好氧颗粒污泥的培养及其胞外聚合物的分析与应用

Culture of Aerobic Granular Sludge and Analysis and Application of its Extracellular Polymers

摘要

本文对快速培养性能稳定的好氧颗粒污泥（AGS）进行研究，记录接种活性絮状污泥（AS）培养成AGS的外观形貌变化过程，并从微观层面揭示AGS机械强度高、稳定性强的原因。另外，从力学层面研究AGS的胞外聚合物（EPS）对Cd²⁺的吸附机理，对AGS‒EPS能否成为具有潜力的生物吸附剂进行验证，以揭示AGS在水处理领域的优势作用。培养过程中，第85 d反应器内污泥形态稳定，污泥粒径由31.59 μm增至442.72 μm，污泥磷含量增长232.70%，从25.93 mg/g增长至86.27 mg/g。16s rRNA基因高通量测序结果表明，Chloroflexi可能是颗粒污泥的初始颗粒框架，而Proteobacteria是污泥颗粒化的核心菌门；聚糖菌Candidatus_Competibacter和聚磷菌Candidatus Accumulibacter是污泥颗粒化的核心菌属。从AS到AGS的培养，EPS含量从79.18 mg/g VSS增至133.63 mg/g VSS，3维荧光光谱（3D‒EEM）证实AGS‒EPS含有更高水平的蛋白质，驯化过程中细胞分泌的蛋白质分解溶解性降低，更加有利于生物膜中微生物细胞凝聚；傅里叶红外光谱（FTIR）和蛋白质2级结构研究表明，两类EPS均含有醇酚、糖类中的—OH、—CH、C—O、C—C，糖醛酸中的羧酸盐基团，蛋白质中的N—H及烷烃类有机物，而AGS‒EPS具有更丰富的多糖种类，稳定的细胞结构。颗粒化培养使AGS对Cd²⁺的吸附机理发生了变化，吸附动力学研究表明AS‒EPS对于Cd²⁺的吸附，同时存在物理、化学吸附；AGS‒EPS对于Cd²⁺的吸附适合用拟2级动力学模型来拟合，具有更强的生物化学属性。吸附热力学研究表明，两类EPS对于Cd²⁺的吸附实验适合用Langmuir模型来拟合，该吸附过程属于均相单分子层吸附，而AGS‒EPS的理论最大吸附容量大于AS‒EPS，分别为617.09 mg/g、542.90 mg/g。实验过程证明：在高磷环境中增加COD含量能够提升污泥的除磷性能，对于污泥颗粒化的培养具有积极作用；颗粒化的培养使得污泥的物理、化学性质均得到了强化；颗粒污泥培养的副产物AGS‒EPS具有更强的Cd²⁺吸附效果，其对Cd²⁺的吸收主要为生物化学作用，也说明了AGS在污废水处理领域具有更大的潜力。

