基于AMPK/mTOR通路调控氧化应激探讨电针治疗原发性痛经大鼠的作用机制

Mechanism of Electroacupuncture Treatment on Primary Dysmenorrhea in Rats Based on AMPK/mTOR Pathway Regulating Oxidative Stress

摘要

目的 探讨电针三阴交穴对原发性痛经（PDM）模型大鼠疼痛症状及子宫组织损伤的影响，并分析其潜在的作用机制。 方法 选取60只SPF级雌性SD大鼠，按随机数字表法分为空白组、模型组、假电针组、电针组和药物组，每组12只。空白组不做干预，其余4组均通过苯甲酸雌二醇联合缩宫素制备周期性PDM大鼠模型。从造模第4天起，电针组电针双侧三阴交穴，25 min/次，1次/d，持续5 d；空白组和模型组进行抓取捆绑处理，不进行干预；假电针组于双侧三阴交穴旁开2 mm处针刺，留针25 min/次，1次/d，持续5 d；药物组给予布洛芬灌胃治疗，1次/d，持续5 d。干预结束后，采用动物行为学评估法评估大鼠疼痛反应；采用HE染色法对大鼠子宫组织进行病理学变化分析；采用酶联免疫吸附试验（ELASA）法检测大鼠血清中前列腺素E₂（PGE₂）、前列腺素F₂α（PGF₂α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）含量；采用二氢乙啶（DHE）免疫荧光探针活性氧（ROS）染色法检测大鼠子宫组织ROS含量；采用蛋白质印迹技术（WB）分析大鼠子宫组织中腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及其磷酸化形式的表达水平。 结果 ① 行为学指标：与空白组比较，模型组、假电针组、电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数和扭体潜伏期均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数均明显更低（P＜0.05），扭体潜伏期均明显更长（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数均明显更低（P＜0.05），扭体潜伏期均明显更长（P＜0.05）。② 子宫组织病理损伤评分：与空白组比较，模型组和假电针组干预后子宫组织病理损伤评分均明显增加（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后子宫组织病理损伤评分均明显降低（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织病理损伤评分均明显降低（P＜0.05）。③ PGE₂、PGF₂α、SOD、MDA和GSH-Px含量：与空白组比较，模型组、假电针组干预后血清PGE₂、SOD和GSH-Px含量均明显更低（P＜0.05），MDA、PGF₂α含量和PGF₂α/PGE₂均明显更高（P＜0.05）；电针组和药物组干预后PGF₂α含量和PGF₂α/PGE₂均明显更高（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后血清PGE₂、SOD和GSH-Px含量均明显更高（P＜0.05），PGF₂α、MDA含量和PGF₂α/PGE₂均明显更低（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后血清PGE₂、SOD和GSH-Px含量均明显更高（P＜0.05），PGF₂α、MDA含量和PGF₂α/PGE₂均明显更低（P＜0.05）。④ ROS表达水平：与空白组比较，模型组、假电针组、电针组和药物组干预后子宫组织ROS含量均明显更高（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后子宫组织ROS含量均明显更低（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织ROS含量明显更低（P＜0.05）。⑤ AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR蛋白表达水平：与空白组比较，模型组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK明显更高（P＜0.05），p-mTOR/mTOR明显更低（P＜0.05）。与模型组比较，电针组与药物组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK均明显更低（P＜0.05），p-mTOR/mTOR均明显更高（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK均明显更低（P＜0.05），p-mTOR/mTOR均明显更高（P＜0.05）。 结论 电针三阴交穴可有效缓解PDM模型大鼠疼痛症状和子宫组织损伤，这可能与调控AMPK/mTOR信号通路、抑制氧化应激反应有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of electroacupuncture at Sanyinjiao (SP6) acupoint on pain symptoms and uterine tissue damage in a rat model of primary dysmenorrhea (PDM), and to elucidate its potential mechanisms. Methods A total of 60 SPF-grade female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly assigned into blank group, model group, sham electroacupuncture (EA) group, EA group, and medication group, with 12 rats in each group. The blank group received no intervention, while the other four groups were subjected to a cyclic PDM animal model by subcutaneous injections of estradiol benzoate followed by oxytocin administration. Starting from the 4th day of model establishment, the EA group received electroacupuncture at the bilateral Sanyinjiao (SP6) acupoints for 25 minutes per session, once daily for five consecutive days. The blank group and the model group underwent grasping and restraint procedures without any therapeutic intervention. The sham EA group received needle insertion at sites 2 mm lateral to the bilateral SP6 acupoints, with needles retained for 25 minutes per session, once daily for five days. The medication group received intragastric administration of ibuprofen once daily for five days. After intervention, animal behavior assessment was used to evaluate pain response; hematoxylin-eosin (HE) staining was used to analyze histopathological changes in uterine tissues. