基于“脑-肠-菌”轴探讨子午流注揿针改善慢传输型便秘大鼠肠道功能的作用机制

Mechanism of Meridian-Flow Intradermal Needling in Improving Intestinal Function in Rats with Slow Transit Constipation Based on the "Brain-Gut-Microbiota" Axis

摘要

目的 基于“脑-肠-菌”轴理论探讨子午流注揿针对慢传输型便秘（STC）大鼠肠道传输功能的作用机制。 方法 选择SPF级Wister大鼠40只，雌雄各半，采用随机数字表法随机分为空白组8只和造模组32只。造模组每日灌胃3 mg/kg盐酸洛哌丁胺混悬液建立STC大鼠模型，连续给药14 d以抑制肠道蠕动；空白组给予等体积生理盐水灌胃。将造模成功后的大鼠随机分为模型组、西药组、普通揿针组和子午流注揿针组，每组8只。除空白组外，其余4组在干预期间继续按造模剂量给予盐酸洛哌丁胺，以维持STC模型稳定，空白组同期灌胃等体积生理盐水。西药组给予琥珀酸普芦卡必利0.18 mg/（kg·d）灌胃，每次1 mL/100 g，每日1次；普通揿针组于每日10：00取双侧天枢穴、大肠俞穴进行揿针干预；子午流注揿针组取穴方法和操作方法与普通揿针组一致，但干预时间是每日辰时（8：00）进行天枢穴干预，申时（16：00）进行大肠俞穴干预。连续干预14 d后，采用6 h内粪便粒数、6 h内粪便含水率、小肠推进率评估大鼠肠道动力；采用ELISA检测结肠组织5-HT、VIP及脑组织中NE蛋白相对表达水平；采用Griess化学法检测脑组织中NO浓度；采用16S rRNA测序分析5组粪便样品的肠道菌群变化；采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析子午流注揿针组肠道菌群功能基因的富集情况。 结果 ① 肠道动力：与空白组比较，模型组6 h内粪便粒数更少（P＜0.05），粪便含水率更低（P＜0.05），小肠推进率更低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、普通揿针组及子午流注揿针组大鼠6 h内粪便粒数更多（P＜0.05），粪便含水率更高（P＜0.05），小肠推进率更高（P＜0.05）；与普通揿针组比较，西药组和子午流注揿针组6 h内粪便粒数更多（P＜0.05），小肠推进率更高（P＜0.05）。② 脑肠肽水平：与空白组比较，模型组结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更低（P＜0.05），脑组织NE蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），NO浓度更高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、普通揿针组及子午流注揿针组结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），脑组织NE蛋白相对表达水平更低（P＜0.05），NO浓度更低（P＜0.05）；与普通揿针组比较，西药组和子午流注揿针组大鼠结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），脑组织NO浓度更低（P＜0.05），子午流注揿针组脑组织NE蛋白相对表达水平更低（P＜0.05）；与西药组比较，子午流注揿针组大鼠结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），脑组织NE蛋白相对表达水平更低（P＜0.05），NO浓度更低（P＜0.05）。③ 肠道菌群分析：在OTU水平上，空白组、模型组、西药组、普通揿针组、子午流注揿针组独有OTU数量分别为2 738、3 862、4 397、3 956、2 901，5组共有核心OTU数量有323个。α多样性分析结果显示，与空白组比较，模型组肠道菌群物种丰度及多样性呈下降趋势（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、普通揿针组和子午流注揿针组肠道菌群物种丰度及多样性呈上升趋势（P＜0.05），其中子午流注揿针组上升趋势最明显（P＜0.05）。β多样性分析结果显示，模型组与子午流注揿针组的样本间距离最远。差异物种分析显示，模型组动丝菌属呈较高丰度特征，而子午流注揿针组克雷伯菌属呈相对较高丰度特征，且特异性富集普雷沃氏菌属、拟杆菌属H等菌属；子午流注揿针组肠道菌群功能通路主要集中于代谢相关类别，其中碳水化合物代谢通路相对丰度最高，其次为氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢以及萜类和聚酮类化合物代谢通路。 结论 子午流注揿针能促进STC大鼠的肠道传输功能恢复，其机制可能与调控“脑-肠-菌”轴以改善肠道动力、恢复脑肠肽动态平衡并优化菌群结构与代谢有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of meridian-flow intradermal needling on the intestinal transit function in rats with slow transit constipation (STC) based on the "Brain-Gut-Microbiota" axis theory. Methods Forty SPF-grade Wister rats, with an equal number of male and half female, were randomly assigned into a blank group (8 rats) and a modeling group (32 rats) using the random number table method. Rats in the modeling group were intragastrically administered 3 mg/kg loperamide hydrochloride suspension daily for 14 consecutive days to establish the STC rat model by inhibiting intestinal peristalsis. Meanwhile, the blank group received an equal volume of normal saline by gavage. Rats with successful model establisment were randomly divided into a model group, a western medicine group, the common intradermal needle group, and the meridian-flow intradermal needling group, with eight rats in each group. During the intervention period, all groups except the blank group continued to receive loperamide hydrochloride at the modeling dose to maintain a stable STC model, and the blank group was given an equal volume of normal saline simultaneously. The western medicine group was intragastrically administered prucalopride succinate at a dosage of 0.18 mg/(kg·d), with a volume of 1 mL per 100 g body weight, once daily. The common intradermal needle group received intradermal needling at bilateral Tianshu (ST25) and Dachangshu (BL25) acupoints at 10:00 AM every day. The meridian-flow intradermal needling group used the identical acupoints and procedures as the common intradermal needle group, but with time-specific intervention: Tianshu was needled at the Chen hour (08:00 AM) and Dachangshu at the Shen hour (16:00 PM) daily. Following 14 consecutive days of intervention, intestinal motility was evaluated by the number of fecal particles within 6 hours, fecal water content, and the small intestinal propulsion rate. The relative protein expression levels of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and vasoactive intestinal peptide (VIP) in colon tissue and norepinephrine (NE) in brain tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Nitric oxide (NO) concentration in brain tissue was measured by the Griess chemical method. Intestinal microbiota alterations in fecal samples from the five groups were analyzed by 16S rRNA gene sequencing. The functional gene enrichment of intestinal microbiota in the meridian-flow intradermal needling group was analyzed using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. Results 1) Intestinal motility: Compared with the blank group, the model group showed fewer fecal particles within 6 hours (P0.05), a lower fecal water content (P0.05), and a lower small-intestinal propulsion rate (P0.05). Compared with the model group, the western medicine group, the common intradermal needle group, and the meridian-flow intradermal needling group exhibited a greater number of fecal particles within 6 hours (P0.05), a higher fecal water content (P0.05), and a higher small intestinal propulsion rate (P0.05). Compared with the common intradermal needle group, the western medicine group and the meridian-flow intradermal needling group exhibited a greater number of fecal particles within 6 hours (P0.05), and a higher small intestinal propulsion rate (P0.05). 2) Brain-gut peptide levels: Compared with the blank group, the model group presented a lower protein expression levels of 5-HT and VIP in colon tissue (P0.05), a higher protein expression of NE in brain tissue (P0.05), and a higher NO concentration (P0.05). Compared with the model group, the western medicine group, the common intradermal needle group, and the meridian-flow intradermal needling group showed a higher protein expressions of 5-HT and VIP in colon tissues (P0.05), a lower protein expression of NE in brain tissues (P0.05), and a lower NO concentration (P0.05). Compared with the common intradermal needle group, the western medicine group and the meridian-flow intradermal needling group had a higher protein expressions of 5-HT and VIP in colon tissue (P0.05) and a lower NO concentration in brain tissue (P0.05); the meridian-flow intradermal needling group also demonstrated a lower protein expression of NE in brain tissue (P0.05). Compared with the western medicine group, the meridian-flow intradermal needling group displayed a higher protein expressions of 5-HT and VIP in colon tissue (P0.05), a lower protein expression of NE in brain tissue (P0.05), and a lower NO concentration (P0.05). 3) Intestinal microbiota analysis: At the OTU level, the numbers of unique OTUs in the blank, model, western medicine, the common intradermal needle, and the meridian-flow intradermal needling groups were 2,738, 3,862, 4,397, 3,956, and 2,901, respectively, with 323 core OTUs shared by all five groups. α-diversity analysis revealed that compared with the blank group, the model group showed a decreasing trend in species abundance and diversity of gut microbiota (P0.05). Compared with the model group, the western medicine group, the common intradermal needle group, and the meridian-flow intradermal needling group exhibited an increasing trend in the abundance and diversity of intestinal microbiota (P0.05), with the most significant increase in the meridian-flow intradermal needling group (P0.05). The β-diversity analysis demonstrated the greatest inter-sample distance between the model group and the meridian-flow intradermal needling group. Differential species analysis indicated that the model group was characterized by high abundance of Kineothrix, whereas the meridian-flow intradermal needling group exhibited a relatively high abundance of Klebsiella and specific enrichment of Prevotella, Bacteroides H, and other genera. The functional pathways of the intestinal microbiota in the meridian-flow intradermal needling group were mainly concentrated in metabolism-related pathways. Among these, the carbohydrate metabolism had the highest relative abundance, followed by amino acid metabolism, the metabolism of cofactors and vitamins, and the metabolism of terpenoids and polyketides. Conclusion The meridian-flow intradermal needling can promote the recovery of intestinal transit function in STC rats. Its mechanism may be related to the regulation of the "Brain-Gut-Microbiota" axis, thereby improving intestinal motility, restoring the homeostasis of brain-gut peptides, and optimizing the structure and metabolism of the microbiota.

