细胞（图7A）、DLD-1结直肠癌细胞（图7B）细胞迁移能力。

3 讨 论

随着饮食习惯的改变，肥胖及代谢性疾病的发生越来越普遍^［23］。虽然运动被认为是改善肥胖及其并发症的有效方法，但是仍然有些人身体条件不允许或不愿意通过运动改善肥胖。运动模拟是近年来新兴的治疗方式，专注于增强运动本身或模仿体育锻炼的效果。在很大程度上，运动模拟物能预防或者治疗相关疾病^［24］。前期的探索研究发现，Irisin作为一种运动释放的肌肉因子，其在痴呆模型、癌症、心血管疾病等领域都展现出有益作用^［25］。因此，研究重组Irisin的表达及其生物学功能具有重要意义。

3.1　重组Irisin的表达和纯化

目前国内外研究中，对重组Irisin的表达研究相对较少，有学者在大肠杆菌中表达了重组Irisin，利用镍柱亲和纯化的方法得到了12.5 kDa的Irisin^［26］。刘佳玉^［27］在毕赤酵母和大肠杆菌中表达重组Irisin，讨论不同表达系统表达的Irisin对胰腺癌的功能差异。何赛等^［28］在大肠杆菌中表达重组Irisin，纯化后得到大小为14 kDa的蛋白。以上研究着重关注了单体Irisin的表达与生物学功能，而二聚体Irisin-Irisin的重组表达及功能鉴定尚未研究。因此，本研究想探讨二聚体Irisin-Irisin的表达及比较其与单体Irisin的功能差异。考虑到大肠杆菌遗传背景较为清楚，基因工程操作手段完善，代谢途径和基因表达调控机制比较清楚，外源基因产物表达量高等，故本研究采用大肠杆菌原核表达系统，表达可溶性蛋白重组Irisin-Irisin，获取了高纯度重组Irisin-Irisin^［29］。

3.2　重组Irisin-Irisin的活性检测

在重组Irisin蛋白活性检测上，目前应用最多的方法是Irisin能够诱导白色脂肪转为棕色脂肪，检测与棕色脂肪产热相关的基因如UCP-1、PGC-1α的蛋白表达量。最初有学者用大肠杆菌自表达Irisin处理3T3-L1前脂肪细胞，3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞，油红O染色检测脂滴的数量验证诱导效果，采用Western blot法验证重组Irisin上调UCP-1、PGC-1α的表达水平^［26］。刘佳玉^［27］用大肠杆菌和毕赤酵母表达的2种Irisin处理胰腺癌细胞，检测Irisin对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、集落形成能力的影响，验证重组Irisin抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移能力来验证重组蛋白的活性和生物学功能。何赛等^［28］将自表达的Irisin处理C2C12骨骼肌细胞，从mRNA水平上检测UCP-1基因表达水平。

Irisin最初是在骨骼肌中发现的，是参与能量稳态和代谢调节的多肽激素^［30］。研究表明，Irisin水平升高和胰岛素抵抗风险降低相关，Irisin可通过增强PGC-1α的表达，进而加速骨骼肌的能量消耗和氧化代谢水平；线粒体功能障碍可能会导致骨骼肌胰岛素抵抗，从而引起代谢紊乱^［31］。以往的研究显示Irisin能改善线粒体功能，而本研究用重组Irisin-Irisin及商品化单体Irisin处理C2C12骨骼肌细胞，发现这2种Irisin均能诱导UCP-1的相对表达量，且重组Irisin-Irisin诱导效果优于单体Irisin，这也证实了Irisin是以二聚体的形式来发挥功能的特点。

3.3　重组Irisin-Irisin在肿瘤细胞中的功能

自Irisin报道以来，研究者对其功能的探索逐渐展开。研究发现Irisin在不同的肿瘤细胞中发挥不同的功能。SHAO等^［18］发现低剂量的Irisin（20 nmol/L）能抑制NCI-H446及A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及克隆形成的能力。20 nmol/L的Irisin处理MDA-MB-231乳腺癌细胞能有效抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移能力^［21］。刘佳玉^［27］用不同浓度Irisin处理MIA PaCa-2及Panc03.27胰腺癌细胞，发现Irisin通过PI3R/AKT信号通路抑制胰腺癌细胞的增殖侵袭能力。本研究将重组Irisin-Irisin和商品化单体Irisin处理DLD-1结直肠癌细胞及AGS胃癌细胞，探讨重组Irisin-Irisin对这2种细胞的增殖、迁移、集落形成等功能的影响及比较重组Irisin-Irisin和单体Irisin在细胞功能上的区别。本研究不足之处在于没有探讨重组Irisin-Irisin及单体Irisin在其他肿瘤细胞的功能以及缺乏对机制的研究。