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of prostaglandin E₂ (PGE₂), prostaglandin F₂α (PGF₂α), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum. Dihydroethidine (DHE) immunofluorescence staining was used to detect reactive oxygen species (ROS) content in rat uterine tissues.Western blot (WB) was used to determine the expression levels of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), mammalian target of rapamycin (mTOR), and their phosphorylated forms in rat uterine tissues. Results (1) Behavior indexs: compared with the blank group, the writhing scores, frequencies, and latency in the model group, the sham EA group, the EA group and the medication group increased significantly after intervention (P0.05). Compared with the model group, the writhing scores and frequencies in the EA group and the medication group were significantly lower after intervention (P0.05), and the writhing latency was significantly longer (P0.05). Compared with the sham EA group, the writhing scores and frequencies in the EA group and the medication group were significantly lower after intervention (P0.05), and the writhing latency was significantly longer (P0.05). (2) Uterine histopathological injury scores: compared with the blank group, the uterine histopathological injury scores in the model group and the sham EA group increased significantly after intervention (P0.05). Compared with the model group, the uterine histopathological scores in the EA group and the medication group decreased significantly after intervention (P0.05). Compared with the sham EA group, the uterine histopathological scores in the EA group and the medication group decreased significantly after intervention (P0.05). (3) Contents of PGE₂, PGF₂α, SOD, MDA and GSH-Px: compared with the blank group, the contents of serum PGE₂, SOD and GSH-Px in the model group and the sham EA group were significantly lower (P0.05), while the contents of MDA, PGF₂α and PGF₂α/PGE₂ were significantly higher after intervention (P0.05); the contents of PGF₂α and PGF₂α/PGE₂ were significantly higher in the EA group and the medication group after intervention (P0.05). Compared with the model group, the contents of serum PGE₂, SOD and GSH-Px in the EA group and the medication group were significantly higher after intervention (P0.05), while the contents of PGF₂α, MDA and PGF₂α/PGE₂ were significantly lower (P0.05). Compared with the sham EA group, the serum levels of PGE₂, SOD and GSH-Px in the EA group and the medication group were significantly higher after intervention (P0.05), while the serum levels of PGF₂α, MDA and PGF₂α/PGE₂ were significantly lower (P0.05). (4) ROS expression level: compared with the blank group, the uterine ROS contents in the model group, the sham EA group, the EA group and the medication group were significantly higher after intervention (P0.05). Compared with the model group, the uterine ROS contents were significantly lower in the EA group and the medication group after intervention (P0.05). Compared with the sham EA group, the uterine ROS levels in the EA group and the medication group were significantly lower after intervention (P0.05). (5) Protein expression levels of AMPK, mTOR, p-AMPK and p-mTOR: compared with the blank group, the p-AMPK/AMPK in uterine tissue of the model group was significantly higher (P0.05), and the p-mTOR/mTOR was significantly lower (P0.05). Compared with the model group, the uterine tissue p-AMPK/AMPK was significantly lower (P0.05) and p-mTOR/mTOR was significantly higher in the EA group and the medication group after intervention (P0.05). Compared with the sham EA group, the uterine tissue p-AMPK/AMPK was significantly lower (P0.05) and p-mTOR/mTOR was significantly higher in the EA group and the medication group after intervention (P0.05). Conclusion Electroacupuncture at Sanyinjiao (SP6) acupoint can effectively alleviate pain and uterine tissue injury in PDM rat models, which may be associated with the modulation of the AMPK/mTOR signaling pathway and suppression of oxidative stress response.