Graphical abstract

关键词

慢传输型便秘 / 脑-肠-菌轴 / 子午流注揿针 / 肠道菌群 / 脑肠肽

Key words

slow transit constipation / "Brain-Gut-Microbiota" axis / the meridian-flow intradermal needling / intestinal microbiota / brain-gut peptides

慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是功能性便秘（functional constipation，FC）常见的一种亚型，以结肠动力减弱和传输延迟为特征，临床表现为排便次数减少、粪便干结等症状^［1］。据流行病学统计，FC的全球发病率约为16%，其中STC的发病率占FC的45.5%，并呈逐年递增趋势^［2-3］。长期便秘不仅严重影响患者的生活质量，还可诱发心脑血管问题、肛周直肠疾病及肠道癌变等并发症^［4］。目前，STC的临床治疗多以药物治疗为主，其中琥珀酸普芦卡必利是临床常用的促动力药物，作为高选择性5-羟色胺4受体（5-hydroxytryptamine receptor 4，5-HT4）激动剂，可激活肠道神经丛受体，促进乙酰胆碱等神经递质释放，调节肠道平滑肌运动^［1］。此外，各类泻剂、促分泌药及微生态制剂均为便秘常用药物。尽管这些药物可在一定程度上缓解便秘症状，但是长期使用易产生耐药性与依赖性问题^［1］。中医治疗STC的方法独特多样，揿针是一种改良式皮内针疗法，通过将针具浅刺并固定于皮内或皮下特定穴位产生持续、微弱而持久的刺激，从而达到防治疾病的目的，具有操作便捷、安全无痛等特点^［5］。子午流注理念，是将人体气血运行与自然界时间节律相联系，在气血旺盛的时辰对相应经络或脏腑进行治疗，能够顺应气血盛衰规律，强化治疗效果^［6］。课题组前期研究发现，揿针治疗气滞型STC具有显著的临床效果，可调节机体脑肠肽水平，促进结肠传输功能恢复^［7］。

