清解扶正颗粒通过TLR4/NF-κB通路对乳腺癌多西他赛联合环磷酰胺化疗所致肠道黏膜损伤的保护作用

Protective Effects of Qingjie Fuzheng Granules on Intestinal Mucosal Injury Induced by Docetaxel/Cyclophosphamide Chemotherapy in Breast Cancer Through the TLR4/NF-κB Pathway

摘要

目的 探讨清解扶正颗粒（QFG）对乳腺癌多西他赛联合环磷酰胺化疗所致肠黏膜损伤的保护机制。 方法 选择32只雌性BALB/c小鼠接种4T1乳腺癌细胞构建皮下移植瘤模型，瘤体体积50～100 mm³，采用Excel软件随机分为对照组、清解扶正颗粒组（QFG组）、化疗组（TC组）、化疗＋清解扶正颗粒组（TC＋QFG组），每组8只。对照组以无菌生理盐水灌胃，1次/d；腹腔注射无菌生理盐水，1次/周。QFG组按1 g/kg清解扶正颗粒灌胃，1次/d；腹腔注射无菌生理盐水，1次/周。TC组腹腔注射多西他赛（15 mg/kg）与环磷酰胺（20 mg/kg），1次/周；无菌生理盐水灌胃，1次/d。TC＋QFG组腹腔注射多西他赛和环磷酰胺，1次/周；1 g/kg清解扶正颗粒灌胃，1次/d，灌胃与腹腔注射间隔0.5 h进行。每组干预均持续4周。干预后，观察小鼠体质量、腹泻情况和瘤体体积增长情况；采用HE染色检测回肠黏膜组织形态学改变；采用ELISA法检测血清中二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-2、IL-4、IL-10、γ干扰素（IFN-γ）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）含量；采用TUNEL染色法检测回肠黏膜组织细胞凋亡；采用免疫组织化学检测回肠黏膜组织IgA^＋细胞及肠屏障紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）的表达；采用Western blot法检测回肠黏膜组织TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表达水平。 结果 ① 体质量、腹泻评分和瘤体体积：与TC组比较，TC＋QFG组干预第27天体质量明显升高（P＜0.05），干预第1、8天腹泻评分明显降低（P＜0.05）；其余时间点体质量、腹泻评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，TC＋QFG组干预第13天及之后的所有时间点瘤体体积均明显减小（P＜0.05）。② 回肠组织病理形态学变化：与TC组比较，TC＋QFG组干预后肠黏膜组织结构明显改善，肠黏膜上皮细胞水肿缓解，肠绒毛变高且排列稍规则，隐窝深度变浅，炎细胞浸润减少；TC＋QFG组肠绒毛高度、绒毛/隐窝比均明显升高（P＜0.05），隐窝深度明显降低（P＜0.05）。③ 回肠黏膜组织ZO-1和Occludin蛋白表达水平：与TC组比较，TC＋QFG组干预后小鼠回肠黏膜组织ZO-1和Occludin蛋白表达明显增加（P＜0.05）。④ 血清DAO、D-LA含量：与TC组比较，TC＋QFG组干预后血清DAO、D-LA含量明显降低（P＜0.05）。⑤ 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量：与TC组比较，TC＋QFG组干预后血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量明显降低（P＜0.05），IL-2、IL-4、IL-10含量明显升高（P＜0.05）。⑥ 回肠黏膜组织细胞凋亡：与TC组比较，TC＋QFG组干预后细胞核黄染明显减少，染色阳性率明显降低（P＜0.05）。⑦ 血清sIgA含量及回肠黏膜组织IgA^＋细胞数：与TC组比较，TC＋QFG组干预后血清sIgA含量和回肠黏膜组织IgA^＋细胞数均明显升高（P＜0.05）。⑧ 回肠黏膜组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达水平：与TC组比较，TC＋QFG组干预后回肠黏膜组织TLR4和p-NF-κB蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）。 结论 清解扶正颗粒对乳腺癌化疗所致肠黏膜损伤具有保护作用，可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症反应，减少肠黏膜上皮细胞凋亡，增强肠黏膜上皮屏障及免疫屏障功能。

