电针介导AFG3L2对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的影响及其作用机制

Effects and Mechanisms of Electroacupuncture Mediated by AFG3L2 on Learning and Memory in Alzheimer Disease Mouse Models

摘要

目的 观察电针百会、神庭穴对阿尔茨海默病（AD）小鼠学习记忆能力的影响，并探讨其作用机制。 方法 选择2月龄雄性5×FAD小鼠和雌性野生小鼠各4只，杂交约1个月培育后代，从后代中选择20只鉴定为阳性的3月龄小鼠，按照随机数字表法分为对照组和电针组，每组10只，再选取10只3月龄同窝阴性小鼠作为野生组。适应性固定1周后，电针组取百会、神庭穴进行针刺，深度2 mm，疏密波，频率1/20 Hz，1次/d，30 min/次，5 d/周，干预4周。野生组和对照组小鼠在同等条件下抓取和固定，不接受其他干预。采用新位置识别测试（活动总路程、辨别指数）评价小鼠学习记忆功能；采用7.0 T磁共振成像小动物系统进行化学交换饱和转移（CEST）成像扫描，检测小鼠海马区葡萄糖代谢水平（非对称磁化转移率［MTRasym（Δω）］）；采用免疫组化检测小鼠海马淀粉样蛋白（Aβ）阳性面积；采用三磷酸腺苷（ATP）试剂盒检测小鼠海马区ATP的浓度；采用免疫荧光检测小鼠海马的线粒体钙单向转运蛋白（MCU）复合物必需亚基（EMER）阳性面积；采用Western blot检测小鼠海马MCU、ATP酶家族基因3同源蛋白2（AFG3L2）蛋白表达水平。 结果 ① 新位置识别测试：干预后第2、3天，3组活动总路程差异均无统计学意义（P＞0.05）；与野生组比较，对照组干预后第2、3天辨别指数明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后第2、3天辨别指数明显升高（P＜0.05）。② Aβ阳性面积：与野生组比较，对照组干预后海马CA1和DG区Aβ阳性面积均明显增加（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后海马CA1和DG区Aβ阳性面积均明显减少（P＜0.05）。③ MTRasym（Δω）：与野生组比较，对照组干预后海马区MTRasym（Δω）明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后海马MTRasym（Δω）明显增加（P＜0.05）。④ ATP浓度：与野生组比较，对照组干预后海马中ATP浓度下降（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后海马中ATP浓度升高（P＜0.05）。⑤ EMER阳性面积：与野生组比较，对照组干预后EMER阳性面积增加（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后EMER阳性面积减少（P＜0.05）。⑥ MCU、AFG3L2蛋白表达水平：与野生组比较，对照组干预后MCU表达水平明显升高（P＜0.05），AFG3L2表达水平明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后MCU表达水平明显降低（P＜0.05），AFG3L2表达水平明显升高（P＜0.05）。 结论 电针百会、神庭穴可提高AD小鼠学习记忆功能，其具体作用机制可能与提高葡萄糖代谢水平、调节AFG3L2及相关线粒体蛋白有关。