近年来，研究发现STC的发生与“脑-肠-菌”轴功能紊乱密切相关，通过神经-内分泌-免疫调节网络，实现中枢神经系统、肠神经系统与肠道菌群间的动态交互^［8］。大量研究表明，肠道菌群失调、脑肠肽失衡及脑-肠轴互动异常都可能影响肠道传输功能，导致便秘的发生^［9-11］。盐酸洛哌丁胺是一种外周性阿片受体激动药，可抑制肠道平滑肌的收缩与蠕动，减慢肠道内容物传输速度，同时增加肠道对水分的吸收，使粪便干结变硬，是构建STC大鼠模型的常用药物^［12-13］。因此，本研究采用盐酸洛哌丁胺构建STC大鼠模型，观察子午流注揿针对STC大鼠肠道动力、脑肠肽水平及肠道菌群结构的影响，以期从“脑-肠-菌”轴理论探讨子午流注揿针干预STC大鼠的治疗作用及潜在机制，为中医外治法治疗STC提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1　实验动物

选择SPF级Wister大鼠40只，雌雄各半，8周龄，体质量（200±20）g。购自上海斯莱克实验动物有限公司［实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004］。饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院动物实验中心SPF级实验饲养室［实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2018-0006］。饲养环境条件为温度：（24±2）℃，湿度：50%～70%，光照：150～200 lx，12 h明暗交替（明相7：00-19：00；暗相19：00-次日7：00）以同步它们的昼夜节律，普通饲料喂养，自由进食和饮水^［14-15］。本研究经中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院实验动物伦理委员会批准（审批号：2024-39）。

1.2　主要实验药物

盐酸洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司，产品批号：PCJ1L71）；琥珀酸普芦卡必利片（江苏豪森药业集团有限公司，国药准字：H20183482）；异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，产品批号：2012 0301）。

1.3　主要实验试剂

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）检测试剂盒（货号：H104-1-2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒（货号：A013-2-1）均购自于南京建成生物科技有限公司；去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）检测试剂盒（货号：SEKSM-0019）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）检测试剂盒（货号：SEKR-0112）均购自于北京索莱宝生物科技有限公司；16S rRNA建库测序试剂盒（货号：12983ES96）购自于上海翊圣生物科技有限公司；一次性无菌揿针（规格：0.20 mm×0.9 mm，货号：23110C1）购自于四川源泉医疗器械有限公司。

1.4　主要实验仪器

多功能酶标仪（型号：SpectraMax i3X）购自于美国Molecular Devices公司；高通量测序平台（型号：NovaSeq 6000）购自于美国Illumina公司；高速冷冻离心机（型号：H2500R-2）购自于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；组织匀浆器（型号：Tissuelyser）购自于上海净信科技有限公司；-80 ℃超低温冰箱（型号：DW-86L826G）购自于青岛海尔生物医疗股份有限公司；恒温干燥箱（型号：DHG-9030A）购自于上海一恒科学仪器有限公司；电子分析天平（型号：BSA124S）购自于北京赛多利斯科学仪器有限公司；微量移液器（型号：MicroPette Plus）购自于大龙兴创实验仪器（北京）有限公司。

2 实验方法

2.1　实验动物造模及分组

2.1.1　实验动物造模方法

实验动物在SPF级环境中适应性喂养1周后，先按雌雄进行分类，再采用随机数字表法进行随机分组，以保证各组雌雄比例基本一致，分为空白组8只和造模组32只。造模组大鼠参考文献［16］及本研究要求进行造模，每日灌胃3 mg/kg盐酸洛哌丁胺混悬液建立STC大鼠模型，连续给药14 d以抑制肠道蠕动。空白组同期灌胃等体积生理盐水。

2.1.2　模型成立判定方法

造模结束后所有大鼠禁食不禁饮24 h后，经口灌胃3 mL 10%活性炭混悬液后单笼饲养。在实验开始时，将活性炭混悬液通过灌胃针注入大鼠胃中，完成操作时，立刻记录当前时间，为“灌胃墨汁时间（T0）”。将大鼠放入干净的单独笼具中，观察其排便情况。当看到大鼠排出第一粒被墨汁染黑的粪便时，立刻记录当下时间，为“第一粒黑便排出时间（T1）”。T0和T1二者差值为首粒黑便时间，并计算粪便含水率［粪便含水率/%＝（湿粪重量－干粪重量）/湿粪重量×100%］。与空白组比较，造模组首粒黑便时间明显延长，粪便含水率降低，即为STC模型造模成功。

2.1.3　造模后分组

造模期间，无大鼠死亡，造模成功大鼠共32只。将造模成功的大鼠随机分为模型组、西药组、普通揿针组和子午流注揿针组，每组8只，各组按要求进行干预并开展后续实验。

2.2　干预方案

干预期间，空白组、模型组和西药组每天进行与普通揿针组和子午流注揿针组一样的抓取动作而不进行针刺干预。为模拟临床中STC患者在肠道动力长期受抑背景下接受治疗的状态，除空白组外，其余4组在干预期间继续按造模剂量给予盐酸洛哌丁胺，以维持STC模型稳定，各组盐酸洛哌丁胺给药方案完全一致，空白组同期灌胃等体积生理盐水。

2.2.1　西药组

西药组给予琥珀酸普芦卡必利0.18 mg/（kg·d）灌胃，每次1 mL/100 g，每日1次，连续干预14 d。

2.2.2　普通揿针组

于每日10：00取双侧天枢穴、大肠俞穴进行揿针干预。天枢穴、大肠俞穴定位方法参考《实验针灸学》^［17］及文献［18］中的大鼠穴位图谱，天枢穴位于大鼠腹部，脐中旁开5 mm处；大肠俞穴位于第4腰椎（L₄）棘突下，背正中线旁开6 mm处。

具体操作方法：准备0.20 mm×0.9 mm的一次性无菌揿针、无菌镊子、医用乙醇、棉签、治疗盘、弯盘等；用鼠板固定大鼠，仰卧取天枢穴，俯卧取大肠俞穴行揿针治疗。操作者清洁双手，消毒大鼠施针处皮肤后用镊子尖端夹持住针柄，针尖对准穴位皮肤边缘后垂直刺入皮下，以一次性使用聚氨酯固定贴膜固定。每次取一侧天枢穴和大肠俞穴，留针24 h，隔天取另一侧天枢穴和大肠俞穴，交替进行，7 d为1个疗程，连续干预14 d。