Abstract

Objective To investigate the protective mechanisms of Qingjie Fuzheng Granules (QFG) against intestinal mucosal injury induced by docetaxel and cyclophosphamide combination chemotherapy in breast cancer. Methods A total of 32 female BALB/c mice were selected and inoculated with 4T1 breast cancer cells to establish subcutaneous tumor models, with tumor volumes ranging from 50 to 100 mm³. The mice were randomly divided into control group, Qingjie Fuzheng Granules group (QFG group), chemotherapy group (TC group), and chemotherapy+Qingjie Fuzheng granules group (TC+QFG group) by Excel software, with eight mice in each group. The control group received sterile normal saline gavage once daily and intraperitoneal injections of sterile saline once weekly. The QFG group was given Qingjie Fuzheng Granules at 1 g/kg by gavage once daily, along with weekly intraperitoneal injections of sterile normal saline. The TC group received weekly intraperitoneal injections of docetaxel (15 mg/kg) and cyclophosphamide (20 mg/kg), along with daily intragastric sterile normal saline. The TC+QFG group received intraperitoneal docetaxel and cyclophosphamide once weekly and 1 g/kg of Qingjie Fuzheng Granules by gavage once daily, with a 0.5-hour interval between gavage and injection. The intervention lasted for four weeks in all groups. After intervention, the mice were assessed for body weight, diarrhea, and tumor volume growth. Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to evaluate morphological changes in the ileal mucosa. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure serum contents of diamine oxidase (DAO), D-lactic acid (D-LA), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β), IL-6, IL-2, IL-4, IL-10, gamma interferon (IFN-γ), and secretory immunoglobulin A (sIgA). The TUNEL staining method was used to detect apoptosis in ileal mucosal cells. Immunohistochemistry was used to assess the expression of IgA⁺ cells and tight junction proteins (ZO-1, Occludin) in the ileal mucosa. Western blot was used to determine the expression levels of TLR4, NF-κB, and p-NF-κB proteins in the ileal mucosa. Results (1) Body weight, diarrhea score, and tumor volume: compared with the TC group, body weight in the TC+QFG group increased significantly at day 27 of intervention (P<0.05), along with significantly decreased diarrhea scores at 1st and 8th day of intervention (P<0.05). No statistically significant differences in body weight and diarrhea scores were observed at other times (P>0.05). Compared with the control group, the tumor volume in the TC+QFG group decreased significantly on day 13 of intervention and all subsequent time points (P<0.05). (2) Histopathological changes in ileal tissue: compared with the TC group, the TC+QFG group showed significant improvements in intestinal mucosal structure, including reduced epithelial edema, increased villus height, better organized villi arrangement, shallower crypt depth, and decreased inflammatory cell infiltration. After intervention, the villus height and villus/crypt ratio increased significantly (P<0.05), while crypt depth significantly decreased in the TC+QFG group (P<0.05). (3) Expression levels of ZO-1 and Occludin proteins in ileal mucosal tissue: compared with the TC group, the expression levels of ZO-1 and Occludin proteins in the ileal mucosal tissue of the TC+QFG group increased significantly after intervention (P<0.05). (4) Serum levels of DAO and D-LA: compared with the TC group, serum levels of DAO and D-LA in the TC+QFG group decreased significantly after intervention (P<0.05). (5) Serum levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-2, IL-4, IL-10, and IFN-γ: compared with the TC group, serum levels of IL-1β, TNF-α, IL-6, and IFN-γ in the TC+QFG group decreased significantly after intervention (P<0.05), while the levels of IL-2, IL-4, and IL-10 increased significantly (P<0.05). (6) Apoptosis in ileal mucosal tissue: compared with the TC group, nuclear yellowing and positive staining rate in the TC+QFG group decreased significantly after intervention (P<0.05). (7) Serum sIgA levels and the number of IgA⁺ cells in ileal mucosal tissue: compared with the TC group, the serum sIgA contents and number of IgA⁺ cells in ileal mucosal tissue in the TC+QFG group increased significantly after intervention (P<0.05). (8) Expression levels of TLR4/NF-κB pathway-related proteins in the ileal mucosal tissue: compared with the TC group, the expression levels of TLR4 and p-NF-κB proteins in the ileal mucosal tissue of the TC+QFG group decreased significantly after intervention (P<0.05). Conclusion QFG demonstrates a protective effect against intestinal mucosal damage induced by chemotherapy in breast cancer, potentially through modulation of the TLR4/NF-κB signaling pathway, which may inhibit inflammatory responses, reduce intestinal epithelial cell apoptosis, and enhance both epithelial and immune barrier functions of the intestinal mucosa.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 肠道黏膜损伤 / 清解扶正颗粒 / 化疗 / TLR4/NF-κB信号通路 / 肠黏膜免疫功能