Abstract

Objective To observe the effects of electroacupuncture (EA) at the Baihui (GV20) and Shenting (GV24) acupoints on learning and memory function in Alzheimer disease (AD) mouse models, and to explore the underlying mechanisms. Methods A total of four male 5×familial Alzheimer disease (5×FAD) and four female wild-type (WT) mice, all aged two months were selected and cross-breeding. After approximately one month, their offspring were genotyped. A total of 20 3-month-old offspring identified as positive were randomly assigned using a random number table to control group and EA group, with 10 cases in each group. Additionally, ten 3-month-old negative littermates were selected as the WT group. Following one week of adaptive fixation, the EA group was administered electroacupuncture at the Baihui(GV20) and Shenting(GV24) acupoints with a needle penetration depth of 2 mm, using a dense-sparse waveform at a frequency of 1/20 Hz for 30 minutes daily, five days a week for four weeks. The WT and control group were captured and fixed under the same conditions without receiving any other treatment. Novel location recognition test (total travel distance, discrimination index) was employed to evaluate learning and memory function; a 7.0 T small animal magnetic resonance imaging system was used to performe chemical exchange saturation transfer (CEST) imaging scans to detect glucose metabolism levels (asymmetric magnetisation transfer ratio [MTRasym(Δω)]) in the hippocampus of mice. Immunohistochemistry was used to detect the amyloid-β (Aβ) positive area in the hippocampus of mice. Adenosine triphosphate (ATP) assay kit was used to detect the concentration of ATP in the hippocampus of mice. Immunofluorescence was used to detect the positive area of essential mitochondrial calcium uniporter regulator (EMER) in the hippocampus of mice. Western blot was used to detect the expression levels of mitochondrial calcium uniporter (MCU) and AFG3 like matrix AAA peptidase 2 (AFG3L2) proteins in the hippocampus of mice. Results (1) Novel location recognition test: on the 2nd and 3rd day after intervention, there was no statistically significant difference in the total travel distance in all three groups (P>0.05). Compared with the WT group, discrimination index in the control group decreased significantly on the 2nd and 3rd day after intervention (P<0.05). Compared with the control group, discrimination index in the EA group increased significantly on the 2nd and 3rd day after intervention (P<0.05). (2) Aβ positive area: compared with the WT group, the Aβ positive area in the hippocampal cornu ammonis 1 (CA1) and dentate gyrus (DG) regions in the control group increased significantly after intervention (P<0.05). Compared with the control group, the Aβ-positive area in the hippocampal CA1 and DG regions in the EA group decreased significantly after intervention (P<0.05). (3) MTRasym (Δω): compared with the WT group, hippocampal MTRasym(Δω) in the control group decreased significantly after intervention (P<0.05). Compared with the control group, hippocampal MTRasym (Δω) in the EA group increased significantly after intervention (P<0.05). (4) ATP concentration: compared with the WT group, ATP concentration in the hippocampus of the control group decreased significantly after intervention (P<0.05); compared with the control group, ATP concentration in the hippocampus of the EA group increased significantly after intervention (P<0.05). (5) EMER positive area: compared with the WT group, EMER positive area in the control group increased significantly after intervention (P<0.05); compared with the control group, EMER positive area in the EA group decreased significantly after intervention (P<0.05). (6) MCU and AFG3L2 protein expression levels: compared with the WT group, MCU protein expression level in the control group increased significantly after intervention (P<0.05) , while AFG3L2 protein expression decreased significantly after intervention (P<0.05). Compared with the control group, MCU protein expression level in the EA group decreased significantly after intervention (P<0.05), while AFG3L2 protein expression increased significantly after intervention (P<0.05). Conclusion EA at the Baihui (GV20) and Shenting (GV24) acupoints can improve learning and memory function in mouse models with AD. The specific mechanism may involve improving hippocampal glucose metabolism and regulating AFG3L2 and related mitochondrial proteins.

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 学习记忆功能 / 葡萄糖代谢 / 电针 / 百会穴 / 神庭穴 / ATP酶家族基因3同源蛋白2

Key words

Alzheimer disease / learning and memory function / glucose metabolism / electroacupuncture / Baihui (GV20) acupoints / Shenting (GV24) acupoints / AFG3L2

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以学习记忆障碍为主要表现的慢性、进行性神经退行性疾病^［1-2］。有研究表明，AD海马葡萄糖代谢水平下降会破坏神经元的突触可塑性，造成学习记忆障碍^［3-4］。突触中的辅助亚基和神经丝作为维持受体功能和突触结构稳定性的关键组分，能提升三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成水平，为其组装提供能量，提高突触传递效率^［5］。电针作为一种将传统针灸和现代电刺激相结合的特色疗法，可通过提高AD患者葡萄糖代谢水平改善学习记忆功能^［6-7］，但其具体作用机制仍需进一步阐明。