Abstract

Objective Due to the advancement of industry and the improvement of residents' living standards, the urban sewage treatment load continues to increase, making it urgent to develop cost-effective water treatment technologies. In recent years, aerobic granular sludge (AGS) has been increasingly applied in practical projects because of its high stability and good pollutant removal efficiency. This study examines the rapid cultivation of stable AGS, records the changes in appearance and morphology of inoculated activated sludge floc (AS) and AGS, and reveals, at the microscopic level, the reasons why the structure and stability of AGS are superior to those of AS. In addition, this study investigates the adsorption mechanism of Cd²⁺ by the extracellular polymeric substances (EPS) of AGS from a mechanical perspective and verifies whether AGS‒EPS exhibits a higher pollutant removal capacity. Methods The sludge was collected from the secondary sedimentation tank of a wastewater treatment plant in Hefei and was pretreated to obtain cleaner inoculating sludge. It was divided into two portions: one was used for research, and the other was concentrated and placed into the SBR reactor. The process of granular sludge cultivation was documented, including morphological transformations and variations in key indicators. The microbial community structure was analyzed through high-throughput sequencing of 16 s rRNA genes. Changes in EPS content before and after sludge granulation were determined, and the EPS was characterized using Three-Dimensional Excitation Emission Matrix Fluorescence Spectroscopy (3D-EEM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) to analyze the structural differences between AS and AGS. At the mechanical level, kinetic and thermodynamic models were employed to fit the adsorption experiments of AS‒EPS and AGS‒EPS for Cd²⁺. Results and Discussions During the domestication of AS into AGS, on the 85th day, the sludge morphology stabilized, and the sludge particle size increased from 31.59 to 442.72 μm. This experiment successfully produced phosphorus-rich granular sludge, with the phosphorus content of the sludge increasing from 25.93 to 86.27 mg/g. The results of 16 s rRNA gene high-throughput sequencing indicated that Chloroflexi served as the initial particle framework of the granular sludge, while Proteobacteria represented the core bacterial phylum responsible for sludge granulation. In addition, Candidatus_Competibacter and Candidatus_Accumulibacter were identified as the dominant bacterial genera involved in the sludge granulation process. Throughout the cultivation period, the EPS content increased from 79.18 mg/g VSS to 133.63 mg/g VSS. The 3D-EEM analysis confirmed that AGS‒EPS contained a higher level of proteins, and the reduction in protein decomposition and solubilization by cells during the domestication process facilitated microbial cell aggregation within the biofilm. FTIR and protein secondary structure analyses revealed that both types of EPS contained alcohol phenols, —OH, —CH, C—O, C—C from sugars, carboxylate groups from uronic acids, N—H from proteins, and alkane-like organic compounds. However, AGS‒EPS exhibited a more diverse composition of polysaccharides and a more stable cell structure. The granulation process altered the adsorption mechanism of AGS toward Cd²⁺. Adsorption kinetic studies demonstrated that the adsorption of Cd²⁺ by AS‒EPS involved both physical and chemical adsorption, whereas the adsorption of Cd²⁺ by AGS‒EPS was better described by the pseudo-second-order kinetic model, indicating stronger biochemical adsorption properties. Adsorption thermodynamic analyses indicated that the adsorption of Cd²⁺ by both types of EPS was best fitted by the Langmuir model, indicating a homogeneous monolayer adsorption process. The theoretical maximum adsorption capacity of AGS‒EPS was higher than that of AS‒EPS, at 617.09 and 542.90 mg/g, respectively. Conclusions The experimental process demonstrated that increasing the COD content in a high-phosphorus environment enhanced the phosphorus removal performance of sludge and positively influenced the cultivation of granular sludge. In the comparison between AGS and AS, 3D-EEM analysis revealed that AGS exhibited a higher protein level, while FTIR indicated that both had similar functional groups; however, AGS contained more abundant polysaccharides. The secondary protein structure confirmed that AGS possessed stronger cell aggregation, greater mechanical strength, and higher protein compactness. The by-product of granular sludge cultivation, AGS‒EPS, exhibited a stronger Cd²⁺ adsorption capacity, primarily through biochemical interactions, indicating that AGS holds greater potential in wastewater treatment applications.

Graphical abstract

关键词

好氧颗粒污泥 / 胞外聚合物 / 重金属 / 微生物群落 / 生物吸附剂

Key words

aerobic granular sludge / extracellular polymers / heavy metal / microbial community / biosorbent

本刊网刊

06 ‒ 08

网络出版日期:2024 ‒ 06 ‒ 13

好氧颗粒污泥（AGS）被视为一种由微生物自凝聚作用形成的特殊活性污泥^[1]。AGS具有高生物负载量、高有机物负荷率、良好的抗冲击负荷能力、出色的沉降性^[2]。与传统水处理工艺相比，AGS工艺可减少25%～50%的能耗和25%～75%的占地面积^[3]；与厌氧颗粒污泥工艺相比，AGS工艺的启动时间更短，污泥颗粒生长速度快。2022年，国内AGS技术工业化污水处理厂——河南南阳示范工程建成并投入使用，将AGS工艺应用到实际工程中，能够提高水处理效率，降低污水处理成本^[4]。

因此，一些学者对如何快速稳定地培养颗粒污泥进行了研究，认为代谢环境中较充足的磷元素能促进好氧颗粒污泥的培养，增强AGS系统的稳定性^[5‒6]。张小雷^[7]发现高磷环境有助于提高AGS对污染物的净化效能，且污泥在高磷环境中生长速率快，颗粒污泥系统物化特性强，微生物代谢水平高。王然登^[8]开展了不同磷、碳元素质量比（P/C）的进水对污泥形成颗粒的实验，在P/C=2∶100时有利于颗粒污泥快速生成，而在P/C=0.03∶100时无颗粒污泥生成。