Graphical abstract

关键词

原发性痛经 / 电针 / 三阴交穴（SP6） / AMPK/mTOR信号通路 / 氧化应激

Key words

primary dysmenorrhea / electroacupuncture / Sanyinjiao (SP6) acupoint / AMPK/mTOR signaling pathway / oxidative stress

原发性痛经（primary dysmenorrhea，PDM）是指女性在排除器质性病变情况下出现的月经期下腹疼痛，其症状一般表现为经期前或经期开始时出现下腹部痉挛性疼痛，疼痛强度以及持续时间不定，疼痛范围甚至可辐射至大腿根部或腰背部^［1-2］。据报道，在全世界25岁以下年轻女性中，约有3/4患有PDM^［3］。PDM已经严重影响广大女性的日常生活质量，亟需寻找有效治疗方法。

电针三阴交穴是临床上治疗PDM常选用的治疗方法，在缓解PDM患者的疼痛方面具有良好的疗效，甚至优于非甾体抗炎药^［4］。中医学理论认为，肝、脾、肾三经与胞宫联系密切，三阴交是肝、脾、肾三经交会穴，是针灸临床治疗PDM使用频率最高的穴位^［5］。近年来，随着对PDM病理机制认识的深化，氧化应激与缺血、缺氧被证实是其发生、发展的关键环节，且与腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的调控密切相关^［6-9］。该通路不仅参与氧化应激反应，还在女性生殖系统功能调节中发挥核心作用^［10-12］。目前研究已初步证实电针三阴交穴可以缓解PDM疼痛，并在调节部分炎症与氧化指标上表现出积极效果，但是其是否通过调控AMPK/mTOR通路抑制氧化应激从而改善PDM，尚未有系统研究阐明，这限制了对电针治疗PDM深层机制的理解及其临床应用的进一步优化。

因此，本研究在明确电针三阴交穴镇痛效果的基础上，探讨电针对PDM氧化应激损伤的保护作用，并分析其与AMPK/mTOR通路间的联系，旨在揭示电针是否通过调控该通路影响PDM过程中的氧化应激反应，为电针治疗PDM提供理论依据。

1 材料和方法

1.1　实验动物与分组

本研究选用60只SPF级雌性SD（sprague-dawley）大鼠作为实验对象，鼠龄7～8周，体质量180～220 g。实验动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，在湖南中医药大学实验动物中心的标准条件下进行饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009，室内温度维持在20～25 ℃，相对湿度控制在70%～80%。光照周期设置为12 h明暗交替（光照时间为8：00—20：00），实验动物可自由获取饲料和饮用水。所有入选大鼠均处于未孕状态，健康状况良好。大鼠经过1周适应性饲养后，按随机数字表法分为空白组、模型组、假电针组、电针组和药物组，每组12只。

1.2　主要实验试剂

缩宫素（货号：P1029）、苯甲酸雌二醇（货号：S4110）、PEG300抑制剂（货号：S6704）、Tween80抑制剂（货号：S6702）均购自美国Selleck生物科技有限公司；布洛芬缓释片（中美天津史克制药有限公司，货号：H20013062，规格：0.4 g/粒）；瑞氏染色液（北京雷根生物技术有限公司，货号：0312A24）；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染液套装（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色试剂（货号：G1012）、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）（货号：G0002-2L）、组织自发光淬灭剂（货号：G1221）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）探针（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：S0033M）；大鼠前列腺素E₂（prostaglandin E₂，PGE₂）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：ZC-37100）、前列腺素F₂α（prostaglandin F₂α，PGF₂α）ELISA试剂盒（货号：ZC-37104）、大鼠谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA试剂盒（货号：ZC-36648）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA试剂盒（货号：ZC-36451）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA试剂盒（货号：ZC-55718-J）均购自上海茁彩生物科技有限公司；β-肌动蛋白（β- actin抗体）（货号：4970）、AMPK抗体（货号：5831）、p-AMPK抗体（货号：2535）、雷帕霉素机制靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）抗体（货号：2983）、p-mTOR抗体（货号：5536）均购自美国Cell Signaling Technology公司；山羊-抗兔二抗（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：A-1003）。