4 结 论

本研究在大肠杆菌原核表达系统里面表达了可溶性重组Irisin-Irisin蛋白，通过镍柱纯化及分子筛脱盐处理，得到了分子量27 kDa的目的蛋白，重组Irisin-Irisin处理C2C12骨骼肌细胞2 d后能上调UCP-1蛋白表达，证明了重组Irisin-Irisin有活性，且重组Irisin-Irisin活性高于Irisin。重组Irisin-Irisin处理AGS胃癌细胞以及DLD-1结直肠癌细胞，发现其能抑制AGS胃癌细胞、DLD-1结直肠癌细胞的迁移能力，但对细胞的增殖无影响。此外，相较于Irisin，重组Irisin-Irisin抑制细胞迁移的效果更好，但重组Irisin-Irisin/单体Irisin促进结直肠癌、胃癌康复的机制还有待进一步深入研究。

参考文献

[1] BOSTRÖM P， WU J， JEDRYCHOWSKI M P，et al. A PGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis ［J］. Nature，2012，481（7382）：463-468.

[2] MAAK S， NORHEIM F， DREVONC A，et al. Progress and cha-llenges in the biology of FNDC5 and Irisin ［J］. Endocr Rev，2021，42（4）：436-456.

[3] PERAKAKIS N， TRIANTAFYLLOUG A， FERNÁNDEZ-REAL J M，et al. Physiology and role of Irisin in glucose homeostasis ［J］. Nat Rev Endocrinol，2017，13（6）：324-337.

[4] ZHANG D G， TAN X Y， TANG N，et al. Review of research on the role of Irisin in tumors ［J］. Onco Targets Ther，2020，13：4423-4430.

[5] PEDERSENB K， Muscles FEBBRAIOM A.，exercise and obesity ：skeletal muscle as a secretory organ ［J］. Nat Rev Endocrinol，2012，8（8）：457-465.

[6] KORNEL A， DEN HARTOGHD J， KLENTROU P，et al. Role of the myokine Irisin on bone homeostasis：review of the current evidence ［J］. Int J Mol Sci，2021，22（17）：9136.

[7] CHEN Y， DING J， ZHAO Y F，et al. Irisin induces white adipose tissue browning in mice as assessed by magnetic resonance ima-ging ［J］. Exp Biol Med （Maywood），2021，246（14）：1597-1606.

[8] COLAIANNI G， CINTI S， COLUCCI S，et al. Irisin and musculoskeletal health ［J］. Ann N Y Acad Sci，2017，1402（1）：5-9.

[9] ISLAMM R， VALARIS S， YOUNGM F，et al. Exercise hormone Irisin is a critical regulator of cognitive function ［J］. Nat Metab，2021，3（8）：1058-1070.

[10] LOURENCOM V， FROZZAR L， DE FREITASG B，et al. Exercise-linked FNDC5/Irisin rescues synaptic plasticity and memory defects in Alzheimer's models ［J］. Nat Med，2019，25（1）：165-175.

[11] PIGNATARO P， DICARLO M， ZERLOTIN R，et al. FNDC5/Irisin system in neuroinflammation and neurodegenerative diseases：update and novel perspective ［J］. Int J Mol Sci，2021，22（4）：1605.

[12] YOUNG M F， VALARIS S， WRANN C D. A role for FNDC5/Irisin in the beneficial effects of exercise on the brain and in neurodegenerative diseases ［J］. Prog Cardiovasc Dis，2019，62（2）：172-178.

[13] LIN C， GUO Y Z， XIA Y L，et al. FNDC5/Irisin attenuates diabe-tic cardiomyopathy in a type 2 diabetes mouse model by activation of integrin αV/β5-AKT signaling and reduction of oxidative/nitrosative stress ［J］. J Mol Cell Cardiol，2021，160：27-41.

[14] OGURI Y， SHINODA K， KIM H，et al. CD81 controls beige fat progenitor cell growth and energy balance via FAK signaling ［J］. Cell，2020，182（3）：563-577. e20.