关于污泥的研究，研究者通常都会对污泥的胞外聚合物（EPS）进行提取、含量测定、表征分析。EPS能反映污泥的性状，是微生物在一定环境下分泌的高分子物质，主要成分为胞外蛋白质和多糖^[9]，是生物膜的重要组成部分，有保护和维持生物膜的作用^[10]。EPS还有广泛的工业用途，可作为阻燃剂^[11]、吸附剂^[12]、土壤修复剂^[13]。Wei等^[14]研究了EPS对Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺的吸附行为，表明EPS中的蛋白质对于上述重金属离子具有较强的吸附性。费维繁等^[15]认为絮状活性污泥的EPS对于Cd²⁺吸附存在离子交换，有较好的吸附效果。

为验证AGS在处理污废水过程中的积极作用，以及污泥颗粒化之后的EPS能否作为更具有潜力的吸附剂，本文以污泥颗粒培养为基础，研究好氧絮状活性污泥（AS）与AGS的特性差异，对污泥EPS的变化进行深度分析。研究结果对于认识AS‒EPS、AGS‒EPS吸附Cd²⁺的力学机理具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 污泥

本文使用的接种活性污泥取自合肥市经济开发区某污水处理厂二沉池。将取回的污泥进行预处理：首先，用格栅去除较大的废物杂质；然后，在4 000 r/min转速下离心10 min，将含有其他悬浮杂质的上清液去除；最后，用质量分数为0.85%的NaCl溶液恢复至原体积并轻搅拌使AS恢复悬浮状态，重复此操作3次。将处理好的AS分为两份：一份为预处理后接种污泥（污泥可挥发性固体含量（MLVSS）为2 100 mg/L，污泥混合液总固体含量（MLSS）为3 000 mg/L，污泥容积指数（SVI）为85 mL/g），直接用于提取AS‒EPS；另一份沉淀2 h后去除上清液，然后将浓缩接种污泥（MLVSS=12 000 mg/L、MLSS=15 500 mg/L）放入序批式活性污泥法反应器（SBR）培养成AGS，以获取AGS‒EPS。

1.2 实验装置与运行

通过SBR反应器稳定运行培养并收集沉降、性状优良且富磷的AGS，其示意图如图1所示。

由有机玻璃构成的反应器主体有效容积为8 L，高为60 cm，有效水深为45 cm，内径为15 cm。反应器连接软管及蠕动泵（保定兰格BT100-3J）用于进出水；顶部开孔使搅拌器和搅拌桨能够通过；反应器底放置微孔砂滤曝气环，用于好氧曝气，曝气量由转子流量计控制，分别为1.2、0.8、0.4 L/min，根据定期测定的溶解氧浓度进行流量调节，使溶解氧浓度稳定在6～7 mg/L。反应器内采用恒温加热棒来维持器内温度（25±1 ℃）。

反应器的进出水、曝气等程序均通过时控开关自动控制。每天运行3个周期，每个周期8 h，包括进出水15 min，搅拌120 min，曝气180 min，沉淀60 min，排水15 min，闲置90 min。控制每个周期反应器进入废水4 L，排出处理完成的污水4 L，水力停留时间（HRT）为16 h。每天在第2个周期好氧曝气末端排出泥水混合液约500 mL，污泥浓度为3 400～4 000 mg/L，污泥龄（SRT）控制在15 d左右。

以乙酸钠为主要碳源模拟废水，具体模拟废水配方见表1。同时，使用NaHCO₃调节pH为7.0～7.3，再加入1 mL微量元素和矿物质浓缩液，其组分及浓度见表2。反应器的培养阶段分为阶段Ⅰ（60 d）及阶段Ⅱ（40 d）。

1.3 分析方法

1.3.1 常规指标分析方法

常规指标的检测参照《水和废水监测分析方法》（第四版），总磷（TP）测定采用钼酸铵分光光度法，COD测定采用重铬酸钾法，NH{}_{\mathrm{4}}^{+}—N测定采用纳氏试剂分光光度法，总氮（TN）测定采用碱性过硫酸钾法，污泥粒径的测定采用激光粒度分析仪（Malvern Panalytical，Zetasizer Nano ZS），MLSS和MLVSS采用重量灼烧法^[16]。污泥含磷量采用SMT法测定，测定指标为TP^[17]。

1.3.2 微生物群落分析

将预处理后的初AS和SBR运行100 d后稳定的AGS进行16s rRNA高通量测序分析，分别将样本命名为A1、B1。实验完成基因组DNA提取后，聚合酶链式反应（PCR）扩增子文库使用Illumina MiSeq平台构建，特异性引物为338F_806R。对得到的PE reads样品进行拆分，对两端Reads进行质控、过滤，获取ASV（amplicon sequence variant）代表序列和丰度信息，基于ASV进行物种分类学、群落多样性、群落组成分析。