Key words

breast cancer / intestinal mucosal injury / Qingjie Fuzheng Granules / chemotherapy / TLR4/NF-κB signaling pathway / intestinal mucosal immune function

乳腺癌发病呈年轻化趋势，且发病率逐年上升，已成为全球性公共卫生问题。据国际癌症研究机构统计，2022年全球女性新发乳腺癌病例逾230万，乳腺癌患者病死数超过66万^［1］。尽管乳腺癌的综合治疗措施多且持续更新，化疗仍是不可替代的重要治疗手段。多西他赛联合环磷酰胺作为乳腺癌临床常用化疗方案，常引起骨髓抑制、消化道不良反应等，严重的毒副作用可导致治疗周期延迟甚至中断^［2-3］。化疗药物易损伤细胞增殖活跃的消化道黏膜，诱发肠黏膜炎。研究表明，化疗所致肠黏膜炎与TLR4/NF-κB通路调控相关^［4］。TLR4作为Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）家族重要成员，一旦激活可启动核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎症级联反应，释放白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6等促炎因子，导致肠黏膜结构与功能受损^［5］。目前，中医药在乳腺癌化疗毒副作用治疗中常获独特疗效。清解扶正颗粒（Qingjie Fuzheng Granules，QFG）是福建中医药大学附属人民医院肿瘤科经验方，由白花蛇舌草、半枝莲、炙黄芪、炒麦芽、炙甘草等组成，具有清热解毒、益气健脾扶正之效，临床用于辅助化疗治疗结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤，可改善患者生活质量，减轻胃肠道不良反应^［6-7］。课题组前期研究显示，该方可抑制大肠癌细胞增殖并诱导凋亡，降低血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6水平，减轻5-氟尿嘧啶所致肠黏膜炎^［8-10］。临床研究证实，清解扶正方加味可改善乳腺癌化疗患者腹泻、恶心呕吐等消化道反应，并可能提高化疗期间免疫力^［11］。但是，清解扶正颗粒防治乳腺癌化疗相关肠黏膜炎尚无系统研究，其作用机制尚未阐明。因此，本研究旨在观察清解扶正颗粒对4T1乳腺癌小鼠化疗所致肠黏膜炎的保护作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1　实验动物

选择32只雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，初始体质量（20±2）g，购买于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0016。实验期间，小鼠饲养于福建中医药大学实验动物中心［实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2009-0001］，由实验动物中心提供SPF级实验动物环境和设施，每天光照12 h，给予小鼠正常饮食和饮水，预饲养3～7 d使小鼠适应，保证后续实验顺利进行。动物实验程序严格按照国际伦理准则和美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用指南进行，并经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（审批号：FJTCMIACUC2021153）。

1.2　实验药物

1.2.1　清解扶正颗粒配制

由福建中医药大学附属人民医院药剂科提供，用生理盐水配制成125 mg/mL的溶液，超声溶解密封放于4 ℃冰箱备用。根据临床给药剂量换算成小鼠给药剂量为1 g/kg，按照100 μL/10 g的给药体积灌胃。