2.2.3　子午流注揿针组

子午流注揿针组取穴方法和操作方法与普通揿针组一致，但干预时间是每日辰时（8：00）进行天枢穴干预，申时（16：00）进行大肠俞穴干预。

2.3　样本采集及保存

干预结束后，各组大鼠禁食不禁水24 h，于取材前灌胃10%活性炭混悬液3 mL，30 min后采用异氟烷吸入麻醉，麻醉成功后沿腹部正中线剖开腹腔，取腹主动脉血3 mL，立即离心分离血清，分装-80 ℃冻存备用。分离并剪出从胃到盲肠的全部小肠，用于计算小肠推进率。收集大肠部位粪便内容物，取样后立即置于液氮中速冻，然后转入-80 ℃保存；于降结肠-乙状结肠交界处向上取适量结肠组织及大鼠脑组织，将一部分结肠组织和脑组织用生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后，迅速置于液氮中速冻，随后置于-80 ℃冻存备用；另一部分结肠组织和脑组织置于4%的多聚甲醛溶液备用。

2.4　观察指标

为保证盲法，由经过规范化培训后的独立研究人员进行指标评估，该名研究人员在评估时不知晓大鼠的具体分组情况。

2.4.1　大鼠肠道动力评估

2.4.1.1　6 h内粪便粒数及粪便含水率

收集各组大鼠末次干预后6 h内粪便粒数，并检验其含水率，先称大鼠湿粪重量，后放入恒温箱60 ℃烘烤6 h后称取其干粪重量并计算粪便含水率，计算方法参考“2.1.2”。

2.4.1.2　小肠推进率

将分离剪出的全部小肠置于桌面上，测量活性炭在肠道内的推进长度及小肠全部长度，计算活性炭推进率即为小肠推进率。

小肠推进率＝炭墨推进长度/小肠全长×100%

2.4.2　大鼠脑肠肽水平检测

2.4.2.1　结肠组织中5-HT、VIP及脑组织中NE蛋白相对表达水平检测

采用ELISA检测结肠组织中5-HT、VIP及脑组织中NE蛋白相对表达水平。将-80 ℃冻存的结肠组织及脑组织样本取出，室温解冻。取结肠组织样本称重重量和体积后按1∶9加入预冷RIPA裂解液，匀浆后经4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液分装并保存于-80 ℃超低温冰箱。脑组织（中缝核区域）取样后迅速置于液氮中速冻，匀浆液通过0.22 μm滤膜去除杂质以提高检测特异性。检测流程严格遵循试剂盒说明书：将50 μL标准品或样本加入预包被板孔，37 ℃孵育30 min；加入生物素化抗体50 μL，37 ℃孵育60 min后洗涤5次；随后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的链霉亲和素50 μL，37 ℃反应30 min，3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）显色15 min，于450 nm波长读取吸光度值绘制标准曲线，将样本吸光度值代入曲线方程，计算得出结肠组织中5-HT、VIP及脑组织中NE蛋白相对表达水平。

2.4.2.2　脑组织中NO浓度检测

采用Griess化学法检测脑组织中NO浓度，NO在体内代谢迅速，最终转化为稳定的终产物亚硝酸盐（NO₂⁻）和硝酸盐（NO₃⁻），通过测定其总含量可间接且准确地反映NO浓度。具体步骤如下：取“2.4.2”中制备的脑组织匀浆上清液，严格按照NO检测试剂盒说明书进行操作。首先，在96孔板中加入适量样本，随后加入硝酸盐还原酶及辅酶，于37 ℃避光孵育30 min，将样品中的NO₃⁻全部还原为NO₂⁻。继而，依次加入Griess试剂Ⅰ（对氨基苯磺酰胺）和Griess试剂Ⅱ（N-1-萘基乙二胺二盐酸盐），室温下避光反应10 min。NO₂⁻与Griess试剂发生重氮化反应，生成粉红色的偶氮化合物。用多功能酶标仪于540 nm波长处测定各孔的吸光度值。根据标准品浓度与对应吸光度值绘制标准曲线，将样本吸光度值代入曲线方程，计算得出脑组织中总NO₂⁻/NO₃⁻浓度，以此代表NO浓度。

2.4.3　大鼠肠道菌群变化分析

2.4.3.1　粪便样本DNA提取、16S

rRNA测序　① DNA提取：采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取粪便样本基因组DNA，通过玻璃珠震荡机械破壁结合蛋白酶K消化确保DNA完整性。② PCR扩增：针对细菌16S rRNA基因V3-V4高变区进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，反应体系为25 μL（含2×Taq Master Mix 12.5 μL、特异性引物各1 μL）；扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，循环30次；72 ℃终延伸10 min。③ 上机测序：扩增产物经纯化后，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序。

2.4.3.2　肠道菌群的生物信息学分析

① 原始数据质控：原始测序序列经质控去除接头序列、低质量读段及嵌合序列后，获得有效读段；各样本有效读段长度分布于200～450 bp（中位数400 bp）。阴性对照样本读段数极低，仅检出少量环境背景菌，已在后续分析中剔除。见图1。② 操作分类单元聚类与物种注释：使用Usearch v10.0软件，将有效读段按97%序列相似度进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，生成OTU丰度表；基于Silva数据库v138版完成物种分类学注释。③ 测序深度验证：对OTU表进行稀释分析显示，随测序量增加，各样本OTU稀释曲线均趋于平台期，提示测序深度可覆盖大部分微生物群落物种。见图2。④ 肠道菌群OTU组成差异分析：基于OTU聚类结果，绘制5组样本肠道菌群OTU水平韦恩图，统计各组样本共有及独有OTU数量及占比。⑤ 肠道菌群多样性分析：采用Chao1、Shannon和Simpson指数（以Chao1指数表征物种丰度，Shannon和Simpson指数表征物种多样性及均匀度）进行肠道菌群α多样性分析；基于Bray-Curtis距离矩阵，采用主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）法进行肠道菌群β多样性分析。⑥ 差异物种分析：基于属水平物种注释及丰度结果，进行层级聚类分析并绘制物种丰度聚类热图，展示各组样本菌属的分布特征、组间差异及样本聚类规律；采用线性判别分析效应值大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析，筛选线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）＞3.0的差异物种，从门到属水平鉴定各组间差异显著的菌群，以评估其对组间结构差异的贡献度。⑦ 肠道菌群功能预测分析：采用PICRUSt2算法，关联京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路数据库，对子午流注揿针组肠道菌群的功能基因进行富集分析，解析肠道菌群的代谢与信号转导功能。采用GraphPad Prism 8软件进行数据可视化。上述分析由诺米代谢公司完成。