1.3.3 EPS的提取和测定

取预处理后AS、AGS各100 mL，以60 g/g VSS加入732 Na型阳离子交换树脂，在500 r/min的条件下搅拌4 h。搅拌后在10 000 r/min、4 ℃条件下离心25 min。所得上清液即为EPS溶液，用透析袋（2 000 Da）透析8 h，每1 h换一次水。透析袋会截留住蛋白质、多糖等大分子物质，排除溶液中其他组分对实验的影响。

采用考马斯亮蓝‒G250法测定蛋白质含量，蒽酮‒硫酸法测定多糖含量，二苯胺法测定核酸含量^[18]。

1.3.4 EPS的表征方法

采用荧光光谱仪（Hitachi，F7000）对EPS进行3维荧光光谱（3D‒EEM）组分测试。测试条件：以10 nm为增量，激发波长E_x为250 nm～450 nm，发射波长E_m为300～500 nm，扫描速度为12 000 nm/min。采用Matlab软件进行数据处理和绘图。

将EPS溶液置于-40 ℃冰箱冷冻24 h，再用冷冻干燥机进行冻干后用傅里叶红外光谱仪（Thermo Fisher Scientific，NicoletiS20）对EPS样品进行分析，探测波长为400～4 000 nm范围内进行测试。使用OMNIC9.2对数据进行分析。在此基础上采用PeakFit v4.12进行蛋白质二级结构分析，对酰胺Ⅰ区（1 600～1 700 cm^-1）分峰拟合分析，以深度探究两份污泥的EPS蛋白质特性。

1.3.5 EPS吸附实验

取25 mL浓度为10 mg/L的Cd²⁺溶液，向其中按质量比m（Cd²⁺）∶m（EPS²⁺）=1∶1投加EPS，调节pH=6，在25 ℃恒温振荡箱中以180 r/min的条件分别振荡10、20、30、40、60、120、180 min，进行吸附动力学实验。

分别取浓度为5、10、20、30、40、50、100 mg/L的Cd²⁺溶液25 mL，向其中加入1 mg的EPS，调节pH=6，在温度为25 ℃的恒温振荡箱中以180 r/min的转速振荡60 min，进行吸附热力学实验。

将吸附后的溶液注入处理过的透析袋（8 000～12 000 Da）中透析8 h，用于分离吸附重金属的EPS和未被吸附的重金属离子。烧杯中透析袋外部的纯水500 mL，基于扩散定律，重金属离子会被透析到袋外纯水中，取烧杯溶液用ICP（PerkinElmer，Optima 8000）测定Cd²⁺浓度，从而计算出EPS对重金属的吸附量与去除率。

2 结果与讨论

2.1 反应器培养期运行状况分析

AGS的培养需要一段时间的稳定运行，此阶段需要对反应器进出水及污泥外观进行实时监控，以保证污泥的长期稳定驯化。在培养阶段，选择在每天/固定时间对反应器的进/出水的TP、COD、NH{}_{\mathrm{4}}^{+}—N、TN进行检测。指标变化见图2。

AGS培养的10 d前，对磷的去除效果较低。10 d之后，可发现出水磷含量明显降低，认为是污泥中的聚磷菌逐渐成为优势菌种，污泥中的多聚磷酸盐开始积聚并趋于稳定。第30 d，反应器出水TP含量稳定在5 mg/L左右。第60 d，COD含量增至450 mg/L时，出水TP含量开始降至2 mg/L以下，TP去除率提升至90%。最终出水COD含量稳定在30 mg/L左右，满足《污水综合排放标准》（GB8978—1996）的一级A标准（COD<50 mg/L）。说明在稳定的反应体系中，适当增加COD含量，有助于聚磷菌对磷的吸收，提升污泥的净化、代谢能力，有利于污泥系统的稳定。当系统的碳磷比为15:1时，污泥在厌氧期缺乏足够的碳源以合成聚羟基脂肪酸酯（PHAs），导致污泥在好氧期没有足够的碳源和能量，去吸收磷元素并合成聚磷酸盐。这可以解释在阶段Ⅰ时系统较低的磷去除率，也是在此条件下难以快速形成AGS的原因。