1.2.2　化疗药物配制

1.2.2.1　多西他赛注射液的配制

取多西他赛注射液用生理盐水稀释配制成浓度为1.5 mg/mL的药液，充分混匀后备用（给药剂量15 mg/kg）。

1.2.2.2　环磷酰胺注射液的配制

取环磷酰胺粉末用生理盐水稀释配制成浓度为2 mg/mL的药液，充分混匀后备用（给药剂量20 mg/kg）。

1.3　主要实验试剂

TLR4 Mouse Monoclonal Antibody（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66350-1-Ig）；NF-κB p65（D14E12）XP Rabbit mAb（货号：8242S）、Phospho-NF-κB p65（Ser536）（93H1）（货号：3033S）均购自美国Cell Signaling Technology公司；Rabbit Anti-Mouse IgA antibody（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0774R）；RPMI-1640（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：C11875500BT）；小鼠二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）ELISA试剂盒（货号：MM-0228M1）、小鼠D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）ELISA试剂盒（货号：MM-43853M1）、小鼠γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）ELISA试剂盒（货号：MM-0182M1）、小鼠TNF-α ELISA试剂盒（货号：MM-0132M1）、小鼠IL-1β ELISA试剂盒（货号：MM-0040M1）、小鼠IL-2 ELISA试剂盒（货号：MM-0701M1）、小鼠IL-4 ELISA试剂盒（货号：MM-0165M1）、小鼠IL-6 ELISA试剂盒（货号：MM-0163M1）、小鼠IL-10 ELISA试剂盒（货号：MM-0176M1）、小鼠分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）ELISA试剂盒（货号：MM-0430M1）均购自江苏酶免实业有限公司。

1.4　实验仪器

倒置显微镜（Leica DM4000B）、石蜡切片机（RM2235）购自德国Leica公司；高速冷冻离心机（Keraeus Multifuge X1R）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；酶标仪（Infinite M200）购自德国Tecan仪器有限公司；生物组织自动脱水机（ZT-14S）、生物组织石蜡包埋机（YB-6LF）均购自湖北孝感医用电子技术有限公司；微量迷你离心机（FC5306）购自上海奥豪斯仪器有限公司；迷你混合仪（MIX-25P）购自杭州米欧仪器有限公司。

1.5　方法

1.5.1　SPF小鼠4T1乳腺癌模型构建

经过3 d适应性饲养，将32只BALB/c小鼠于右侧第三对乳头脂肪垫处，皮下注射0.1 mL 4T1乳腺癌细胞，接种的密度为1×10⁷个/mL，每天观察小鼠成瘤情况。接种后7 d，瘤块体积50～100 mm³，表明模型构建成功。

1.5.2　实验动物分组与干预

造模后，采用Excel软件随机分为对照组、清解扶正颗粒组（QFG组）、化疗组（TC组）、化疗＋清解扶正颗粒组（TC＋QFG组），每组8只。对照组以无菌生理盐水灌胃，1次/d；腹腔注射无菌生理盐水，1次/周。QFG组按1 g/kg清解扶正颗粒灌胃，1次/d；腹腔注射无菌生理盐水，1次/周。TC组腹腔注射多西他赛（15 mg/kg）与环磷酰胺（20 mg/kg），1次/周；无菌生理盐水灌胃，1次/d。TC＋QFG组腹腔注射多西他赛和环磷酰胺，1次/周；1 g/kg清解扶正颗粒灌胃，1次/d，灌胃与腹腔注射间隔0.5 h进行。每组均持续干预4周。末次干预24 h后均用戊巴比妥钠麻醉，经眼球取血后，快速取出回肠组织，用无菌冷生理盐水冲洗。裁剪为0.5 cm×0.5 cm的样品，一部分浸泡在4%多聚甲醛中固定，组织脱水并行石蜡包埋，用于组织病理学及免疫组化等分析；另一部分保存于-80 ℃冰箱用于Western blot分析。

1.5.3　观察指标

1.5.3.1　体质量、腹泻评分和瘤体体积

干预后，每2 d测量所有小鼠体质量，计算体质量增长率；每周化疗当日连续观察6 h小鼠腹泻情况，每小时记录，取平均值；每3 d观察瘤体体积的增长情况。参照GARSED等^［12］腹泻评分方法评估腹泻情况，0分：无腹泻（粪便正常或无粪便）；1分：轻度腹泻（粪便稍湿和软）；2分：中度腹泻（粪便湿和粪便不成形伴中度肛周被毛染色）；3分：重度腹泻（粪便水样伴重度肛周被毛染色）。

体质量增长率（%）＝（最终体质量－初始体质量）/初始体质量×100%

瘤体体积（V）＝π/6×L（长径）×W²（短径）

1.5.3.2　苏木精-伊红染色检测回肠黏膜组织形态学改变

将回肠组织石蜡块切成4 μm的薄片，固定于载玻片，标记后置于烘箱（60 ℃）烘干，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、梯度乙醇、超纯水Ⅰ、超纯水Ⅱ进行脱蜡与水化；苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，流水冲洗后，将切片再次放入梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，封片，于倒置显微镜下观察回肠黏膜组织形态并采集图像。