2.5　统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料服从正态分布，数据以（\overline{x}±s）表示，两组间比较方差齐则采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，若组间存在显著差异且方差齐时采用LSD-t检验进行事后多重比较校正，方差不齐时采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1　2组首粒黑便时间和粪便含水率比较

与空白组比较，造模组首粒黑便时间更长（P＜0.05），粪便含水率更低（P＜0.05）。见表1。

3.2　5组肠道动力比较

与空白组比较，模型组6 h内粪便粒数更少（P＜0.05），粪便含水率更低（P＜0.05），小肠推进率更低（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、普通揿针组及子午流注揿针组大鼠6 h内粪便粒数更多（P＜0.05），粪便含水率更高（P＜0.05），小肠推进率更高（P＜0.05）；与普通揿针组比较，西药组和子午流注揿针组6 h内粪便粒数更多（P＜0.05），小肠推进率更高（P＜0.05）。见表2。

3.3　5组脑肠肽水平比较

与空白组比较，模型组结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更低（P＜0.05），脑组织NE蛋白相对表达水平更高（P＜0.05）、NO浓度更高（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、普通揿针组及子午流注揿针组结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），脑组织NE蛋白相对表达水平更低（P＜0.05）、NO浓度更低（P＜0.05）；与普通揿针组比较，西药组和子午流注揿针组大鼠结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），脑组织NO浓度更低（P＜0.05），子午流注揿针组脑组织NE蛋白相对表达水平更低（P＜0.05）；与西药组比较，子午流注揿针组大鼠结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更高（P＜0.05），脑组织NE蛋白相对表达水平更低（P＜0.05）、NO浓度更低（P＜0.05）。见表3。

3.4　5组肠道菌群变化比较

3.4.1　5组样本肠道菌群OTU组成分析

在OTU水平上，5组独有OTU数量分别为2 738、3 862、4 397、3 956、2 901，占比分别是13.22%、18.65%、21.24%、19.11%、14.01%。5组完全共有的核心OTU数量仅有323个（1.56%）。见图3。

3.4.2　5组样本肠道菌群α多样性比较

与空白组比较，模型组肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数呈下降趋势（P＜0.05），Simpson指数呈上升趋势（P＜0.05）；与模型组比较，西药组、普通揿针组和子午流注揿针组肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数均呈上升趋势（P＜0.05），Simpson指数均呈下降趋势（P＜0.05）；与西药组比较，子午流注揿针组肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数呈上升趋势（P＜0.05），Simpson指数呈下降趋势（P＜0.05）；与普通揿针组比较，子午流注揿针组肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数均呈上升趋势（P＜0.05）。见图4。

3.4.3　5组样本肠道菌群β多样性分析

5组样本肠道菌群在前两主坐标轴上的分布呈现一定程度的组间分离趋势，第一主坐标轴（Axis 1）解释了总变异的9.9%，第二主坐标轴（Axis 2）解释了5.3%，两轴累计贡献15.2%的变异。见图5。从空间分布来看，空白组与模型组在左半轴（Axis 1负方向）存在部分重叠，但模型组整体向Axis 1正方向偏移；西药组位于Axis 1负方向，且与模型组置信区间发生重叠；普通揿针组向Axis 1正方向延伸；子午流注揿针组集中于右上方（Axis 1正方向、Axis 2正方向），并向Axis 1正方向继续延伸，且与模型组、西药组的样本间距离存在分离。组间连接线显示，从模型组到各干预组（西药组、普通揿针组、子午流注揿针组）的轨迹呈现发散趋势，模型组与子午流注揿针组的样本间距离最远。

3.4.4　5组样本肠道菌属丰度聚类热图分析

从热图分布趋势看，动丝菌属在模型组呈现相对较高丰度特征，在空白组、西药组、普通揿针组和子午流注揿针组呈较低丰度。子午流注揿针组中拟杆菌属H、克雷伯菌属等菌属呈相对较高丰度特征。聚类分析显示，西药组、普通揿针组和子午流注揿针组与模型组在菌群分布模式上存在一定分离，而与空白组在部分菌属聚类上更为接近。见图6。

3.4.5　5组样本肠道菌群LEfSe分析

空白组显著富集菌属包括粪杆状菌属、杜博西菌属、UMGS1994属等10种菌属；模型组显著富集菌属包括密螺旋体属D、朗布齐亚菌属B、UBA3282属等30种菌属；西药组显著富集菌属包括利米维西努斯菌属、福尔米单胞菌属、CAG_1024属等15种菌属；普通揿针组显著富集菌属包括别普雷沃氏菌属、CAG_41属、UBA3263属3种菌属；子午流注揿针组显著富集菌属包括普雷沃氏菌属、拟杆菌属H、鲁塞尼杆菌属等8种菌属。见图7。

3.4.6　子午流注揿针组肠道菌群KEGG功能通路富集分析

子午流注揿针组肠道菌群功能通路主要集中于代谢相关类别，其中碳水化合物代谢通路相对丰度最高，其次为氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢以及萜类和聚酮类化合物代谢通路。见图8。