ATP酶家族基因3同源蛋白2（AFG3 like matrix AAA peptidase 2，AFG3L2）是一种属于m-AAA蛋白酶家族的线粒体蛋白。AFG3L2主要定位于线粒体内膜，在维持线粒体蛋白质稳态、线粒体形态和氧化磷酸化活性方面发挥着重要作用，是线粒体内质量控制系统的核心组成部分^［8］。小鼠脑内AFG3L2丢失促进了异常线粒体钙单向转运蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）复合物的形成，导致线粒体内Ca²⁺大量流入以及神经元死亡，并出现了AD相关病理特征^［9-10］。AD小鼠脑内出现线粒体Ca²⁺超载、通透性过渡孔开放、代谢水平下降的现象^［11］。通过上调AFG3L2可以恢复线粒体嵴的数量及肿胀状态，改善线粒体受损表型^［12］，提示调控AFG3L2表达可能是改善线粒体功能的关键途径之一。

本研究拟采用携带5个家族性基因突变的淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老素1（presenilin 1，PS1）转基因小鼠（5×FAD transgenic mice，5×FAD）为研究对象，探讨电针百会、神庭穴调控AFG3L2对葡萄糖代谢水平及学习记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1　实验动物

选择2月龄雄性5×FAD小鼠和雌性野生小鼠各4只，实验动物由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009。将雄性5×FAD小鼠与雌性野生小鼠杂交培育约1个月，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室［实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002］，待其后代生长至3月龄，选取其中30只开展研究。饲养环境温度22 ℃，湿度50%～70%，模拟标准昼夜系统（12 h光照＋12 h黑夜），自由饮水。动物实验方案及伦理均通过福建中医药大学动物管理委员会审批（审批号：FJTCMIACUC2021 001），严格遵守《实验动物管理条例》，并严格按照国家动物保护法规的规定操作和施行。

1.2　主要仪器与试剂

小鼠新位置测试系统购自上海欣软信息科技有限公司；小动物呼吸麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司，型号：R500IP）；7.0 T小动物核磁共振成像仪（德国Bruker公司，型号：BioSpec 70/20 USR）；华佗牌G6805型电针治疗仪（型号：SDZ-V）及针灸针（0.25 mm×25 mm）购自苏州医疗用品厂有限公司；凝胶成像系统（型号：ChemiDoc XRS+）及电泳仪（型号：1645050）均购自美国Bio-Rad公司。

增强型ATP检测试剂盒（货号：S0027，批号：A192250214）购自上海碧云天生物技术有限公司；Aβ淀粉样蛋白抗体（货号：25524-1-AP，批号：00190903）、MCU复合物必需亚基（essential MCU regulator，EMRE）抗体（货号：29313-1-AP，批号：00160221）、AFG3L2抗体（货号：14631-1-AP，批号：00163631）、MCU抗体（货号：26312-1-AP，批号：00053756）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3　实验动物鉴定及分组

参考前期研究方法进行实验动物鉴定^［13］。首先通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对繁育后的小鼠DNA进行扩增，随后加入配好的琼脂糖凝胶板的筛孔中进行电泳，如同时出现377 bp的APP基因条带及608 bp的PS1基因条带，则为5×FAD阳性小鼠，若均未出现则为阴性小鼠。将20只鉴定为阳性的小鼠按照随机数字表法分为对照组和电针组，每组10只，再选取10只同窝阴性小鼠作为野生组。

1.4　干预方法

1.4.1　干预前适应

将小鼠置于50 mL EP管中固定四肢，并将EP管固定在泡沫板上减少晃动，1次/d，30 min/次，5 d/周，固定1周。所有小鼠在干预前1周进行适应性固定。

1.4.2　电针组

采用电针针刺百会、神庭穴。参考前期研究中的定位方法，取小鼠头部前正中线，两耳尖连线中点为百会穴，前正中线，额顶骨缝交界线前方为神庭穴，提起头部皮肤、斜刺进针、针刺深度2 mm^［13］。电针参数如下：疏密波，频率1/20 Hz，1次/d，30 min/次，5 d/周，干预4周。