反应器的两个阶段对于NH{}_{\mathrm{4}}^{+}—N的去除效率较高，出水含量低于0.5 mg/L，第60 d进水水质的变化对其去除率无明显影响。TN较NH{}_{\mathrm{4}}^{+}—N去除率稍低，最终出水TN含量从2.5 mg/L增至5.0 mg/L上下波动，两类指标均满足《污水综合排放标准》（GB8978—1996）的一级A标准（NH{}_{\mathrm{4}}^{+}—N浓度<5 mg/L，TN浓度<15 mg/L）。该反应器对氮负荷的环境适应性较强。稳定后TN去除率为70%，低于TP的去除率（90%）。实验结果表明，COD含量增加对颗粒污泥的脱氮效率影响不大，但对除磷效率有显著影响。本次实验与李巨峰等^[19]使用AGS处理长链二元酸废水的结果相同，AGS对于TN和NH{}_{\mathrm{4}}^{+}—N去除率较低，而对去除有机物及TP具有优势。

在培养初期需要对AS进行一段时间的培养，以提其高抗冲击能力。SBR反应器因为每天剩余污泥的排出，使得系统内絮状污泥不断减少，聚磷菌富集，沉降性能不断优化。污泥形貌和污泥粒径变化如图3所示。接种污泥为深灰褐色絮状（粒径中值d_0.5=31.59 μm）；第19 d观察到污泥白色颗粒开始形成（d_0.5=71.14 μm），主体污泥的深灰褐色变为浅灰黑色；培养至60 d，污泥基本上全部变为白色（d_0.5=229.418 μm）；改变进水后污泥颗粒增长速度明显，85 d污泥为白色、黄色大颗粒状，形态圆润饱满（d_0.5=442.72 μm）。最终，AGS的MLVSS/MLSS增至0.81，MLVSS=2 600 mg/L，MLSS=3 200 mg/L。SVI降至42 mL/g，AS的含磷量为25.93 mg/g，颗粒化培养后增长了232.7%，达86.27 mg/g，AGS有更高的磷回收价值。

2.2 污泥的菌群结构解析

2.2.1 菌群结构门水平的差异

污泥的菌群结构解析结果如图4所示。由图4（a）可知，在AS中，优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、髌骨细菌门（Patescibacteria），丰度分别为33.85%、21.04%、10.78%、9.44%、7.42%。而黏球菌门（Myxococcota）和浮霉菌门（Planctomycetes）丰度较低，分别为3.84%、2.95%。

AGS稳定形成后，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度较接种活性污泥大幅升高，分别为48.08%、33.26%。变形菌门（Proteobacteria）被认为是AGS污泥系统中常见的主要菌门^[20]，能通过分泌EPS促进絮状污泥凝聚，在污泥颗粒化过程起着重要作用^[21]。

颗粒污泥中的绿弯菌门（Chloroflexi）降至1.1%，而酸杆菌门（Acidobacteriota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）在培养过程中被淘汰。Bovio‒Winkler等^[22]发现Chloroflexi在厌氧系统中具有很强的降解碳化合物和构建絮凝体或造粒功能，该系统中Chloroflexi丰度有所减少但没有被淘汰，Chloroflexi能够在厌氧和好氧反应器中形成小污泥颗粒和颗粒骨架^[23‒24]，推测其可能是本实验污泥颗粒化的初始框架^[25]。此外，在颗粒污泥体系中，厚壁菌门（Firmicutes）由极低的丰度增长至6.06%，该菌门往往可以抵抗脱水和极端环境，在颗粒污泥中经常被发现为优势菌种^[26‒27]，这可能是AGS结构紧凑、耐冲击的原因之一。

2.2.2 菌群结构属水平的差异解析

对AS和AGS中属水平菌落进行解析如图4（b）所示，Candidatus_Competibacter聚糖菌丰度在AS中的丰度仅占2.72%，而颗粒污泥中增长为最优势菌属，占23.33%。Candidatus_Competibacte作为一种生长缓慢的微生物，在SBR反应器中有优势丰度，使得系统具有较强的细胞内源储存能力，这也解释了为何该反应器污染物去除率较高^[28]。AGS能够上调糖原合成和反硝化相关的代谢^[29]，主要是因为Candidatus_Competibacte能在厌氧阶段吸收挥发性脂肪酸（VFAs）并将其储存为PHAs，在好氧阶段氧化PHAs，合成糖原^[30]。