4 讨 论

4.1　子午流注揿针通过时空协同作用改善肠道动力

中医学认为，STC归属于“秘结”范畴，关键病机为大肠传导失司。本研究结果显示，子午流注揿针干预后，STC大鼠6 h内粪便粒数、粪便含水率及小肠推进率均较模型组明显改善，且部分指标疗效与西药组相当，提示该疗法能够改善STC大鼠肠道动力并促进肠道传输功能恢复。这可能与天枢穴和大肠俞穴的俞募配穴协同作用，以及揿针持续、微弱刺激所产生的经络调节效应有关^［19］。天枢穴为大肠募穴，大肠俞穴为大肠背俞穴，两穴配合有助于调节大肠腑气、恢复传导功能。结合子午流注理论，于胃经和膀胱经气血较旺的时辰实施干预，可能进一步增强穴位刺激效应，从而改善肠道动力，持续激发经络气血，协调机体机能，达到调和气血、行气导滞的作用^［5］。现代医学研究认为，揿针刺激穴位可通过经络传导调节神经功能，增强肠道平滑肌张力及兴奋性，促进胃肠蠕动，改善排便功能^［20］。在子午流注理论中，辰时为足阳明胃经当令，此时胃经气血最为旺盛，消化功能处于最佳状态，对天枢穴进行干预，可调理脾胃，促进肠道蠕动；申时为足太阳膀胱经当令，此时段干预大肠俞穴，可最大化激活膀胱经气血，增强大肠传导功能。因此，选择胃经和膀胱经气血充盈的时辰进行治疗，可有效改善STC模型大鼠的肠道动力，促进传输功能康复。

4.2　子午流注揿针通过影响神经-内分泌网络恢复脑肠肽动态平衡

脑肠肽动态失衡是STC发生和发展的重要机制之一^{［9，21-22］}。研究发现，调节脑肠肽动态平衡可改善STC引起的排便困难^［23］。本研究结果显示，与空白组比较，模型组结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平更低，而脑组织NE蛋白相对表达水平、NO浓度更高；经子午流注揿针干预后，5-HT、VIP蛋白相对表达水平升高，NE蛋白相对表达水平、NO浓度降低，且整体改善幅度优于普通揿针组，并在部分指标上优于西药组。该结果提示，子午流注揿针可能通过调节神经-内分泌网络，恢复脑肠肽动态平衡，从而改善肠道动力。从可能机制看，子午流注揿针可能通过激活迷走神经通路，促进肠嗜铬细胞合成和释放5-HT，增强肠道平滑肌收缩^［24-26］；同时通过提高VIP蛋白相对表达水平参与肠道水液代谢调节^［27］，并降低NE蛋白相对表达水平、NO浓度等抑制性因素水平，减轻应激状态和肠平滑肌松弛，从而提高结肠传输效率^［28-29］。因此，子午流注揿针通过特定时辰进行穴位刺激，可促进部分脑肠肽激活和释放，调节脑肠肽水平，改善肠道动力，提高结肠的传输效率。

4.3　子午流注揿针通过调节肠道菌群改善肠道功能的机制探讨

肠道菌群失衡是STC的重要病理基础之一，针刺干预可能通过调节菌群结构参与疾病改善^［30-32］。本研究发现，STC模型大鼠肠道菌群表现出丰度和多样性下降、菌群组成紊乱等特征；而子午流注揿针干预后，α多样性指标明显改善，β多样性分析亦显示其菌群结构与模型组明显分离，提示该疗法能够重塑STC大鼠肠道菌群结构。尽管PCoA前两个主坐标轴累计解释度为15.2%，仅反映部分β多样性特征，但结合α多样性、LEfSe差异菌和功能预测结果，可较为一致地支持子午流注揿针对肠道微生态的调节作用。

进一步的LEfSe分析显示，子午流注揿针干预后，模型组中富集的密螺旋体属D、消化链球菌等差异菌减少，而普雷沃氏菌属、拟杆菌属H等菌群富集增加，提示子午流注揿针可在一定程度上逆转STC相关肠道菌群失衡^［33］。已有研究表明，拟杆菌属和普雷沃氏菌属参与膳食纤维及多糖代谢，并可促进短链脂肪酸生成，从而为结肠上皮供能、维护肠屏障功能并促进肠道蠕动^［34-36］。

KEGG功能预测结果进一步显示，子午流注揿针组肠道菌群功能通路主要集中于代谢相关类别，其中以碳水化合物代谢通路相对丰度最高，其次为氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢以及萜类和聚酮类化合物代谢通路。上述结果提示，子午流注揿针不仅影响菌群组成，还可能通过调节菌群代谢功能，促进短链脂肪酸等代谢产物生成，并进一步影响脑肠肽分泌和肠道蠕动功能^［37-40］。

4.4　揿针疗法对“脑-肠-菌”轴的整合调节作用及其临床意义

综合本研究结果，子午流注揿针在改善肠道动力、调节脑肠肽水平及优化肠道菌群结构方面均表现出良好作用，整体疗效与西药组相当，且在部分指标上优于普通揿针组和西药组，提示子午流注揿针对STC具有较好的综合干预效应。由此可见，子午流注揿针对STC大鼠的干预并非局限于单一环节，而是通过改善肠道动力、恢复脑肠肽动态平衡、重塑肠道菌群结构及其代谢功能，体现出对“脑-肠-菌”轴的多层次调控作用。与普通揿针组相比，子午流注揿针组择时干预在多个指标上显示出更优趋势，提示顺应机体生物节律可能是增强疗效的重要因素。作为一种非药物干预手段，子午流注揿针在STC防治中具有一定应用潜力。

5 小 结

综上所述，子午流注揿针可促进大鼠肠道传输功能，增加粪便粒数和粪便含水率，提高小肠推进率；增加结肠组织5-HT、VIP蛋白相对表达水平，降低脑组织NE、NO浓度，从而恢复脑肠肽动态平衡；提高肠道菌群丰度及多样性，增加肠道有益菌富集程度，优化肠道微生态环境。即子午流注揿针天枢穴和大肠俞穴可能通过调控“脑-肠-菌”轴改善STC大鼠肠道动力，促进大鼠肠道传输功能康复，为临床相关研究提供实验参考。但本研究也存在一定的局限性，未进一步分析雌雄性别差异对实验相关指标的影响，未来研究可以对此进行更细致的评估，以探索揿针疗法在不同性别大鼠中的疗效差异，为临床制定个体化治疗方案提供实验依据；同时研究发现子午流注揿针可能对肠道菌群的代谢功能产生影响，但尚未完全明确其具体通路，未来需进一步结合宏基因组学和代谢组学技术，深入探究肠道菌群与代谢通路之间的关联及其调控的分子机制，以揭示子午流注揿针刺激对肠脑双向通讯的具体通路；开展多中心、大样本临床试验，进一步验证子午流注揿针的长期疗效与安全性。

参考文献

[1] 中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会. 功能性便秘中西医结合诊疗专家共识（2025年）［J］. 中国中西医结合消化杂志，2025，33（3）：195-216.