1.3　主要实验仪器

脱水机（意大利米兰Diapath S.p.A公司，型号：Donatello）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）；组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：KD-P）；染色机（意大利米兰Diapath S.p.A公司，型号：Giotto）；烤箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司，型号：GFL-230）；冰冻切片机（型号：NX50）、酶标仪（型号：Rayto RT-6100/MD-SpectraMax 190）均购自赛默飞世尔科技公司；旋涡混匀仪（江苏新康医疗器械有限公司，型号：XK80-A）；掌上离心机（美国SCLOGEX公司，型号：S1010E）；转膜仪（美国Biorad公司，型号：041BR318885）；电泳仪（美国Biorad公司，型号：041BR318885）；干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9148A）；奥林巴斯扫描仪（日本Olympus公司，型号：VS200）；电针仪、一次性无菌针灸针（中国华佗国药股份有限公司，型号：SDZ-Ⅱ，规格：0.25 mm×25 mm）。

1.4　实验方法

1.4.1　造模方法

大鼠适应性喂养7 d后，采用阴道瑞氏染色涂片法筛选处于动情间期的未交配SD雌性大鼠，注射苯甲酸雌二醇和缩宫素联合制备周期性PDM大鼠模型^［13］。

1.4.1.1　模型组、假电针组、电针组和药物组

连续3 d，每天给予大鼠苯甲酸雌二醇皮下注射（2 mg/kg，浓度0.5 mg/mL），随后于第4天和第8天腹腔注射缩宫素（5 mg/mL，用0.9% NaCl溶液配制），每只0.4 mL/次。

1.4.1.2　空白组

连续3 d皮下注射0.9% NaCl溶液（2 mg/kg），随后于第4天和第8天腹腔注射0.4 mL 0.9% NaCl溶液。

PDM动物模型的成功标准通过以下行为学指标进行判定：在给予缩宫素处理后，实验大鼠若表现出腹部肌肉收缩内凹、脊柱与后肢呈伸展状态，并伴有单侧肢体旋转等典型疼痛反应，即可确认模型构建成功^［14］。实验方案经湖南中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（审批号：HNUCM21-2311-08），实验设计与实施完全遵照《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892—2018）执行。

1.4.2　干预方法

1.4.2.1　空白组和模型组

从造模的第4天开始进行抓取捆绑处理，在鼠架上捆绑25 min，1次/d，只捆绑，不进行干预。

1.4.2.2　假电针组

从造模第4天起干预，固定大鼠后，于双侧三阴交穴旁开2 mm处消毒，用0.25 mm×25 mm毫针直刺5 mm（不接电针），留针25 min/次，1次/d，持续5 d。穴位定位依据中国针灸学会实验针灸委员会发布的实验动物腧穴标准图谱，其中三阴交穴位于大鼠后肢内踝尖上方10 mm处^［15］。

1.4.2.3　电针组

从造模第4天起电针双侧三阴交穴，消毒后同规格毫针直刺5 mm，连接电针仪（密波，50 Hz），调节强度至局部肌肉轻微颤动但无明显鸣叫，25 min/次，1次/d，持续5 d。