传统聚磷菌Candidatus Accumulibacter的丰度从极低增至8.13％，与AGS培养过程中TP去除率不断增加相对应。在厌氧条件下，Candidatus Accumulibacter利用细胞内多磷酸盐水解产生的能量，迅速消耗易于生物降解的有机化合物，并将其储存为细胞内聚合物；在有氧条件下或在替代电子受体（硝酸盐或亚硝酸盐）存在的情况下，利用在厌氧条件下积累的细胞内碳和能量源吸收正磷酸盐并合成细胞内多磷酸盐^[31]，它们对于磷的代谢量明显超过其他常规细菌，因此能够从废水中去除磷^[32]。Tian等^[33]在EBPR工艺低温运行中发现，Candidatus Accumulibacter使器内具有高水平的胞外多糖，产有大量源自生物质的古洛糖醛酸‒古洛糖醛酸（GG）嵌段，这种特性有利于污泥造粒，增强所形成AGS的机械强度，促进固液分离，有助于系统稳定运行。

2.3 污泥的胞外聚合物

2.3.1 EPS各组分含量

接种污泥和颗粒污泥的胞外聚合物SEM图及各组分含量如图5（a）、（b）所示。由图5（a）、（b）可知，两类污泥的EPS的形貌有明显差异：AS‒EPS结构松散，脉络清晰，孔隙较多；AGS‒EPS结构致密、均匀，认为是其多糖含量的增多，使AGS‒EPS具有相对较强的黏性，从而形成致密的堆积体。由图5（c）可知，AS‒EPS 含量为 79.18 mg/g VSS，PS、PN、DNA浓度分别为18.08、46.65、14.70 mg/g VSS。AGS‒EPS总量增至133.63 mg/g VSS，PS、PN、DNA浓度分别为48.21、62.07、23.34 mg/g VSS。

间歇曝气导致短时间内的好氧与厌氧环境快速改变，因此AGS‒EPS分泌量显著增加，以抵抗环境不利变化^[34]。整个驯化培养过程胞外聚合物中的多糖含量从22.83％增至36.01％，EPS中的多糖可黏结絮体，促进污泥颗粒化。内部结构发生的重大变化，可以由上述的微生物多样性分析进行解释，聚糖菌Candidatus_Competibacter和聚磷菌Candidatus Accumulibacter在整个培养过程中的代谢起了重要作用。组分分析结果表明，蛋白质（PN）含量始终高于多糖（PS）含量，较高的PN/PS通过改善微生物表明的疏水性，降低污泥表面电负性能够促进生物膜的形成及结构稳定^[35]。培养过程PN/PS值由AS的2.58降至AGS的1.29，较低的PN/PS会对AGS的稳定造成不利影响，但这一结果与刘前进等^[36]对于AGS培养成功后PN/PS为1.57相接近，本实验出水稳定且指标去除率均较高，证明颗粒污泥培养状况良好。AS的PN/PS值较高，经调查该污水厂承接多个食品工厂的出水，进水COD浓度约为450 mg/L，高于实验模拟废水，证明AS原始的代谢环境具有较高的有机物浓度，因此AS的PN/PS值高于AGS是合理的。经过100 d的培养，随着原始胞外蛋白被代谢、稀释、排出，在污泥细菌的作用下最终出现蛋白质略高于多糖的情况，形成稳定的AGS。

2.3.2 EPS的3D-EEM分析

AGS‒EPS和AGS‒EPS的EPS的3维荧光光谱如图6所示。该图谱有3个明显荧光峰：A（E_x和E_m分别为260～280 nm、320～380 nm）、B（E_x和E_m分别为220～240 nm、320～350 nm）和C（E_x和E_m分别为220～240 nm、290～320 nm）。两类污泥EPS的3维荧光峰基本相似，其中，荧光峰A属于酪氨酸类蛋白质，是AGS形成的重要成分，与微生物活性成正相关^[37]，对于促进絮状污泥颗粒化具有积极作用；峰荧光峰B属于色氨酸类蛋白质，为疏水性物质，其与EPS中芳环氨基酸结构的共同作用对抗应激和蛋白质合成调节有重要作用^[38]。酪氨酸类和色氨酸类蛋白质均属于溶解性微生物代谢产物，AGS‒EPS的这两个荧光峰强均强于AS‒EPS，且出现新的荧光峰C代表芳香族蛋白质，说明驯化过程细胞分泌的蛋白质分解溶解性降低，更加有利于生物膜中微生物细胞凝聚。所以3D-EEM图谱分析结果表明AGS有更高质量的蛋白质。