1.4.3　野生组和对照组

小鼠在同等条件下抓取和固定，不接受其他干预。

1.5　观察指标

1.5.1　行为学检测

电针干预后，通过新位置识别测试检测小鼠学习记忆能力。该实验分为适应、学习和测试3个阶段。干预结束后第1天为适应阶段，将小鼠放入测试空箱10 min以适应测试环境。干预结束后第2天为学习与短期记忆测试阶段，在测试箱的西北角和西南角分别放置物体A和物体B，放入小鼠学习10 min以记住物体方位。20 min后将西南角的B物体移至东南角记为物体C，放入小鼠探索5 min进行短期记忆测试，并观察小鼠距离物体2～3 cm的探索物体时间。干预结束后第3天再次进行长期记忆测试。实验结果采用辨别指数表示，辨别指数越高，代表小鼠对新位置的物体识别能力越强。

辨别指数＝物体C探索时间/（物体C探索时间＋物体A探索时间）×100%

1.5.2　葡萄糖代谢水平检测

行为学测试后，采用7.0 T磁共振成像小动物系统进行化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer，CEST）成像扫描，检测葡萄糖代谢水平。CEST成像前使用1.5 %异氟醚麻醉。扫描过程中，使用半径为3.6 cm的体积线圈作为发射器，正交单通道表面线圈作为接收器。

T2加权成像（T2 weighted imaging，T2WI）详细采集参数如下：重复时间（repetition time，TR）＝5 000 ms，回波时间（echo time，TE）＝105.02 ms，视野（field of view，FOV）＝16 mm×16 mm，图像矩阵＝256×256，切片厚度＝1 mm。CEST扫描，B1＝3.7 μT，设置-1 800～1 800 Hz的41次频率偏置采集，间隔为90 Hz。具体采集参数如下：TR＝5 000 ms，TE＝35.45 ms，B1＝3.7 μT，FOV=16 mm×16 mm，图像矩阵＝45×45，切片厚度＝1 mm。采用非对称磁化转移率［MTRasym（Δω）］计算CEST葡萄糖代谢图像数据^［14］。

MTRasym（Δω）＝［Ssat（-Δω）－Ssat（Δω）］/S₀

计算过程中，需确定Δω（即内容物与自由水之间的频率差）、饱和前的自由水信号S₀以及饱和后Ssat信号对应的自由水值。体素计数均经每只小鼠代谢图像全脑平均强度标准化处理。随后，使用ITK-SNAP软件手动勾画左右海马感兴趣区，并提取每只小鼠海马的葡萄糖代谢值。

1.5.3　淀粉样斑块沉积水平检测

干预结束后，选取3只小鼠进行取材。采用免疫组化检测海马淀粉样蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）沉积水平。灌注取材后脱水包埋切片，二甲苯和梯度乙醇脱蜡，柠檬酸钠修复液低火修复20 min后冷却至室温。加入内源性过氧化物酶阻断剂10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗后加入非特异性染色阻断剂封闭，37 ℃孵育1 h。滴加一抗（1∶200）标记Aβ，4 ℃孵育过夜。次日复温30 min，滴加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育1 h，PBS清洗后滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10 min。PBS冲洗后滴加新鲜3，3'-二氨基联苯胺（3，3'-Diaminobenzidine，DAB）显色液显色，PBS冲洗除去显色液，滴加苏木素染色液室温孵育2 min，PBS返蓝后吹干封片。最后用普通光学显微镜拍摄海马亚区中的阿蒙角1（cornu ammonis 1，CA1）区及齿状回（dentate gyrus，DG）亚区，使用ImageJ统计分析。

1.5.4　ATP浓度检测

干预结束后，另外选取3只小鼠取材，采用ATP增强型试剂盒检测ATP浓度。海马组织加入适量裂解液于冰上裂解5～10 min，采用高速研磨仪充分研磨组织，然后在4 ℃下14 000 r/min离心15 min后，取上清80 μL。按照ATP试剂盒进行加样，用化学发光仪测定相对光单位（relative light unit，RLU），根据标准曲线计算出样本中ATP的浓度。