[2] Digestive System Diseases Professional Committee of Chinese Association of Integrative Medicine. Expert consensus on integrated traditional Chinese and western medicine diagnosis and treatment of functional constipation （2025） ［J］. Chin J Integr Tradit West Med Dig，2025，33（3）：195-216.

[3] BARBERIO B， JUDGE C， SAVARINO E V，et al. Global prevalence of functional constipation according to the Rome criteria：a systematic review and meta-analysis ［J］. Lancet Gastroenterol Hepatol，2021，6（8）：638-648.

[4] VLISMAS L J， WU W，HO V. Idiopathic slow transit constipation：pathophysiology，diagnosis，and management ［J］. Medicina，2024，60（1）：108.

[5] SUMIDA K， MOLNAR M Z， POTUKUCHI P K，et al. Constipation and risk of death and cardiovascular events ［J］. Atherosclerosis，2019，281：114-120.

[6] LI D， ZHANG G L， ZHANG L X，et al. Effect of thumbtack needle on functional constipation：a pragmatic randomized controlled trial ［J］. Complement Ther Med，2024，84：103069.

[7] 焦文波，盖凤春，盖国忠. 子午流注理论在现代临床护理中的研究进展［J］. 长春中医药大学学报，2020，36（2）：406-408.

[8] JIAO W B， GAI F C， GAI G Z. Research progress on midday-midnight flowing of Qi-bloodpoint theory in modern clinical nursing ［J］. J Changchun Univ Chin Med，2020，36（2）：406-408.

[9] 陈慧，柯晓，李春平，等. 子午流注择时八髎穴揿针治疗气滞型慢传输型便秘的临床疗效及对患者脑肠肽的影响［J］. 上海中医药大学学报，2020，34（5）：26-30.

[10] CHEN H， KE X， LI C P，et al. Clinical efficacy of midnight-noon ebb-flow timing intradermal needling at Baliao acupoint on slow transit constipation with Qi stagnation syndrome and effects on brain-gut peptides ［J］. J Shanghai Univ Tradit Chin Med，2020，34（5）：26-30.

[11] MENG X， ZHANG G， CAO H，et al. Gut dysbacteriosis and intestinal disease：mechanism and treatment ［J］. J Appl Microbiol，2020，129（4）：787-805.

[12] 林露敏，刘启鸿，柯晓，等. 基于“脑-肠-菌”轴探讨功能性便秘与中医“脑肠相通”理论的关系［J］. 实用中医内科杂志，2023，37（1）：1-3.

[13] LIN L M， LIU Q H， KE X，et al. Based on the "Brain-Gut-Bacteria" axis to explore the relationship between functional constipation and the theory of "Brain-Intestinal Communication" in traditional Chinese medicine ［J］. J Pract Tradit Chin Intern Med，2023，37（1）：1-3.

[14] ZOU S T， XIE B， AN Z T，et al. Olive oil solution of volatile oil from Citri reticulatae pericarpium viride alleviates slow-transit constipation via regulating SCF/c-Kit signaling pathway and intestinal flora ［J］. Drug Des Devel Ther，2025，19：4275-4295.

[15] DU Y T， CHEN L， ZHANG X，et al. Based on untargeted metabolomics and metagenomics：a study on the mechanism of Miao ethnomedicine Zingiber mioga （Thunb.） Rosc. in treating slow transit constipation ［J］. Front Microbiol，2026，17：1751739.

[16] 陈金梅，刘彩红，谢立群，等. 蛋白酶激活受体-2激动剂对小鼠胃肠动力的影响［J］. 中华实用诊断与治疗杂志，2016，30（1）：39-42.

[17] CHEN J M， LIU C H， XIE L Q，et al. Effect of protease-activated receptor-2 agonist on gastrointestinal motility in mice ［J］. J Chin Pract Diagn Ther，2016，30（1）：39-42.

[18] NERI F， CAVALLARI G， TSIVIAN M，et al. Effect of colic vein ligature in rats with loperamide-induced constipation ［J］. J Biomed Biotechnol，2012，2012：896162.

[19] LUO R H， YANG Z B， LIANG W S，et al. Diurnal variation in melatonin-mediated cardiac protection via Per2 expression in heart ［J］. J Pineal Res，2025，77（2）：e70036.

[20] KROON T， HAGSTEDT T， ALEXANDERSSON I，et al. Chronotherapy with a glucokinase activator profoundly improves metabolism in obese Zucker rats ［J］. Sci Transl Med，2022，14（668）：eabh1316.

[21] LIU Q H， KE D F， CHEN Y Q，et al. Effects of Liqi Tongbian decoction on gut microbiota，SCFAs production，and 5-HT pathway in STC rats with Qi Stagnation Pattern ［J］. Front Microbiol，2024，15：1337078.

[22] 李忠仁. 实验针灸学［M］. 北京：中国中医药出版社，2003：325.

[23] LI Z R. Experimental acupuncture science ［M］. Beijing：China Press Tradit Chin Med，2003：325.

[24] 中国针灸学会. 实验动物常用穴位名称与定位 第2部分：大鼠［J］. 针刺研究，2021，46（4）：351-352.

[25] China Association of Acupuncture-Moxibustion. Names and location of commonly used acupoints in experimental animals Part 2：Rats ［J］. Acupunct Res，2021，46（4）：351-352.