1.4.2.4　药物组

从造模第4天起接受布洛芬治疗，将药物溶解于0.9% NaCl溶液制成1.25 mg/mL溶液，按0.8 mL/只的剂量经口灌胃给药，1次/d，持续5 d。

1.4.3　观察指标

1.4.3.1　行为学指标评估

采用动物行为学评估法评估大鼠疼痛反应^［14］。具体操作如下：在实验第8天给予缩宫素注射后30 min内，观察疼痛相关行为指标。记录参数包括：扭体潜伏期（即给药至首次出现扭体反应的时间间隔）、扭体次数（当大鼠呈现以下任何一个症状：腹侧内收、腹壁下陷、臀部上抬、躯体扭转或后肢伸直，均记为1次扭体次数）以及扭体评分（0分：正常活动及探索行为，肢体自然伸展；1分：腹部内收伴躯体侧倾；2分：后肢伸直伴足背屈曲及骨盆旋转；3分：腹肌强直收缩伴后肢后伸及躯体僵直扭转）。

1.4.3.2　子宫组织病理损伤评分

采用HE染色法对大鼠子宫组织进行病理学观察与评估。子宫组织样本首先在4%多聚甲醛固定液中室温固定24 h，随后依次进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明，最后完成石蜡包埋。首先，组织切片制备与染色，5 μm厚纵切切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇复水；然后，进行HE染色（苏木精3～5 min，分化，流水返蓝5 min，伊红5 min）；最后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。待标本充分晾干后，利用光学显微技术对子宫组织进行结构学观察与分析。参照WEI等^［16］评分体系，基于显微观察结果对子宫病理损伤程度进行分级评估。0分：组织结构正常；1分：子宫内膜上皮细胞变性/坏死；2分：子宫内膜固有层水肿；3分：固有层腺体增生；4分：固有层炎性浸润；5分：炎症累及肌层。

1.4.3.3　PGE₂、PGF₂α、SOD、MDA、GSH-Px含量

采用ELASA法检测大鼠血清中PGE₂、PGF₂α、SOD、MDA和GSH-Px含量。采用腹主动脉穿刺法采集大鼠血液样本约5 mL，置于室温环境静置10～20 min待其自然凝固。随后将样本置于离心机中，离心约30 min（2 000～3 000 r/min，离心半径15 cm）。分离获得的上清液分装至微量离心管中，密封后标记样本信息，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。检测时参照试剂盒操作指南，使用酶标仪在450 nm波长下测定样本吸光度，通过标准曲线定量分析样本中PGF₂α、PGE₂、SOD、MDA及GSH-Px的含量。

1.4.3.4　ROS表达水平

采用二氢乙啶（dihydroe-thidium，DHE）免疫荧光探针ROS染色法检测大鼠子宫组织ROS含量。将获取的大鼠子宫组织用最佳切割温度包埋剂（optimal cutting temperature compoun，OCT）进行包埋处理，冰冻切片恢复至室温，控干水分；用组化笔在组织周围画圈，加自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min，加ROS染液，避光恒温孵育30 min后用PBS洗3次，5 min/次，洗完后进行封片（抗荧光淬灭封片剂封片）。用奥林巴斯扫描仪和奥林巴斯数字扫描浏览软件进行扫描和取图，最后用ImageJ分析图像，计算每组平均荧光强度值。

1.4.3.5　AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR蛋白表达水平

采用蛋白质印迹技术（Western blot，WB）分析大鼠子宫组织中AMPK、mTOR蛋白及其磷酸化形式的表达水平。从-80 ℃低温冰箱中取出预先保存的子宫样本，进行蛋白质提取操作。采用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）测定蛋白样品浓度，随后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，通过转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，将膜置于封闭液中处理，先后与一抗、二抗进行孵育反应，最后在暗室条件下进行ECL化学发光显影。以β-actin作为内参，通过计算AMPK、mTOR、p-AMPK和p-mTOR条带灰度值与内参的比值，确定各目标蛋白表达水平。

1.5　统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料服从正态分布采用（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐组间两两比较使用LSD-t检验；若方差不齐两两比较采用Dunnett's T3法。计量资料不服从正态分布，采用M（P₂₅，P₇₅）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1　5组干预后行为学指标比较

与空白组比较，模型组、假电针组、电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数和扭体潜伏期均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数均明显更低（P＜0.05），扭体潜伏期均明显更长（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数均明显更低（P＜0.05），扭体潜伏期均明显更长（P＜0.05）。见表1。

