基于TurboID邻近蛋白标记技术鉴定细胞内Smad3相互作用网络

Identification of Intracellular Smad3 Interaction Networks via TurboID Proximity Labeling Technology

摘要

目的 利用生物素标记酶TurboID介导的邻近标记技术,筛选并构建转录因子Smad3的活性调控网络。方法 构建一个含有Smad3和TurboID基因序列的诱导型表达质粒,并通过慢病毒介导的转染方法将其导入Smad3敲除的肾小管上皮细胞TCMK1中,形成过表达的稳定转染细胞系。在建立稳定转染细胞系的基础上,首先确定了适合的生物素标记浓度和时间,随后进行了生物素标记实验。通过链霉亲和素磁珠对带有生物素标记的蛋白复合物进行富集和纯化,随后进行蛋白质谱分析,并筛选出与Smad3相互作用的候选蛋白。结果 在Smad3敲除的肾小管上皮细胞TCMK1中成功构建了Smad3-TurboID诱导型过表达稳转细胞株。经过生物素标记实验优化,最终确定的生物素浓度和标记时间为25 μm和20 min。质谱结果分析筛选出一系列潜在和Smad3相互作为候选蛋白,例如Yap1和Stat3。结论 结合生物素标记酶TurboID介导的邻近标记技术,本研究成功地鉴定了大量可能与Smad3相互作用的候选蛋白。这些发现为后续深入研究Smad3蛋白的功能及其在细胞内的调控网络提供了理论基础。通过这些互作蛋白的识别和功能分析,将有助于更全面地理解Smad3的生物学作用。

Abstract

Objective This study aimed to utilize biotin-based proximity labeling mediated by the TurboID enzyme to map the activity regulation network of the transcription factor Smad3. Methods This study constructed an inducible expression plasmid containing Smad3 and TurboID gene sequences， and integrated it into Smad3 knockout renal tubular epithelial cells （TCMK1） via lentivirus-mediated transfection， forming an overexpressed stable transgenic cell line. Upon stabilizing the transduction， the research team optimized the biotin labeling concentration and duration before conducting the biotin-labeling experiments. Biotinylated protein complexes were enriched and purified using streptavidin magnetic beads， followed by proteomic analysis to identify candidate proteins interacting with Smad3. Results A Smad3-TurboID inducible overexpressed stable cell line was successfully constructed in Smad3 knockout TCMK1 cells. The optimal biotin concentration and labeling duration were established at 25 μm and 20 minutes， respectively. Proteomic analysis filtered out a series of potential Smad3 interacting candidate proteins， examples include Yap1 and Stat3. Conclusion Employing TurboID-mediated proximity labeling， this study successfully identified numerous candidate proteins that potentially interact with Smad3. These discoveries provided a solid foundation for future in-depth research into the functions of Smad3 protein and its regulatory network within the cell. Identification and functional analysis of these interacting proteins will lead to a more comprehensive understanding of the biological roles ofSmad3.

关键词

邻近标记 / 高效蛋白质鉴定技术 / 母细胞分化蛋白3 / 肾小管上皮细胞

Key words

Proximity Labeling / Turbo identification of interacting proteins（TurboID） / Mothers against decapentaplegic homolog 3（Smad3） / Renal tubular epithelial cells

肾脏炎症和纤维化是急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）和慢性肾病（chronic kidney disease, CKD）的关键病理特征，它们直接导致肾脏功能的持续退化^[1]。在这些病理过程中，TGF-β/Smad信号通路扮演着重要角色，而Smad3则是该通路中的关键效应因子^[2]。研究表明，Smad3不仅可被TGF-β1激活，还可响应多种疾病条件下的应激分子如血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ）、晚期糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）和C反应蛋白（C-reactive protein, CRP），从而参与肾脏炎症与纤维化的调控。此外，Smad3能与其他信号通路如ERK/p38 MAPK和NF-κB相互作用，共同调控肾脏的炎症反应和纤维化进程^[3]。这些研究揭示了Smad3在肾病发病机制中的多重作用，提示其在肾脏疾病治疗中的潜在价值。目前关于Smad3的研究多集中于其转录调节功能，对其在蛋白质相互作用的网络中的角色探究相对较少。因此，深入研究其蛋白调控网络对于全面理解Smad3功能及与疾病相关性具有重要价值。