1.5.3.3　ELISA法检测血清中DAO、D-LA、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、sIgA含量

应用ELISA试剂盒说明书方法进行检测，将小鼠血样离心后取上清，再按照1∶5稀释样本，完成ELISA试剂盒中上样样本的制备，按试剂盒说明书步骤进行实验。

1.5.3.4　TUNEL染色法检测回肠黏膜组织细胞凋亡

将包埋的回肠组织蜡块用石蜡切片机切片，梯度脱水后，按TUNEL检测试剂盒说明书操作。TUNEL阳性细胞判定标准如下：光镜下细胞核呈棕黄色的细胞判定为凋亡细胞。每张切片随机选取5个400倍视野，计数阳性细胞数，以各视野阳性细胞数与总细胞数的百分比计算凋亡细胞的阳性率。

凋亡细胞阳性率（%）＝（阳性细胞数/总细胞数）×100%

1.5.3.5　免疫组织化学染色观察回肠黏膜组织中IgA⁺、ZO-1和Occludin的阳性表达情况

将石蜡切片脱蜡至水化，采用柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）进行抗原修复，参照免疫组化试剂盒说明书进行操作。封片后，每个样本在200倍镜下随机选取5个视野，以出现棕黄色颗粒状作为阳性表达情况的判断标准。结果采用阳性细胞率进行半定量分析。

1.5.3.6　Western blot检测回肠黏膜组织TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平

用裂解液提取组织蛋白，离心取上清（即蛋白提取液）。样品中蛋白质浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。经变性后，每个样本取40 μg蛋白上样，采用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转法转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在37 ℃封闭1 h，洗涤后孵育一抗（TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65），4 ℃过夜。1∶10 000二抗孵育1 h，ECL显色液显影。采用ImageJ软件分析条带灰度值。

1.6　统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据分析。计量资料数据服从正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐组间两两比较采用LSD-t法，若方差不齐采用Tamhane's T2法；计量资料不符合正态分布以M（P₂₅，P₇₅）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1　4组体质量及腹泻评分比较

与对照组比较，TC组干预第23、25、27天体质量均出现明显下降（P＜0.05），干预第1、8、15、22天腹泻评分均明显升高（P＜0.05）；QFG组体质量、腹泻评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。与TC组比较，TC＋QFG组干预第27天体质量明显升高（P＜0.05），干预第1、8天腹泻评分明显降低（P＜0.05），其余时间点体质量、腹泻评分差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2　4组移植瘤瘤体体积比较

与对照组比较，TC组干预第13、22、25、28天移植瘤瘤体体积均明显减小（P＜0.05），QFG组在干预第13、25、28天也出现明显减小（P＜0.05），TC＋QFG组干预第13天及之后的所有时间点均明显减小（P＜0.05）。见图2。

2.3　4组回肠组织病理形态学变化

对照组、QFG组均未见明显的肠黏膜损伤，肠黏膜结构完整，细胞排列整齐规则，可见散在杯状细胞，未见炎细胞浸润。与对照组比较，TC组回肠黏膜上皮细胞水肿、坏死，绒毛变短、断裂，隐窝变深、扭曲，可见炎细胞浸润；与TC组比较，TC＋QFG组肠黏膜组织结构明显改善，肠黏膜上皮细胞水肿缓解，肠绒毛变高且排列稍规则，隐窝深度变浅，炎细胞浸润减少。形态计量学分析结果显示，与对照组比较，TC组肠绒毛高度、绒毛/隐窝比均明显降低（P＜0.05），隐窝深度明显升高（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组肠绒毛高度、绒毛/隐窝比均明显升高（P＜0.05），隐窝深度明显降低（P＜0.05）。见图3。

2.4　4组回肠黏膜组织ZO-1和Occludin蛋白表达水平比较

与对照组比较，TC组小鼠回肠黏膜组织ZO-1和Occludin蛋白表达明显减少（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组干预后小鼠回肠黏膜组织ZO-1和Occludin蛋白表达明显增加（P＜0.05）。见图4。

2.5　4组血清DAO和D-LA含量比较

与对照组比较，TC组血清DAO和D-LA含量明显升高（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组干预后血清DAO和D-LA含量明显降低（P＜0.05）。见表1。

2.6　4组血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量比较

与对照组比较，TC组血清IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ含量明显升高（P＜0.05），IL-2、IL-4和IL-10含量明显降低（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组血清IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ含量明显降低（P＜0.05），IL-2、IL-4和IL-10含量明显升高（P＜0.05）。见表2。