1.5.5　EMER阳性面积检测

干预结束后，使用上述Aβ检测中同批3只小鼠的相邻脑组织切片样本，通过免疫荧光检测EMER表达。使用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡，低火使用柠檬酸钠抗原修复液进行修复20 min，随后取出冷却约2 h至室温，使用PBS洗净一抗，滴加封闭液37 ℃孵育1 h。PBS洗后滴加一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜。第2天取出复温30 min后，用PBS溶液洗净一抗后，滴加二抗（1∶800）。37 ℃避光孵育1 h取出，用PBS洗净二抗，清洗后滴加防荧光淬灭封片剂封片。最后使用普通荧光显微镜观察染色结果并统计分析。

1.5.6　MCU、AFG3L2蛋白表达水平

另选3只小鼠取材，采用Western blot检测海马MCU、AFG3L2蛋白表达水平。取海马组织加入裂解液进行裂解，4 ℃下以14 000 r/min离心15 min，取上清80 μL进行定量。调蛋白浓度一致后加Loading Buffer，95 ℃变性5 min。配制凝胶后上样进行电泳，采用三段式电泳法：20 V 10 min、60 V 30 min、120 V 70 min，转膜至聚偏氟乙烯膜。脱脂奶粉封闭3 h，4 ℃一抗过夜（MCU 1∶3 000、AFG3L2 1∶10 000）；二抗常温孵育1 h（MCU和AFG3L2均为1∶10 000）。洗涤后进行显色成像，使用Image-Lab软件分析灰度值，计算目的蛋白相对表达水平。

1.6　统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，采用（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐两两比较使用LSD-t检验，若方差不齐则采用Games-Howell检验；计量资料不符合正态分布以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用Kruskal-Wallis H检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1　3组干预后新位置识别测试结果比较

干预后第2、3天，3组活动总路程差异均无统计学意义（P＞0.05）。与野生组比较，对照组干预后第2、3天辨别指数明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后第2、3天辨别指数明显升高（P＜0.05）。见表1。

2.2　3组干预后Aβ阳性面积比较

与野生组比较，对照组干预后海马DG和CA1区Aβ阳性面积均明显增加（P＜0.05）。与对照组比较，电针组干预后海马DG和CA1区Aβ阳性面积均明显减少（P＜0.05）。见表2、图1。

2.3　3组干预后MTRasym（Δω）比较

与野生组比较，对照组干预后海马MTRasym（Δω）明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后海马MTRasym（Δω）明显增加（P＜0.05）。见表3。

2.4　3组干预后ATP浓度比较

与野生组比较，对照组干预后海马中ATP浓度下降（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后海马中ATP浓度升高（P＜0.05）。见表4。

2.5　3组干预后EMER阳性面积比较

与野生组比较，对照组干预后EMER阳性面积增加（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后EMER阳性面积减少（P＜0.05）。见表5、图2。

2.6　3组干预后MCU和AFG3L2蛋白表达水平比较

与野生组比较，对照组干预后MCU表达水平明显升高（P＜0.05），AFG3L2表达水平明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，电针组干预后MCU表达水平明显降低（P＜0.05），AFG3L2表达水平明显升高（P＜0.05）。见表6、图3。

3 讨 论

3.1　电针可提高AD小鼠学习记忆功能和减少Aβ异常沉积

本研究结果显示，与对照组比较，电针组干预后辨别指数明显升高，Aβ阳性面积明显减少，这提示电针可提高AD小鼠学习记忆功能和减少Aβ沉积。这可能与以下原因有关：① 中医学理论认为AD与“髓海空虚”有关，可能是由于阳气不足所致。电针百会、神庭穴可升阳益气、填髓充脑、通督调神，协同提高海马等核心脑区的能量供应，改善其神经可塑性，从而提高学习记忆功能^［15-16］。② Aβ是人体脑内的代谢产物，由β淀粉样前体蛋白经y-分泌酶和β-分泌酶水解而来，绝大多数AD患者脑内Aβ的生成速度保持相对恒定，只是清除速度明显下降，最终造成神经毒性，引发神经元凋亡及学习记忆能力下降^［17］。电针百会、神庭穴可能通过激活促进Aβ降解的相关信号通路，提高Aβ清除速度，维持突触微环境稳定，改善学习记忆功能。这与YU等^［18］研究结果一致。