在传统的蛋白质相互作用研究中，免疫共沉淀法在捕获蛋白间微弱或瞬时相互作用方面存在一定的局限性，且常常脱离蛋白质自然状态，可能导致许多重要的相互作用被遗漏^[4]。为了克服这些限制，邻近蛋白质标记方法如TurboID近来被广泛应用于细胞内蛋白复合物组成的解析，并成为传统免疫共沉淀法的有力补充^[5]。TurboID是一种经过定向进化优化的工程生物素连接酶，相较于传统的如BioID等生物素连接酶，其展现出更高的活性和时间分辨率，拓宽了其在体内应用的可能性^[6]。此外，TurboID技术在标记蛋白质相互作用时不仅显示出强大的催化效率和动力学优势，而且不引入任何细胞毒性^[7]。本研究将利用该技术探索Smad3的潜在结合蛋白，以进一步探讨其在病理状态下的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

293FT细胞和肾小管上皮细胞（TCMK1）分别由美国Thermo公司和湖南丰晖生物科技有限公司提供。Smad3 knockout（Smad3 KO）TCMK1细胞系由本课题组在前期实验中构建^[8]。高保真PCR扩增酶和无缝克隆试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技公司。胶回收试剂盒由北京天根生化科技有限公司供应。限制性内切酶XbaI和Lipofectamine 2000由美国Thermo公司提供。链霉亲和素磁珠，HRP标记链霉亲和素，盐酸多西环素（doxycycline）和灭瘟素S（blasticidin S HCL, BSD）由碧云天生物有限公司提供。胎牛血清和DMEM高糖培养基均购自美国Gibco公司。

1.2 TurboID-Smad3诱导型慢病毒载体的构建

以pcDNA3.1-V5-TurboID-NES（Addgene目录号：Cat#107 169）质粒序列为模板，将该序列经过密码子优化后，委托北京擎科公司合成TurboID序列，并将其克隆到诱导型慢病毒载体Teton-BSD中，从而构建Teton-TurboID-linker-HA序列。进一步将该序列经XbaⅠ酶切消化处理，获得线性化质粒。在此基础上，设计特异性引物进行PCR扩增（PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 7 min），并通过胶回收方法获得小鼠Smad3蛋白质编码序列。设计引物上游序列为5'-TACGTCATAAGGGTATCTAGAA GACACACTGGAACAGCGGATG-3'，下游序列为5'-G GAGGAGGATCTGGTATGTCGTCCATCCTGCCCTT-3'。最后，将经XbaⅠ酶消化的Teton-turboid-linker-HA线性化质粒与Smad3 DNA序列通过同源重组技术结合，并转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞中进行扩增。收集细胞后提取质粒，并对其进行二次测序确认序列的正确性。

1.3 慢病毒包装，感染与筛选

1.3.1 包装病毒，获得具有感染能力的慢病毒

将经过测序验证无误的Teton-TurboID-linker-Smad3-HA和Teton-TurboID-linker-HA慢病毒质粒，以及病毒包装辅助质粒PSPAX2和PMD2.0 G以4:3:1的比例混合。然后利用Lipofectamine 2000转染试剂，将其共同转染至293FT细胞中。细胞培养约48 ~ 72 h后，收集富含病毒的培养上清液，1 500 rpm离心5 min去除细胞及细胞碎片后，上清经0.45 μm滤膜过滤后置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 感染细胞，筛选获得稳转株

培养小鼠Smad3 KO TCMK1细胞，加入具有感染能力慢病毒上清液至培养基中，继续培养24 ~ 48 h后，添加终浓度为25 μg/mL的BSD筛选24 h以去除未感染成功的细胞。随后继续培养，以获得稳定感染病毒的细胞株。最后将筛选获得的细胞株冻存，并保存在-80 ℃以备后用。