[26] CAO Y， ZHONG F， WEN Q，et al. Effect of electroacupuncture on gastrointestinal motility in rats with slow transit constipation based on GDNF methylation modification ［J］. Acupunct Res，2022，47（2）：141-147.

[27] 杜旭，刘海燕，吴金钥，等. 基于“治未病”理论探析揿针防治亚健康状态的优势与展望［J］. 陕西中医药大学学报，2024，47（4）：147-150.

[28] DU X， LIU H Y， WU J Y，et al. Based on the theory of "Prevention of Disease"，the advantages and prospects of acupuncture in preventing sub-health state are analyzed ［J］. J Shaanxi Univ Chin Med，2024，47（4）：147-150.

[29] CHEN P， ZHANG L， FENG Y，et al. Brain-Gut axis and psychiatric disorders：a perspective from bibliometric and visual analysis ［J］. Front Immunol，2022，13：1047007.

[30] FANG L Y， YI X， SHEN J X，et al. Gut-Brain axis mediated by intestinal content microbiota was associated with Zhishi Daozhi decoction on constipation ［J］. Front Cell Infect Microbiol，2025，15：1539277.

[31] GUO K X， TANG Y， YANG T，et al. Massa Medicata Fermentata treated spleen deficiency constipation by mediating intestinal microbiota and serum peptide ［J］. Front Cell Infect Microbiol，2025，15：1556915.

[32] JIN Z Y， SHEN Z H， YAN S Y，et al. Electroacupuncture ameliorates gastrointestinal dysfunction by modulating DMV cholinergic efferent signals to drive the vagus nerve in p-MCAO rats ［J］. Heliyon，2024，10（8）：e29426.

[33] CHEN Y， SHEN P H， LI Q，et al. Electroacupuncture and Tongbian decoction ameliorate CUMS-induced depression and constipation in mice via TPH2/5-HT pathway of the Gut-Brain axis ［J］. Brain Res Bull，2025，221：111207.

[34] MAWE G M， HURD M， HENNIG G W，et al. Epithelial 5-HT（4） receptors as a target for treating constipation and intestinal infla-mmation ［J］. Adv Exp Med Biol，2022，1383：329-334.

[35] TAN Q， HU J， ZHOU Y J，et al. Inhibitory effect of Lactococcus lactis subsp. lactis HFY14 on diphenoxylate-induced constipation in mice by regulating the VIP-cAMP-PKA-AQP3 signaling pathway ［J］. Drug Des Devel Ther，2021，15：1971-1980.

[36] 庄芬妮，陈一斌. 中医药治疗功能性便秘的作用机制和临床研究进展［J］. 中医药信息，2025，42（6）：79-83，89.

[37] ZHUANG F N， CHEN Y B. Mechanisms and clinical research progress of traditional Chinese medicine in treating functional constipation ［J］. Inf Tradit Chin Med，2025，42（6）：79-83，89.

[38] 王永彬，宋顺丰，胡金，等. 肠道神经递质因子与老年慢传输型便秘中医辨证分型的相关性［J］. 中国老年学杂志，2023，43（22）：5449-5451.

[39] WANG Y B， SONG S F， HU J，et al. Correlation between intestinal neurotransmitter factors and TCM syndrome differentiation of elderly patients with slow transit constipation ［J］. Chin J Gerontol，2023，43（22）：5449-5451.

[40] HU W J， KONG X Y， WANG H，et al. Ischemic stroke and intestinal flora：an insight into Brain-Gut axis ［J］. Eur J Med Res，2022，27（1）：73.

[41] XU M M， WANG L， GUO Y，et al. Corrigendum to "positive effect of electro-acupuncture treatment on gut motility in constipated mice is related to rebalancing the gut microbiota" ［J］. Evid Based Complementary Altern Med，2021，2021（1）：9835654.

[42] XU M M， GUO Y， CHEN Y，et al. Electro-acupuncture promotes gut motility and alleviates functional constipation by regulating gut microbiota and increasing butyric acid generation in mice ［J］. J Integr Med，2023，21（4）：397-406.

[43] HAN Y L， KANG Z X， JIN S W，et al. Electroacupuncture improves low-grade duodenal inflammation in FD rats by reshaping intestinal flora through the NF-κB p65/NLRP3 pyroptosis pathway ［J］. Heliyon，2024，10（10）：e31197.

[44] TREFFLICH I， DIETRICH S， BRAUNE A，et al. Short- and branched-chain fatty acids as fecal markers for microbiota activity in vegans and omnivores ［J］. Nutrients，2021，13（6）：1808.

[45] LIU X M， MAO B Y， GU J Y，et al. Blautia：a new functional genus with potential probiotic properties? ［J］. Gut Microbes，2021，13（1）：1875796.

[46] CHEN Y X， LIU Y Z， WANG Y，et al. Prevotellaceae produces butyrate to alleviate PD-1/PD-L1 inhibitor-related cardiotoxicity via PPARα-CYP4X1 axis in colonic macrophages ［J］. J Exp Clin Cancer Res，2022，41（1）：1.

[47] RUTSCH A， KANTSJÖ J B， RONCHI F. The Gut-Brain axis：how microbiota and host inflammasome influence brain physiology and pathology ［J］. Front Immunol，2020，11：604179.

[48] BENECH N， ROLHION N， SOKOL H. Tryptophan metabolites get the gut moving ［J］. Cell Host Microbe，2021，29（2）：145-147.

[49] WANG L， XI M H， CAO W，et al. Electroacupuncture alleviates functional constipation by upregulating host-derived miR-205-5p to modulate gut microbiota and tryptophan metabolism ［J］. Front Microbiol，2025，16：1517018.

[50] WU G Y， MEININGER C J， MCNEAL C J，et al. Role of L-arginine in nitric oxide synthesis and health in humans ［M］//Amino Acids in Nutrition and Health. Cham：Springer International Publishing，2021：167-187.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(82575226)

福建省自然科学基金项目(2023J01822)