2.3.3 EPS的FTIR及蛋白质二级结构分析

通过傅里叶红外光谱对二类EPS进行定性分析，结果如图7所示。两种污泥的EPS样品均在波长3 420 cm^-1左右存在宽峰，主要是由醇酚、糖类中的—OH和蛋白质中的N—H伸缩振动所引起的^[39]；2 940 cm^-1左右的非对称峰是由烷烃类有机物和多糖中的—CH₂非对称伸缩振动所致^[40]。1 385～1 400 cm^-1的峰是糖醛酸中的羧酸盐基团^[41]。900～1 160 cm^-1的峰与多糖中的C—O、C—C的伸缩振动有关^[42]，这反映了AGS‒EPS中多糖的种类多于AS，可能是聚糖菌在颗粒化过程中产生了大量的其他糖原，致使AGS‒EPS的结构产生变化。波长<900 cm^-1的区域为指纹区域，证明了硫、磷基团的存在。傅里叶红外光谱分析证明二类EPS都具有大量的官能团，总体结构相似，而多糖种类存在差异。

蛋白质二级结构影响微生物的聚集性能、吸附性能和生物膜的形成过程^[43]，酰胺I（1 600～1 700 cm^-1）、酰胺Ⅱ（1 500～1 600 cm^-1）和酰胺Ⅲ（1 200～1 300 cm^-1）处波长主要与蛋白质变化相关，FTIR图谱显示酰胺I可测得的信号最强，因该波段与细胞聚集性高度相关，且两类EPS的红外光谱差异不明显，所以通过拟合酰胺I的已知峰获得蛋白质二级结构。酰胺I区包括β-折叠（β-sheet，1 600~1 636 cm^-1）、无规则卷曲（Random coil，1 636～1 645 cm^-1）、α-螺旋（α-helix，1 646～1 660 cm^-1）、β-转角（β-Turn helix，1 660～1 680 cm^-1）、反向β-折叠（Antiparallel β-sheet，1 680～1 700 cm^-1）5种结构^[44]。拟合结果见表3、图8。有利结构β-sheet在两类EPS蛋白质二级结构中均含量均最高，是一种能够提供较多疏水位点的扭曲片状结构，可以促进疏水位点的暴露以及细胞间的聚集，β-折叠占比从24.19%增长至30.53%，细胞的聚集性有所强化；α-螺旋被认为具有一定的刚性，是决定污泥絮凝性的关键结构^[45]，颗粒化后EPS中该结构含量占比有少量增长，表明其机械强度略微有些增长；β-转角也有微量增长，更有利于吸附污水中的重金属等污染物。AS‒EPS和AGS‒EPS的不利结构（无规则卷曲、反向β-折叠）分别占比34.20%、27.03%，它们对污泥的聚集起负面作用^[46]。两组样品中α-螺旋/（β-折叠+无规则卷曲）的比值分别为0.48、0.50，这个比值常被用于分析疏水基团的结构，比值越高表示结构越致密，相对致密的蛋白质有助于电子传递并保护微生物免受损害^[47]。以上结果表明，两类EPS结构相似，但蛋白质二级结构含量百分比证明，颗粒化培养确实能够能增强污泥细胞的聚集性、机械强度、蛋白质致密程度。

2.4 EPS对Cd²⁺ 吸附实验

2.4.1 吸附动力学

通过吸附实验拟合拟1级、拟2级动力学模型，研究EPS对Cd²⁺的吸附机理。

拟1级动力学模型为：

\mathrm{l}\mathrm{g}(q_{\mathrm{e}}-q_t)=\mathrm{l}\mathrm{g}{q}_{\mathrm{e}}-\frac{k_{\mathrm{1}}}{\mathrm{2.303}}t（1）

拟2级动力学模型为：

\frac{t}{q_t}=\frac{\mathrm{1}}{k_{\mathrm{2}}{q}_{\mathrm{e}}^{\mathrm{2}}}+\frac{\mathrm{1}}{q_{\mathrm{e}}}t（2）

式（1）~（2）中：t为吸附时间，min；q_e和q_t 分别为平衡时和t时的吸附量，mg/g；k₁为拟1级速率常数，min^-1；k₂为拟2级速率常数，g/mg/min。

两种动力学模型拟合结果见表4、图9。表4中，q_e,exp和q_e,cal分别为实验和计算所得平衡吸附容量。对于AS‒EPS，拟1、2级动力学模型都可以较好地拟合实验数据（R{}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{2}}、R{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}}>0.95），拟1级动力学模型效果略好，说明AS‒EPS对于Cd²⁺的吸附同时存在物理、化学吸附。与AGS‒EPS相比，AS‒EPS对Cd²⁺的物理吸附效果强于AGS‒EPS，这可能是因为AS‒EPS的结构孔洞较多（图5（a）），相比之下易形成物理吸附。对于AGS‒EPS，拟2级动力学模型的R{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}}>0.99，该实验数据能够较好地用拟2级动力学模型来拟合，说明AGS‒EPS对于Cd²⁺的吸附过程属于化学吸附，证明在吸附过程中，AGS‒EPS内官能团积极地与Cd²⁺的进行离子交换^[18]。AGS‒EPS处理污废水中的Cd²⁺具有更强的生物化学属性。