1.4 生物素含量与标记时间筛选

考虑到TurboID酶高活性可能导致的非特异性标记问题^[9]，本研究团队对添加生物素的浓度及标记时间进行详细优化，具体操作步骤如下：首先将稳定感染慢病毒的TCMK1细胞接种到12孔板中并培养过夜。次日，加入终浓度为5 ng/mL的盐酸多西环素处理24 h，以诱导TurboID以及TurboID与Smad3融合蛋白的表达。24 h后，根据需要添加5 ~ 500μm生物素进行30 min的标记，或者以50 μm生物素进行5 min至4 h的不同时间标记。标记完成后，立即将细胞置于冰上停止反应，并使用预冷的PBS清洗3次，最后提取细胞蛋白进行western blot分析以鉴定蛋白表达。

1.5 磁珠富集与质谱检测

在确定生物素标记的最佳时间之后，将细胞培养于10 cm培养皿中并进行标记。标记完成后，使用RIPA裂解液处理，以提取细胞总蛋白。随后利用链霉亲和素磁珠对蛋白进行过夜富集。次日，先用RIPA 裂解液重复洗涤3次，然后使用1 M KCL、0.1 M NaHCO₃和2 M Urea进行1次洗涤，最后再用RIPA裂解液洗涤2次，以此去除非特异性结合。之后，重新将链霉亲和素磁珠悬浮于50 μL SDT buffer中，并在95 ℃下煮沸20 min。使用磁力架分离磁珠，并将上清液转移至新的1.5 mL EP管中。样品质谱分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

2 结果

2.1 诱导型慢病毒载体的构建

制备了Teton-TurboID-linker-HA空白载体，方法如图1所示。随后，通过对该载体进行XbaI酶切处理并利用同源重组技术^[10]，有效地将其与Smad3 DNA序列结合，从而制备出Teton-TurboID-linker-Smad3-HA诱导型慢病毒载体。

2.2 多西环素可有效诱导TurboID与目的蛋白在细胞内的融合表达

在没有诱导剂多西环素的条件下，利用HA抗体对融合蛋白进行检测时，未能检测到TurboID-linker-Smad3-HA融合蛋白的存在。然而，随着多西环素浓度的增加，融合蛋白在细胞中的表达量呈现明显的剂量依赖性增加（图2A）。研究显示，仅需10 ng/mL的多西环素即可有效诱导TurboID-linker-Smad3-HA融合蛋白的表达。基于这一发现，将其作为后续研究的诱导浓度。

进一步使用Smad3抗体进行表达检测，结果显示，TurboID-linker-HA稳定转化株中未检测到Smad3的表达；而TurboID-linker-Smad3-HA稳定转化株中能够探测到TurboID-linker-Smad3-HA融合蛋白的存在。这一结果表明，Smad3 KO TCMK1细胞中成功建立了TurboID-linker-Smad3-HA的稳定转化株，见图2B。

2.3 TurboID系统可对目的蛋白及其邻近的蛋白分子有效标记生物素

为降低由于酶活性过高导致的非特异性背景标记，研究进行了系统优化，特别是调节了生物素的浓度和反应时间。在TurboID-linker-Smad3-HA稳定表达细胞株中，探究不同生物素浓度5 ~ 500μm和孵育时间5 ~ 240min对Teton-TurboID-linker-Smad3-HA以及Teton-TurboID-linker-HA融合蛋白生物素标记效率的影响。如图3所示，随着生物素浓度和作用时间的增加，细胞内标记的生物素化蛋白也随之增多。当生物素浓度为25 μm、反应时间为20 min时，获得了最佳的标记效果，因此选定此条件进行后续实验。

2.4 质谱结果分析

有待进一步鉴定的蛋白质网络如表1 所示。本研究识别并分析了已报道的，与Smad3直接相互作用的几种蛋白质，包括Yap1和Stat3^[11]。这不仅确认了之前的研究结果，也为这些蛋白质在Smad3介导的信号传导过程中的角色提供了新的见解。蛋白质组学质谱图如图4A所示，蛋白-蛋白相互作用图如图4B所示。