2.2　5组干预后子宫组织病理损伤评分比较

空白组大鼠子宫组织呈现典型生理结构特征，内膜上皮细胞层排列整齐有序，未见中性粒细胞浸润现象；模型组呈现明显病理改变，包括上皮细胞空泡变性死亡、固有层腺体扩张及大量中性粒细胞浸润、肌层平滑肌粒细胞散在分布；假电针组呈现大量子宫内膜上皮脱落、固有层裸露及少量炎性浸润；电针组仅见少量上皮细胞变性死亡、固有层腺体扩张及中性粒细胞浸润；药物组子宫组织损伤程度最为轻微，仅观察到局部区域存在少量上皮细胞形态学改变及散在的中性粒细胞浸润。组织学检测结果显示，除模型组外，其余各组子宫肌层平滑肌纤维均呈现规则有序的排列特征。见图1。

与空白组比较，模型组和假电针组干预后子宫组织病理损伤评分均明显增加（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后子宫组织病理损伤评分均明显降低（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织病理损伤评分均明显降低（P＜0.05）。见表2。

2.3　5组干预后PGE₂、PGF₂α、SOD、MDA和GSH-Px含量比较

2.3.1　5组干预后PGF₂α、PGE₂含量比较

与空白组比较，模型组和假电针组干预后血清PGE₂含量均明显更低（P＜0.05），PGF₂α含量、PGF₂α/PGE₂均明显更高（P＜0.05）；电针组和药物组干预后PGF₂α含量、PGF₂α/PGE₂均明显更高（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后血清PGE₂含量均明显更高（P＜0.05），PGF₂α含量和PGF₂α/PGE₂均明显更低（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后血清PGE₂含量均明显更高（P＜0.05），PGF₂α含量、PGF₂α/PGE₂均明显更低（P＜0.05）。见表3。

2.3.2　5组血清MDA、SOD和GSH-Px含量比较

与空白组比较，模型组和假电针组干预后血清MDA含量均明显更高（P＜0.05），SOD和GSH-Px含量均明显更低（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后血清MDA含量均明显更低（P＜0.05），SOD和GSH-Px含量均明显更高（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后血清MDA含量明显更低（P＜0.05），SOD和GSH-Px含量均明显更高（P＜0.05）。见表4。

2.4　5组子宫组织ROS含量比较

与空白组比较，模型组、假电针组、电针组和药物组干预后子宫组织ROS含量均明显更高（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后子宫组织ROS含量均明显更低（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织ROS含量均明显更低（P＜0.05）。见图2、表5。

2.5　5组干预后子宫组织AMPK和mTOR蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK明显更高（P＜0.05），p-mTOR/mTOR明显更低（P＜0.05）。与模型组比较，电针组和药物组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK均明显更低（P＜0.05）、p-mTOR/mTOR均明显更高（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK均明显更低（P＜0.05），p-mTOR/mTOR均明显更高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表6、图3。

3 讨 论

3.1　电针三阴交穴可有效缓解PDM大鼠疼痛症状和子宫组织损伤

与模型组比较，电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数和子宫组织病理损伤评分均明显更低，扭体潜伏期均明显更长。与假电针组比较，电针组和药物组干预后扭体评分、扭体次数和子宫组织病理损伤评分均明显更低，扭体潜伏期干预后明显更长。这提示，电针三阴交穴能有效缓解PDM大鼠模型疼痛症状和子宫组织损伤。这可能与以下因素有关：痛经多责之“不通则痛”或“不荣则痛”，病机常与肝、脾、肾三脏功能失调及冲任二脉气血运行不畅密切相关^［17］。三阴交为足太阴脾经要穴，且为足三阴经（肝、脾、肾）交会之处，具有健脾益气、疏肝理气、滋肾调经、调和气血等功效，常作为妇科疾病的经验效穴。刺激该穴可通达三阴，调理冲任，缓解胞宫气血瘀滞或失养状态，从而减轻疼痛^［18-19］。电针三阴交穴可舒张子宫平滑肌，改善局部微循环，减轻子宫组织的病理损伤程度，降低扭体反应，缓解疼痛程度。这与袁菡钰等^［20-21］研究结果相似。