3.2　电针提高AD小鼠学习记忆功能可能与葡萄糖代谢水平升高有关

本研究结果显示，与对照组比较，电针组干预后小鼠海马MTRasym（Δω）明显增加，ATP浓度上升，提示电针提高学习记忆功能可能与海马葡萄糖代谢水平升高相关。这可能与以下因素有关：ATP作为大脑能量代谢的载体，通过维持突触可塑性所需的离子梯度及突触囊泡循环等过程，为长时程增强的诱导与维持提供能量基础^［19］。超过95% ATP是由葡萄糖代谢提供^［20］。海马作为学习记忆的关键脑区，其能量供应高度依赖于葡萄糖的氧化过程，三羧酸循环作为有氧代谢的核心环节，能够高效地生成大量ATP，以满足海马在学习记忆任务中的高能量需求^［21-22］。电针百会、神庭穴可能通过调控葡萄糖转运及代谢相关分子促进海马等重要脑区对葡萄糖的摄取，提高其葡萄糖利用率，增强ATP生成，提高神经元突触功能和辨别指数。这与MINHAS等^［23］研究结果发现改善海马葡萄糖代谢可恢复海马长时程增强作用的观点相似。

3.3　电针改善AD小鼠学习记忆功能可能与调控AFG3L2及相关线粒体蛋白有关

本研究结果发现，与对照组比较，电针组干预后AFG3L2表达水平明显升高，EMER阳性面积、MCU表达均明显降低，这提示电针改善AD学习记忆功能可能与调节AFG3L2及相关线粒体蛋白相关。可能与以下因素有关：① AFG3L2是一种m-AAA蛋白酶家族的线粒体蛋白，参与呼吸链活性和线粒体基因表达的调控。AFG3L2功能缺失会引发神经元线粒体代谢障碍及细胞死亡^［24-25］。电针百会、神庭穴可能通过激活AFG3L2上游信号，在转录水平上调其表达，进而恢复其受损的ATP依赖性蛋白水解活性，促进线粒体内错误折叠或受损的蛋白的识别和清除，改善线粒体的氧化磷酸化功能及ATP的合成效率，为突触结构重塑等高耗能的学习记忆过程提供能量。② AFG3L2的一个重要功能底物是EMER，它是构成功能性MCU复合物所必需的调节亚基^［26］。AFG3L2可通过降解未组装的EMRE，维持MCU复合物的正常组装与功能^［27］。电针百会、神庭穴可能通过下调EMER和MCU表达，减少高活性MCU复合物的形成和线粒体内钙离子过载，为线粒体内ATP生成提供稳定环境，从而改善学习记忆相关突触可塑性相关蛋白合成、神经递质释放等关键活动。

4 小 结

电针百会、神庭穴可提高AD小鼠学习记忆功能，其具体作用机制可能与提高葡萄糖代谢水平、调节AFG3L2及相关线粒体蛋白有关。但本研究仍存在一些不足之处，如仅探究了电针调节AFG3L2介导EMRE的降解作用以及MCU复合物的组装状态，而对具体的分子相互作用机制尚未完全阐明。下一步研究还需通过敲除或抑制AFG3L2，以验证其对MCU复合物形成及下游线粒体功能的影响，并在分子与功能层面明确AFG3L2在电针干预中的具体调控机制。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82575185)

国家自然科学基金项目(82004440)

福建省自然科学基金项目(2024J09044)

福建省康复技术协同创新中心科研项目（X2025002-协同）