2.7　4组回肠黏膜组织细胞凋亡比较

与对照组比较，TC组小鼠回肠黏膜组织中的细胞核黄染明显增加，染色阳性率明显升高（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组细胞核黄染明显减少，染色阳性率明显降低（P＜0.05）。见图5。

2.8　4组血清sIgA含量及回肠黏膜组织IgA^＋细胞数比较

与对照组比较，TC组血清sIgA含量及回肠黏膜组织IgA^＋细胞数均明显减少（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组干预后血清sIgA含量和回肠黏膜组织IgA^＋细胞数均明显升高（P＜0.05）。见图6。

2.9　4组回肠黏膜组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达水平

与对照组比较，TC组回肠黏膜组织TLR4、p-NF-κB蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）；与TC组比较，TC＋QFG组回肠黏膜组织TLR4、p-NF-κB蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）。见图7。

3 讨 论

3.1　清解扶正颗粒可减轻乳腺癌模型小鼠TC化疗所致肠黏膜损伤

本研究结果显示，与TC组比较，TC＋QFG组干预第1、8天腹泻评分明显降低，肠黏膜组织结构明显改善，肠黏膜上皮细胞水肿缓解，肠绒毛变高且排列稍规则，隐窝深度变浅，炎细胞浸润减少，细胞核黄染明显减少，染色阳性率明显降低，这提示清解扶正颗粒可减轻乳腺癌模型小鼠TC化疗所致肠黏膜损伤。这可能与以下因素有关：乳腺癌属中医学“乳岩”范畴，化疗药物等“外邪”入侵可损伤脏腑和气血，导致热毒内盛、气血亏虚，这是乳腺癌化疗主要的病机因素。有研究显示，中药（主要包括清热药、补虚药等）联合化疗治疗乳腺癌具有良好疗效^［13］。清解扶正颗粒由白花蛇舌草、半枝莲、炙黄芪、炒麦芽等清热解毒和扶正补虚2类药物组成，契合乳腺癌化疗患者的病机。肠黏膜损伤为乳腺癌化疗引起消化道反应的原因之一，而黏膜炎症和细胞凋亡是化疗引起肠黏膜损伤的重要机制之一。清解扶正颗粒可改善化疗所致的肠黏膜炎，减轻肠黏膜细胞凋亡，从而缓解化疗所致肠黏膜损伤。这与课题组前期研究显示清解扶正颗粒加味可减轻乳腺癌化疗引起的腹泻等消化道反应以及5-氟尿嘧啶化疗引起肠黏膜炎的结果相似。

3.2　清解扶正颗粒可改善乳腺癌模型小鼠肠黏膜肠上皮细胞结构和肠道稳态

本研究结果显示，与TC组比较，TC＋QFG组干预后回肠黏膜组织ZO-1和Occludin蛋白表达明显增加，血清DAO和D-LA含量明显降低，这提示清解扶正颗粒可改善乳腺癌模型小鼠肠上皮细胞结构和肠道稳态。这可能与以下因素有关：① 增强肠上皮细胞的紧密连接，抑制肠黏膜通透性增加。肠黏膜上皮细胞和上皮细胞间的紧密连接构成机械屏障，是肠黏膜屏障功能的重要结构基础，可防止肠道内有害物质和病原体进入机体内环境^［14-15］。Occlidun和ZO-1作为紧密连接的主要蛋白标记物，其表达水平可反映肠上皮屏障结构状态。其表达下降提示肠黏膜结构损伤，肠上皮细胞通透性增加^［16-17］。清解扶正颗粒可增强肠上皮细胞的紧密连接，抑制化疗引起的肠黏膜通透性增加，缓解肠黏膜上皮屏障损伤。② 改善肠黏膜屏障结构，维护肠道稳态。DAO、D-LA是评价肠道通透性改变的重要生物标志物，当肠黏膜屏障结构被破坏时，DAO、D-LA释放增加，含量升高^［18-19］。化疗药物可导致乳腺癌小鼠肠黏膜上皮细胞损伤，破坏细胞间的紧密连接，导致代谢产物堆积，增加肠道通透性，使细菌和内毒素移位，引发全身炎症和肠道运动障碍^［20］。清解扶正颗粒可减轻化疗所致肠上皮屏障损伤，改善肠上皮通透性，有利于维护肠道稳态。