3 讨论

在生物学领域理解生物大分子间的相互作用，尤其是蛋白-蛋白相互作用，对于解码生命过程中的复杂网络至关重要^[12]。这些相互作用不仅在维持细胞内稳态中发挥着中心作用，也是许多疾病发生和进展的关键^[13]。因此，发展和优化能够精确捕捉这些蛋白质相互作用的技术，对于推动生物医学研究和疾病治疗策略的发展具有不可估量的价值^[14]。传统的蛋白质相互作用分析方法，如亲和纯化质谱（AP/IP-MS）和酵母双杂交系统，提供了宝贵的数据，但它们在捕捉短暂和微弱相互作用方面的局限性也逐渐凸显^[15]，这在很大程度上限制了对蛋白质复杂行为的全面理解^[16]。

邻近标记技术的发展代表了生物分子研究领域的一次重要进步。这些技术，特别是APEX2和BioID，为揭示细胞内部复杂的分子相互作用网络提供了新的视角^[17-18]。它们能够在细胞活体环境中捕捉瞬时和弱相互作用，从而提供了前所未有的细节和动态信息^[19]。其中，TurboID技术作为最新进展，以其卓越的催化效率和操作简便性受到关注^[20-21]。TurboID基于生物素连接酶BirA的突变体，通过酵母展示工程的定向进化技术获得，集成了前代技术的优点，并在效率和细胞兼容性上作出了显著提升^[22-23]。本研究成功开发了一个融合表达TurboID和目标蛋白的病毒载体系统。与先前研究相似，本研究发现仅需对细胞进行短暂的生物素处理，就能在TCMK1细胞内观察到大量生物素标记的蛋白质。本系统对于初始的TurboID技术进行了两项显著改进。首先，引入了Teton诱导性慢病毒系统，大幅降低了组成性表达可能导致的高背景和非特异性标记。为了增强特异性，研究不仅在Smad3敲除细胞系中实现了TurboID-linker-Smad3-HA融合蛋白的过表达，避免了与内源性目标蛋白的竞争，还细致地调整了表达时间，有效控制了过长标记时间可能引发的非特异性结合。其次，通过在TurboID序列和Smad3之间引入GGGSGGGSG柔性氨基酸链，在保持了TurboID生物活性的同时减少了融合表达的空间阻碍。这些整体改进极大地增强了系统首次在活细胞中对Smad3进行近邻空间标记组学研究时的特异性和效率，揭示了其潜在的蛋白-蛋白相互作用，并为进一步的生物学功能研究打下了坚实基础。通过质谱分析，不仅确认了一些已知的目标蛋白，如Stat3、Yap1等，也发现了许多尚未鉴定的蛋白质，为未来的研究提供了新的线索。在后续工作中，将结合免疫共沉淀、GST pulldown等传统蛋白质互作技术，以进一步验证和细化这些发现，深入探究这些蛋白质的功能和相互作用网络^[24]。

4 结论与展望

本研究经过引入和优化TurboID融合技术，显著提升了蛋白-蛋白相互作用检测的灵敏度和特异性。该技术在降低非特异性背景和提高分子相互作用网络分析准确性方面具备明显优势。尤其是在活细胞中，通过近邻空间标记组学研究发现了一系列潜在的相互作用蛋白，为理解Smad3的功能和相互作用网络提供了重要信息。下一步计划深入研究这些新发现的相互作用蛋白，并探索它们在生物学过程中的作用。同时将继续优化TurboID技术，以提高其应用范围和效率，尤其是在研究细胞信号传导和疾病机理方面。此外，结合高精度质谱分析，预计将能够为蛋白质组学和疾病研究提供更全面和深入的洞见。通过这些研究，期望为蛋白质相互作用的生物医学研究及其在临床治疗中的应用提供坚实的理论和实验基础。

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基金资助

国家自然科学基金青年项目(82104665)

四川省科技计划项目(2023NSFSC1763)

国家级大学生创新创业项目(202310632067)