3.2　电针三阴交穴缓解PDM大鼠疼痛症状和子宫组织损伤可能与抑制氧化应激反应有关

本研究结果显示，与模型组比较，电针组和药物组干预后血清MDA、ROS、PGF₂α含量和PGF₂α/PGE₂均明显更低（P＜0.05），PGE₂、SOD、GSH-Px含量均明显更高（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后血清MDA、ROS、PGF₂α含量和PGF₂α/PGE₂均明显更低（P＜0.05），PGE₂、SOD、GSH-Px含量均明显更高（P＜0.05）。这提示，电针三阴交穴缓解PDM大鼠疼痛症状和子宫组织损伤可能与抑制氧化应激反应有关。可能与以下因素有关：氧化应激与PDM疼痛密切相关，过量的自由基可损伤子宫组织，加剧炎症与痉挛^［22-23］。临床研究表明，与健康女性比较，PDM女性中大多数氧化应激标志物如脂质过氧化产物MDA的水平异常升高^［24-27］，氧化应激可能是PDM的关键病理机制。三阴交穴作为多经交汇之枢纽，电针三阴交可能通过整体调节神经-内分泌-免疫网络，增强机体内源性抗氧化防御系统^［28］。此外，还可能通过调节脏腑功能，改善机体代谢内环境，提升清除氧自由基的能力，减轻脂质过氧化损伤，保护子宫组织免受氧化应激攻击，降低大鼠子宫组织损伤程度和扭体反应，缓解疼痛。这与李晓泓等^［29-30］研究结果相似。

3.3　电针三阴交穴缓解PDM大鼠疼痛和子宫组织损伤可能与调控AMPK/mTOR信号通路有关

本研究结果显示，与模型组比较，电针组与药物组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK均明显更低，p-mTOR/mTOR均明显更高（P＜0.05）。与假电针组比较，电针组和药物组干预后子宫组织p-AMPK/AMPK均明显更低，p-mTOR/mTOR均明显更高。这提示，电针三阴交穴缓解PDM大鼠的疼痛和子宫组织损伤可能与调控AMPK/mTOR信号通路有关。可能与以下因素有关：电针刺激三阴交穴产生的生物信号，由局部神经传入与整体调节，可改善子宫组织的微循环与能量代谢状态，提升细胞内ATP/AMP，减少了AMPK的激活^［31-32］。AMPK活性受到抑制后，对下游mTORC1复合物的间接抑制作用减弱，mTOR信号通路得以恢复活性。活化的mTOR可通过促进蛋白质合成、增强线粒体功能、抑制过度自噬等多条下游途径，协同上调SOD、GSH-Px等抗氧化酶的合成与活性，并减少线粒体源性ROS生成，从而系统性地抑制氧化应激水平，减轻子宫组织损伤与炎性疼痛^{［9，33-34］}。本研究初步揭示了“电针三阴交穴→调控AMPK/mTOR通路→抑制氧化应激→缓解PDM疼痛”这一可能的作用机制，为阐明电针治疗痛经的现代科学机制提供了理论依据。这与周绵莉等^［35］研究观点相互支持。

4 小 结

电针三阴交穴可有效缓解PDM模型大鼠疼痛症状和子宫组织损伤，这可能与调控AMPK/mTOR信号通路、抑制氧化应激反应有关。但本研究主要从AMPK/mTOR信号通路介导的氧化应激调控角度探究了电针对PDM模型大鼠的影响机制，并未设置通路抑制剂对照组进行反向验证。下一步研究还需综合考察不同机制间的相互作用关系，为阐明电针治疗PDM的作用原理提供更充分的实验依据。

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基金资助

湖南省重点研发计划项目(2023SK2045)

湖南省自然科学基金项目(2023JJ30462)

学科建设“揭榜挂帅”项目(22JBZ007)

湖南中医药大学研究生科研创新项目(2022CX110)