3.3　清解扶正颗粒减轻乳腺癌化疗所致肠黏膜损伤可能与调控Th1/Th2平衡有关

本研究结果显示，与TC组比较，TC＋QFG组干预后血清IL-1β、TNF-α、IL-6和IFN-γ含量均明显降低，IL-2、IL-4和IL-10含量均明显升高，血清sIgA含量和回肠黏膜组织IgA^＋细胞数均明显升高，这提示清解扶正颗粒减轻乳腺癌化疗所致肠黏膜损伤可能与调控Th1/Th2平衡有关。可能与以下因素有关：① 清解扶正颗粒可增加sIgA分泌。化疗导致乳腺癌模型小鼠回肠组织黏膜结构、完整性明显受到破坏，大量炎性细胞浸润，黏膜内的IgA^＋细胞含量明显减少。而sIgA由肠黏膜中IgA^＋浆细胞分泌，当肠黏膜免疫屏障受损时，分泌型免疫球蛋白sIgA表达明显减少^［21］，无法阻止肠道微生物和毒素入侵，破坏肠黏膜免疫稳态，肠道免疫屏障功能明显降低^［22］。清解扶正颗粒干预后，化疗所致乳腺癌肠黏膜炎小鼠IgA^＋细胞增加，sIgA分泌增加，肠黏膜免疫应答明显改善，黏膜免疫功能逐步恢复。② 清解扶正颗粒可调控Th1/Th2平衡。sIgA的合成、分泌以及sIgA介导的免疫应答主要受肠黏膜相关淋巴组织的T细胞及其分泌的细胞因子调节。Th1、Th2细胞分泌的细胞因子IL-2、IL-4和IL-10可增强sIgA产生或IgA分泌，IFN-γ也参与对sIgA的调节，从而增强肠黏膜免疫功能^［23］。清解扶正颗粒干预后，IL-2、IL-4和IL-10表达明显升高，sIgA分泌增加，Th1/Th2平衡得到改善，调节sIgA分泌，改善肠黏膜免疫功能，减轻肠黏膜损伤。

3.4　清解扶正颗粒减轻乳腺癌化疗所致肠黏膜损伤可能与调控TLR4/NF-κB信号通路介导炎症反应有关

本研究结果显示，与TC组比较，TC＋QFG组回肠黏膜组织TLR4和p-NF-κB蛋白表达水平均明显降低，这提示清解扶正颗粒减轻乳腺癌化疗所致肠黏膜损伤可能与调控TLR4/NF-κB信号通路介导炎症反应有关。可能与以下因素有关：乳腺癌化疗所致肠黏膜损伤与TLR4通过信号传导分子激活NF-κB信号通路有关，NF-κB通路被激活后，参与炎症细胞因子调控，诱导TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子表达，引发一系列炎症级联反应，导致肠上皮细胞损伤，诱导细胞凋亡，破坏肠上皮紧密连接，从而直接或间接改变肠道通透性，造成肠黏膜屏障损伤^［24-30］。TLR4/NF-κB通路激活可能在化疗所致的肠黏膜炎发生、发展过程中发挥重要作用。清解扶正颗粒干预后，可能会抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，促使TLR4、p-NF-κB蛋白及TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子表达减少，从而缓解乳腺癌化疗所致肠黏膜炎小鼠腹泻和肠黏膜损伤。

4 小 结

清解扶正颗粒可能通过调控TLR4/NF-κB信号通路调节炎症细胞因子表达，抑制肠黏膜炎症反应，减少肠黏膜上皮细胞凋亡，增强肠黏膜上皮屏障及免疫屏障功能，改善乳腺癌小鼠多西他赛联合环磷酰胺化疗所致肠黏膜损伤。中药复方具有成分复杂、作用靶点多样的特点，清解扶正颗粒对乳腺癌移植瘤小鼠化疗所致肠黏膜损伤的保护作用的药效成分及作用机制尚未完全阐明，下一步还需要从肠黏膜免疫、中药复方与化疗药物协同作用等角度进一步探讨其治疗肿瘤效果和作用机制，为清解扶正颗粒抗肿瘤相关治疗提供参考。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(81703913)

福建省自然科学基金面上项目(2021J01907)