[15] ZHANG Y， LI R， MENG Y，et al. Irisin stimulates browning of white adipocytes through mitogen-activated protein kinase p38 MAP kinase and ERK MAP kinase signaling ［J］. Diabetes，2014，63（2）：514-525.

[16] KIM H， WRANNC D， JEDRYCHOWSKI M，et al. Irisin mediates effects on bone and fat via αV integrin receptors ［J］. Cell，2018，175（7）：1756-1768. e17.

[17] NOWINSKA K， JABLONSKA K， PAWELCZYK K，et al. Expre-ssion of Irisin/FNDC5 in cancer cells and stromal fibroblasts of non-small cell lung cancer ［J］. Cancers，2019，11（10）：1538.

[18] SHAO L， LI H J， CHEN J，et al. Irisin suppresses the migration，proliferation，and invasion of lung cancer cells via inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition ［J］. Biochem Biophys Res Commun，2017，485（3）：598-605.

[19] SHI G J， TANG N， QIU J T，et al. Irisin stimulates cell proliferation and invasion by targeting the PI3K/AKT pathway in human hepatocellular carcinoma ［J］. Biochem Biophys Res Commun，2017，493（1）：585-591.

[20] AYDIN S， KULOGLU T， OZERCANM R，et al. Irisin immunohistochemistry in gastrointestinal system cancers ［J］. Biotech Histochem，2016，91（4）：242-250.

[21] LIU J Y， SONG N N， HUANG Y B，et al. Irisin inhibits pancreatic cancer cell growth via the AMPK-mTOR pathway ［J］. Sci Rep，2018，8（1）：15247.

[22] LI R L， WU S S， WU Y，et al. Irisin alleviates pressure overload-induced cardiac hypertrophy by inducing protective autophagy via mTOR-independent activation of the AMPK-ULK1 pathway ［J］. J Mol Cell Cardiol，2018，121：242-255.

[23] ZECHNER R， ZIMMERMANN R， EICHMANNT O，et al. FAT SIGNALS：lipases and lipolysis in lipid metabolism and signa-ling ［J］. Cell Metab，2012，15（3）：279-291.

[24] GUBERT C，HANNANAJ. Exercise mimetics：harnessing the therapeutic effects of physical activity ［J］. Nat Rev Drug Discov，2021，20（11）：862-879.

[25] CHEN K， XU Z C， LIU Y K，et al. Irisin protects mitochondria function during pulmonary ischemia/reperfusion injury ［J］. Sci Transl Med，2017，9（418）：eaao6298.

[26] PANATI K， NARALAV R， NARASIMHAV R，et al. Expression，purification and biological characterisation of recombinant human Irisin （12.5 kDa） ［J］. J Genet Eng Biotechnol，2018，16（2）：459-466.

[27] 刘佳玉. 重组Irisin在毕赤酵母中的表达及其对人胰腺导管癌抗癌活性的研究［D］. 长春：吉林大学，2019：13-25.

[28] LIU J Y. Expression of recombinant Irisin in Pichia pastoris and its anticancer activity against human pancreatic ductal carcinoma ［D］. Changchun：Jilin University，2019：13-25.

[29] 何赛，李洁，郁建锋，等. 人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化［J］. 农业生物技术学报，2016，24（10）：1522-1528.

[30] HE S， LI J， YU J F，et al. Cloning，prokaryotic expression of human （Homosapiens） Irisin gene and purification of recombinantprotein ［J］. J Agric Biotechnol，2016，24（10）：1522-1528.

[31] 刘丽琴，陈婷婷，李少伟，等. 大肠杆菌表达系统在基因工程疫苗研发中的应用与策略优化［J］. 中国新药杂志，2020，29（21）：2434-2442.

[32] LIU L Q， CHEN T T， LI S W，et al. Escherichia coli expression system applied in the development of recombinant human vaccines and its potential improvement ［J］. Chin J New Drugs，2020，29（21）：2434-2442.

[33] ESTELLE G， LEP T， VEGTING Y，et al. Irisin directly stimulates osteoclastogenesis and bone resorption in vitro and in vivo ［J］. eLife，2020，9：e58172.

[34] PARKS E， PARKC Y， SWEENEY G. Biomarkers of insulin sensitivity and Insulin resistance：past，present and future ［J］. Crit Rev Clin Lab Sci，2015，52（4）：180-190.

基金资助

国家自然科学基金青年项目(82003095)

福建省自然科学基金项目(2020J06041)

福建中医药大学校管课题(X2021011)