2.4.2 吸附热力学

平衡吸附容量是从吸附等温线中可得到的重要参数，分别采用Langmuir模型（式（3））和Freundlich模型（式（4））对EPS吸附Cd²⁺实验数据进行拟合：

q_{\mathrm{e}}=\frac{K_{\mathrm{L}}{q}_t{C}_{\mathrm{e}}}{\mathrm{1}+K_{\mathrm{L}}{C}_{\mathrm{e}}}（3）

q_{\mathrm{e}}=K_{\mathrm{F}}{C}_{\mathrm{e}}^{\mathrm{1}/n}（4）

式（3）~（4）中：C_e为平衡时Cd²⁺浓度，mg/L；K_L为热力学Langmuir常数，L/g；K_F为Freundlich常数，mg/g；n为与吸附容量和吸附速率有关的系数。

两种热力学模型拟合结果见表5、图10。由表5及图10可知：1）两种EPS拟合结果较为相似且相关系数R{}_{\mathrm{L}}^{\mathrm{2}}均大于R{}_{\mathrm{F}}^{\mathrm{2}}，说明与Freundlich相比，Langmuir模型能够更全面准确地描述两种EPS吸附Cd²⁺过程；2）Langmuir模型计算的吸附量更接近真实吸附量，也说明EPS对于Cd²⁺的吸附过程为均相单分子层吸附；3）AGS‒EPS对于Cd²⁺的吸附能力强于AS‒EPS，二者理论最大吸附容量（Q_max）分别为617.09、542.90 mg/g；4）Langmuir模型拟合计算得到的K_L能够表示吸附亲和力^[48]，两类EPS的K_L均在0～1之间，表明有利于吸附进行。

3 结 论

1）在絮状活性污泥驯化成颗粒污泥的完整过程中，在高磷环境中增加有机质含量，能够增强污泥的除磷性能，对于污泥颗粒化的培养有积极作用。

2）16s rRNA基因高通量测序结果表明：门水平中，Chloroflexi可能是颗粒污泥的初始颗粒框架，Proteobacteria是污泥颗粒化的核心菌门；属水平中，聚糖菌Candidatus_Competibacter和聚磷菌Candidatus Accumulibacter是污泥颗粒化的核心菌群，Candidatus_Competibacter能够将VFAs储存为PHAs，在好氧阶段氧化PHAs，合成糖原；Candidatus Accumulibacte厌氧条件下积累的细胞内碳和能量源吸收正磷酸盐并合成细胞内多磷酸盐，两种菌属的优势增殖加快了污泥化进程。

3）研究两种污泥的胞外聚合物，EPS总含量从79.18 mg/g VSS增长至133.63 mg/g VSS。3D-EEM证实AGS‒EPS含有更高水平的蛋白质，驯化过程细胞分泌的蛋白质分解溶解性降低，更加有利于生物膜中微生物细胞凝聚。FTIR分析表明两类EPS均含有醇酚、糖类中的—OH、—CH、C—O、C—C，糖醛酸中的羧酸盐基团，蛋白质中的N—H，烷烃类有机物，而AGS‒EPS具有比AS‒EPS更多的多糖种类。蛋白质二级结构分析结果表明，培养过程β-折叠从占比24.19%增长至30.53%，不利结构（无规则卷曲、反向β-折叠）含量从34.20%降低至27.03%，证明污泥细胞的聚集性有所强化，β-转角也有微量增长，更有利于吸附污水中的重金属等污染物。

4）吸附动力学结果分析表明，AS‒EPS的吸附过程则同时存在物理和化学吸附，AGS‒EPS对Cd²⁺吸附以化学吸附为主。吸附热力学结果分析表明，两种EPS对于Cd²⁺的吸附过程为均相单分子层吸附，而AGS-EPS的吸附能力强于AS‒EPS，理论最大吸附容量为617.09 mg/g。基于以上结果，认为AGS‒EPS对于污水中重金属的吸附具有更大潜力。

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基金资助

国家自然科学基金项目(52370021)

安徽省住房城乡建设科学技术计划项目（2023‒RK025）

安徽省教育厅研究生质量工程项目(2022jyjxggyj314)